美拉德反應(yīng)修飾紫蘇蛋白及其抗氧化活性研究

宋彥顯 李勝強(qiáng) 閔玉濤

摘要：以紫蘇餅粕為原料，采用堿溶酸沉法提取蛋白，以糖為修飾劑，以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)修飾產(chǎn)物工藝，研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，在料液比1∶12、堿溶pH 9.0、 50 ℃、溶解40 min、酸沉pH 4.4條件下，提取的紫蘇蛋白純度達(dá)69.9%。單因素實(shí)驗(yàn)制備糖-紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最適工藝為最適糖種類為木糖、紫蘇蛋白于100 ℃加熱4 h，紫蘇蛋白與木糖最適質(zhì)量比15∶1，初始pH 9.0。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示各因素對抗氧化能力影響的主次順序?yàn)槠鹗紁H值＞紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比＞反應(yīng)時(shí)間；結(jié)合實(shí)際，其最佳工藝為初始pH 8.2、反應(yīng)時(shí)間4.85 h、紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比15∶1，此時(shí)對DPPH自由基的清除率達(dá)55.3%，與預(yù)測值54.18%接近，紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有較好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：紫蘇蛋白;美拉德反應(yīng);抗氧化活性;響應(yīng)面分析法

中圖分類號：TS201.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0095-07

Modification of Perilla Protein by Maillard Reaction and Its Antioxidant Activity

Abstract： With perilla seed meal as the raw material， protein is extracted by alkali-extraction and acid-precipitation method. With sugar as the modifier and DPPH free radical scavenging rate as the investigation index， single factor experiment and response surface analysis method are used to optimize the preparation process of perilla protein product modified by Maillard reaction and their antioxidant activity is studied. The results show that the purity of extracted perilla protein reaches 69.9% when the solid-liquid ratio is 1∶12， the alkali-extraction pH is 9.0， 50 ℃， dissolution time is 40 min， and acid precipitation pH is 4.4. The optimal process for preparing sugar-perilla protein Maillard reaction products by single factor experiment is as follows： the optimal sugar type is xylose， perilla protein is heated at 100 ℃ for 4 h， the optimal mass ratio of perilla protein to xylose is 15∶1， and the initial pH is 9.0. Response surface optimization results show that the primary and secondary order of the effects of the factors on the antioxidant capacity is initial pH value>the mass ratio of perilla protein to xylose>reaction time. Combined with the actual conditions， the optimal process is initial pH of 8.2， reaction time of 4.85 h and the mass ratio of perilla protein to xylose of 15∶1， at this time， the DPPH free radical scavenging rate reaches 55.3%， close to the predicted value of 54.18%. Perilla protein Maillard reaction products have good antioxidant activity.

Key words： perilla protein; Maillard reaction; antioxidant activity; response surface analysis method

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt.]是唇形科紫蘇屬一年生直立草本藥食同源植物，又名白蘇、荏子、香蘇等，在我國已有2 000多年的種植和食用歷史[1]。紫蘇適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，生長速度快，分布范圍廣，在我國大部分地區(qū)以及東南亞、美國、俄羅斯等地均有種植[2]。紫蘇含有多糖、黃酮、多酚、多種人體必需的微量元素、α-亞麻酸和ε-3脂肪酸等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、消炎和抑制黑色素生成等生物活性[3-9]。紫蘇渾身是寶，營養(yǎng)豐富，葉、莖和籽均可入食，其香味濃郁宜人，常用于食品調(diào)味，也可用于油用、香料和藥用等。盡管紫蘇種植起源于我國，但我國對紫蘇的研究和開發(fā)利用落后于美國和俄羅斯等國家，以低級油制產(chǎn)品為主，精深加工技術(shù)極度缺乏，產(chǎn)品開發(fā)系統(tǒng)性和競爭力亟待提升。

紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，蛋白含量可達(dá)32.33％，含有18種氨基酸，包括8種人體必需的氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的植物全蛋白資源，在蛋白食品的功能開發(fā)方面具有較廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。紫蘇粕長期以來主要用于動(dòng)物飼料或還田作農(nóng)肥，不僅造成蛋白資源的浪費(fèi)，而且污染了環(huán)境，因此，有效利用紫蘇粕資源、開發(fā)紫蘇蛋白產(chǎn)品十分必要。

