SPARCL1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用研究

程 煦,陳心嚴(yán),陳婷婷,程筱雯,朱華慶,葛圣林

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)及其引起的一系列并發(fā)癥是目前心血管疾病的主要致病因素,持續(xù)威脅人類(lèi)健康[1]。AS被認(rèn)為是一種慢性炎癥狀態(tài),是由于血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞的不受控增殖所引起的[2-3]。目前,內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙被認(rèn)為是AS的啟動(dòng)和加重的重要因素[4]。

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白類(lèi)似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteines like 1,SPARCL1)也被稱(chēng)作Hevin、SC1以及ECM2,隸屬于SPARC家族(參與細(xì)胞黏附、遷移和增殖調(diào)節(jié)的細(xì)胞基質(zhì)蛋白家族)[5]。SPARCL1廣泛表達(dá)于人體的各個(gè)組織中,但在如前列腺癌、非小細(xì)胞癌、卵巢癌以及結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)[6],提示SPARCL1基因可能是一種潛在的腫瘤抑制基因。通過(guò)對(duì)人類(lèi)主動(dòng)脈硬化病變的外周血白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析[7],以及對(duì)人AS斑塊的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究[8],SPARCL1已被視為與AS有關(guān)的新的候選基因,并且確定了SPARCL1在AS組織中的表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn),SPARCL1在AS斑塊中的表達(dá)增高[9]。然而SPARCL1參與AS的具體過(guò)程和作用尚不清楚。該研究旨在探討SPARCL1在AS斑塊形成中的作用,以期為深入探尋AS發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及有效的早期診療分子標(biāo)志物提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 研究對(duì)象來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2022年3月—2023年2月收治的394例已經(jīng)過(guò)臨床確診為AS的患者。對(duì)照組來(lái)自于同時(shí)期年齡、性別匹配的394例健康對(duì)照人群,已排除心腦血管疾病,且無(wú)其他顯著疾病。免疫組織化學(xué)的組織切片來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理中心的臨床動(dòng)脈組織標(biāo)本。本研究所選取的樣本均來(lái)自安徽省。

1.1.2主要材料 人SPARCL1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海江萊生物科技有限公司,貨號(hào):0-001493);DNA提取試劑盒、蛋白裂解液、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(山東思科捷生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):AA0902-A、EA0003、AC0202-A、AG0401、AH0301);DAB顯色液、通用型二抗、枸櫞酸抗原修復(fù)粉末(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):PV-6002、SAP9100、ZLI-9066);蘇木精(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C0105S);3%過(guò)氧化氫(H2O2)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,貨號(hào):BLK-0001);多克隆抗 SPARCL1抗體(武漢三鷹技術(shù)有限公司,貨號(hào):13517-1-AP);人外周血單核細(xì)胞分離液、人外周血中性粒細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):P8680、P9040);高糖DMEM、小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1(武漢普諾賽生物科技有限公司,貨號(hào):PM150210、CL-0370);胎牛血清(南京維森特生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):085-150);BCA定量試劑盒(美國(guó)Thermofisher Scientific 公司,貨號(hào):23225);ECL反應(yīng)液(成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司,貨號(hào):17064);PMSF(北京金克隆生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):CS3215);蛋白Marker(上海生工生物工程有限公司,貨號(hào):C600526);過(guò)表達(dá)質(zhì)粒:pENTR-CMV-MCS-EF1a-copGFP質(zhì)粒(貨號(hào):LM1479,上海聯(lián)邁生物工程有限公司);shRNA質(zhì)粒:pENTR-U6-CMV-EGFP質(zhì)粒(貨號(hào):NTCC510825,上海西圖生物科技有限公司)

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(型號(hào):A51119700DPC);恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào):51023126);NanoDrop one 微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(型號(hào):ND-LITE-PR)(美國(guó)Thermofisher Scientific 公司);大容量臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN公司,型號(hào):369003);正置顯微鏡(德國(guó)Leica公司,型號(hào):DM2700-M);熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司,型號(hào):Roche LightCycler96)

1.2 方法

1.2.1ELISA測(cè)定血清SPARCL1表達(dá)水平 所有實(shí)驗(yàn)操作均按照SPARCL1酶聯(lián)免疫分析試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。酶標(biāo)板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔(3個(gè)復(fù)孔)和空白孔,經(jīng)加樣、加酶、溫育、洗滌等步驟后,在酶標(biāo)儀中讀取吸光度值并計(jì)算各樣品濃度。

1.2.2人外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞分離 采集AS患者及正常對(duì)照人群的新鮮抗凝全血,嚴(yán)格按照人外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,分離出AS患者及正常對(duì)照人群的外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞。

1.2.3Western blot檢測(cè)SPARCL1蛋白表達(dá)情況 采集細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解、離心,得到細(xì)胞蛋白液。隨后使用BCA法對(duì)得到的蛋白液進(jìn)行定量,計(jì)算出各樣品的蛋白濃度,將各樣品濃度調(diào)整相同,經(jīng)過(guò)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及4 ℃孵育一抗(多克隆抗SPARCL1抗體,1∶200)12 h和室溫孵育二抗(通用型二抗,1∶5 000)2 h,最后經(jīng)過(guò)顯影得到SPARCL1的蛋白條帶并拍照記錄。

1.2.4免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)(immunohistonchemistry,IHC)評(píng)估SPARCL1蛋白在AS斑塊區(qū)的表達(dá)水平 將AS斑塊區(qū)組織石蠟切片分別置于二甲苯溶液、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、純水中進(jìn)行脫蠟。隨后在枸櫞酸鈉緩沖液中修復(fù)抗原。加入適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。孵育結(jié)束后用PBS輕微沖洗3次,每次2 min。滴加適量多克隆抗SPARCL1抗體(1∶200)覆蓋全部組織,37 ℃孵育60 min,PBS沖洗3次,滴加通用型二抗,室溫孵育20 min,加入新鮮配置DAB顯色液,室溫孵育6 min,自來(lái)水沖洗后蘇木精復(fù)染20 s。封片、觀察。

1.2.5SPARCL1重組腺病毒包裝及驗(yàn)證 合成SPARCL1 短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)反向互補(bǔ)引物以及SPARCL1 編碼序列(coding sequence,CDS)構(gòu)建目的基因質(zhì)粒,隨后將目的基因序列重組至腺病毒載體,獲得過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)重組腺病毒質(zhì)粒,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,對(duì)獲得的初級(jí)病毒液進(jìn)行擴(kuò)增、純化,得到SPARCL1過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)的重組腺病毒。在6孔板中培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞(J774A.1),待細(xì)胞長(zhǎng)至60%時(shí)將病毒注射入6孔板內(nèi)(每孔5 μl),板內(nèi)設(shè)置空白對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng),分別在24、48 h時(shí)熒光下拍照,觀察轉(zhuǎn)染效率。在60 h時(shí)收集細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白測(cè)量SPARCL1蛋白表達(dá)量并進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPARCL1對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞(J774A.1),待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿后均勻轉(zhuǎn)入細(xì)胞6孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)至60%每孔時(shí)分別于不同孔注入SPARCL1干擾病毒、SPARCL1過(guò)表達(dá)病毒。待細(xì)胞均勻鋪滿(mǎn)6孔板后(約48 h),使用200 μl槍頭垂直于板面在6孔板中劃出直徑約1 mm的直線,PBS清洗6孔板以洗去游離細(xì)胞,加入細(xì)胞專(zhuān)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),在劃痕后的0、12、24 h分別在顯微鏡下拍照記錄每孔劃痕直徑。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般特征及SPARCL1在血清中的表達(dá)情況患者組與對(duì)照組男女所占比例均分別為54.8%及45.2%,平均年齡均為50.02歲。兩組研究對(duì)象的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性,組間具有可比性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,患者組與對(duì)照組的血清SPARCL1濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),即AS患者血清SPARCL1表達(dá)明顯低于正常對(duì)照。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象一般特征及SPARCL1血清濃度的比較

2.2 SPARCL1在AS斑塊中的表達(dá)情況對(duì)AS斑塊病變動(dòng)脈組織免疫組織化學(xué)染色(SPARCL1呈棕黃色),AS患者的粥樣硬化斑塊部位的SPARCL1的表達(dá)量高于鄰近正常動(dòng)脈組織,且主要表達(dá)在泡沫細(xì)胞胞質(zhì)(圖1)。通過(guò)對(duì)比正常動(dòng)脈和病變動(dòng)脈的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),相比于正常對(duì)照人群,AS患者血清中SPARCL1表達(dá)量下降(t=2.97,P<0.05)。

圖1 SPARCL1在AS病變部位(B)以及正常動(dòng)脈組織(A)中表達(dá)的IHC染色圖×200以及免疫組化SPARCL1表達(dá)量對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖(C)

2.3 AS患者外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞SPARCL1蛋白表達(dá)情況AS斑塊部位的成分細(xì)胞主要源于血液中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集,Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,兩組外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞均有SPARCL1表達(dá),并且AS患者的SPARCL1蛋白表達(dá)量均低于對(duì)照組(t=3.05、2.83,均P<0.01)(圖2)。