蛋白質(zhì)中含有多種氨基酸，能與還原糖發(fā)生多種氨基酸-糖模型體系的美拉德反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物能使自由基鏈斷裂，從而具有清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧自由基和體外螯合鐵的功能。林曉彤等[12]采用美拉德反應(yīng)改性蝦殼蛋白質(zhì)，制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的還原能力，約為58 μmol Trolox 當(dāng)量/g。董燁等[13]發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)顯著提高了鳙魚皮水解物的抗氧化活性，核糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性最高。黃建蓉等[14]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率與濃度具有良好的量效關(guān)系。丁小強(qiáng)等[15]利用魚糜漂洗液回收的蛋白酶解物與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明其羥基自由基清除能力顯著提高，ABTS自由基清除能力和還原力也有所提高。諸多研究表明，蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)修飾產(chǎn)物可顯著提高抗氧化能力，是蛋白天然抗氧化劑開發(fā)的方向之一。

目前，紫蘇粕的研究主要聚焦在蛋白的提取制備、結(jié)構(gòu)和功能特性以及制備抗氧化肽、鮮味肽、抗菌肽。Kim等[16]研究了不同蛋白水解酶對紫蘇籽粕蛋白水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)和生物活性的影響。Zhao等[17]從油籽殘?jiān)刑崛〉淖咸K分離蛋白具有良好的功能性能，可作為潛在的食品級乳化劑用于皮克林乳化劑的制備。王麗娜等[18]利用紫蘇蛋白結(jié)合其他蛋白制作植物蛋白產(chǎn)品，使產(chǎn)品具有香味，提高產(chǎn)品的口感、風(fēng)味、色澤和組織化程度。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)紫蘇粉蛋白水解后可得到具有較高抗氧化活性的多肽。姜文鑫等[20]制備紫蘇抗菌肽，發(fā)現(xiàn)其對沙門桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用。目前，關(guān)于紫蘇粕蛋白美拉德反應(yīng)修飾產(chǎn)物的抗氧化活性的報(bào)道尚不多見。

本文以紫蘇餅粕為原料提取蛋白，以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)修飾產(chǎn)物制備工藝，研究其抗氧化活性，為天然抗氧化劑的開發(fā)和紫蘇餅粕蛋白基功能性食品的研究提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫蘇粕：天津?qū)毷靠萍加邢薰荆鞍缀?5%；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；D-木糖（分析純）：惠興生化試劑有限公司；D-果糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市正基儀器有限公司；80-3大容量離心機(jī) 江蘇金壇市中大儀器廠；UV-1800PC-DS2紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA2204B電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10C冷凍干燥機(jī) 四環(huán)科儀科技發(fā)展河北有限責(zé)任公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FT-IR紅外分光光度計(jì) PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇粕蛋白質(zhì)的提取與濃度的測定

1.3.1.1 堿溶酸沉法提取紫蘇蛋白

取紫蘇粕粉末于燒杯中，加適量石油醚，不時(shí)攪拌，期間換石油醚溶液一次，萃取24 h，萃取脫去紫蘇粕中脂肪，下層的固體于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥備用。準(zhǔn)確稱取500 g干燥后的紫蘇粕粉末于燒杯中，按料液比為1∶12加入蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0， 50 ℃，堿溶40 min，期間不時(shí)攪拌。然后以6 000 r/min離心20 min，取上清液，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.4（紫蘇蛋白的等電點(diǎn)），沉淀蛋白，再次離心，取下層固體即為紫蘇蛋白，將紫蘇蛋白冷凍干燥，干燥后在冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別吸取0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，再用蒸餾水補(bǔ)至2 mL，用0 mL管作為調(diào)零管，再分別加入10 mL考馬斯亮藍(lán)試劑迅速混勻，反應(yīng)10 min后在595 nm處測吸光值。以吸光值（Abs）為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。