圖2 兩組細(xì)胞SPARCL1蛋白表達(dá)量的比較

2.4 SPARCL1過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)重組腺病毒的包裝效果驗(yàn)證靶細(xì)胞感染24、48 h后,分別置于熒光顯微鏡下觀察并拍照,可見(jiàn)細(xì)胞中有熒光顯示,且48 h熒光數(shù)量>24 h。說(shuō)明SPARCL1過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)重組腺病毒感染成功(圖3)。隨后培養(yǎng)至60 h提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPARCL1蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示,用SPARCL1過(guò)表達(dá)重組腺病毒感染的J774A.1細(xì)胞可觀察到SPARCL1蛋白表達(dá)水平上升(t=-2.19,P<0.05),用

圖3 腺病毒感染后熒光顯微鏡下拍照 ×20

SPARCL1重組腺病毒感染J774A.1細(xì)胞可觀察到SPARCL1蛋白表達(dá)水平降低(t=2.64,P<0.01),表明SPARCL1過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)重組腺病毒包裝成功(圖4)。

圖4 兩組細(xì)胞感染SPARCL1重組腺病毒后SPARCL1蛋白表達(dá)量的比較

2.5 SPARCL1對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPARCL1抑制表達(dá)組的遷移距離低于對(duì)照組(t=3.12、-2.58,均P<0.05)。這表明SPARCL1參與到了巨噬細(xì)胞的遷移過(guò)程(圖5)。

3 討論

SPARCL1在1990年首次在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),并命名為SC1[5]。隨后又從非小細(xì)胞肺癌的內(nèi)皮細(xì)胞和人扁桃體淋巴組織的高內(nèi)皮小靜脈中克隆了Hevin的基因[10-11]。SPARCL1定位于染色體4q22-25,橫跨約47 kb的基因組。SPARCL1由N端酸性結(jié)構(gòu)域、卵泡抑制劑樣結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞外鈣離子結(jié)合域[9]組成。

目前關(guān)于SPARCL1的研究主要在其與癌癥的關(guān)系,其與AS之間關(guān)系的研究尚少。在以往研究[12]顯示,SPARCL1與血管壁穩(wěn)定的維持有關(guān)。而AS發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一是血管內(nèi)皮功能的障礙,因此SPARCL1可能參與AS發(fā)生過(guò)程。并且既往有學(xué)者[13-15]認(rèn)為AS是一種血管壁的癌癥,它們?cè)谝恍┎±磉^(guò)程中較為相似,如:① AS和癌癥都有不受控制的細(xì)胞增殖[15];② 兩種疾病都有細(xì)胞粘附分子的變化,分別與動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[14];③ 都有相應(yīng)的炎癥表現(xiàn)[13];④ 都與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[13];⑤ 有血管生成和細(xì)胞凋亡。提示SPARCL1有可能作為一種血管保護(hù)因素參與抑制AS的發(fā)生發(fā)展。

在2009年的一個(gè)通過(guò)對(duì)人類(lèi)主動(dòng)脈硬化病變的外周血白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究[7]中,SPARCL1就被視為與AS有關(guān)的新的候選基因。最近,在對(duì)人類(lèi)AS斑塊的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究[8]中顯示,SPARCL1在AS組織中表達(dá)。本研究也顯示SPARCL1在AS斑塊中表達(dá)升高,且 AS患者的血清SPARCL1水平明顯低于正常人,提示SPARCL1很可能參與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

此外,本研究顯示AS患者及正常對(duì)照的外周血中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞均有SPARCL1表達(dá),并且AS患者的表達(dá)量低于健康對(duì)照,免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SPARCL1主要表達(dá)于AS斑塊中的泡沫細(xì)胞,這表明AS斑塊中高表達(dá)SPARCL1可能是由于在AS的炎癥過(guò)程中,將血液中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集至斑塊部位并隨后演變?yōu)榕菽?xì)胞。

SPARCL1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、遷移和增殖的作用[5]。巨噬細(xì)胞在AS發(fā)生中的作用不可忽視,而SPARCL1是否參與了巨噬細(xì)胞在斑塊中的增殖或遷移過(guò)程,對(duì)斑塊形成的影響還需要進(jìn)一步證明。本研究結(jié)果顯示,抑制SPARCL1表達(dá)的巨噬細(xì)胞遷移率降低,該結(jié)果為SPARCL1參與AS的具體過(guò)程提供了研究方向。

綜上所述,本研究證明AS病變部位泡沫細(xì)胞高表達(dá)的SPARCL1有可能來(lái)自于外周血單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的代償性募集,SPARCL1可能作為血管保護(hù)因子參與抑制AS斑塊的發(fā)生發(fā)展。后續(xù)將通過(guò)繼續(xù)完善細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn),建立SPARCL1基因敲除小鼠模型以明確SPARCL1影響AS斑塊形成的具體機(jī)制,探討SPARCL1成為AS診療新靶點(diǎn)的可能性。