1.3.1.3 紫蘇粕蛋白質(zhì)提取液濃度的測定

配制1 mg/mL的樣品溶液，吸取1 mL樣品溶液于比色管中，快速加入考馬斯亮藍(lán)5 mL，混勻，室溫下反應(yīng)5 min，在595 nm處測吸光值。按照公式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度（%）=CD/W×100%。（1）

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣品中蛋白質(zhì)濃度，μg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，μg。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照鄭志強(qiáng)等[21]的方法并略作調(diào)整。3 mL蒸餾水加3 mL無水乙醇為調(diào)零，將3 mL稀釋后的樣品溶液添加到3 mL 200 μmol/L DPPH自由基溶液中，振蕩混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光值，按照公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：A1為3 mL DPPH自由基溶液加3 mL蒸餾水在517 nm處的吸光值；A2 為3 mL樣品溶液加3 mL DPPH自由基溶液在517 nm處的吸光值；A3為3 mL樣品溶液加3 mL無水乙醇在517 nm處的吸光值。

1.3.3 紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備及單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

分別取一定量木糖和紫蘇蛋白樣品于25 mL具塞試管中，加入蒸餾水至刻度，調(diào)節(jié)pH至9.0，使紫蘇蛋白全部溶解，用試管夾固定在水浴鍋上，于水浴鍋中加熱進(jìn)行美拉德反應(yīng)，加熱一定時(shí)間，取一定量樣品于試管中，將試管在冰水中進(jìn)行冷卻，終止反應(yīng)，所得產(chǎn)物即為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.3.2 不同糖對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

按照紫蘇蛋白與糖的質(zhì)量比為1∶1稱取22.5 mg紫蘇蛋白樣品與等質(zhì)量葡萄糖、果糖、木糖分別于3支具塞試管中，加入蒸餾水至25 mL，調(diào)節(jié)pH至9.0，溶解蛋白。加固試管塞，于 90 ℃恒溫水浴加熱。分別在反應(yīng)0，1，2，3，4，5，6 h時(shí)取1 mL樣品于試管中，將試管放在冰水中冷卻，終止反應(yīng)。再分別加入10 mL蒸餾水稀釋，即為樣品溶液。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定葡萄糖、果糖、木糖與紫蘇蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)的最適糖種類和最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3.3 不同溫度對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

按照紫蘇蛋白與糖的質(zhì)量比為1∶1，分別稱取24.2 mg紫蘇蛋白樣品與等質(zhì)量木糖于3支具塞試管中，加蒸餾水至25 mL，調(diào)節(jié)pH至9.0，溶解蛋白。加固試管塞，分別在80，90，100 ℃恒溫水浴加熱。在加熱反應(yīng)進(jìn)行1，2，3，4 h時(shí)取1 mL樣品于試管中，將試管放在冰水中冷卻，終止反應(yīng)。再分別加入10 mL蒸餾水稀釋，即為樣品溶液。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，確定木糖與紫蘇蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)的最適溫度。

1.3.3.4 不同初始pH對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

按照紫蘇蛋白與糖的質(zhì)量比為1∶1，分別稱取25.0 mg紫蘇蛋白樣品與等質(zhì)量木糖于3支具塞試管中，加蒸餾水至25 mL，分別調(diào)節(jié)pH至8.0，9.0，10.0。加固試管塞，于100 ℃恒溫水浴加熱。在加熱反應(yīng)進(jìn)行1，2，3，4 h時(shí)取1 mL樣品于試管中，試管放在冰水中冷卻，終止反應(yīng)。再分別加入10 mL蒸餾水稀釋，即為樣品溶液。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)確定木糖與紫蘇蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)的最適初始pH。

1.3.3.5 不同蛋白質(zhì)與糖的質(zhì)量比對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

按照紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比為10∶1、15∶1、20∶1分別稱取紫蘇蛋白樣品與等質(zhì)量木糖于3支具塞試管中，加蒸餾水至25 mL，調(diào)節(jié)pH至9.0，溶解蛋白。加固試管塞，于100 ℃恒溫水浴加熱。在加熱反應(yīng)進(jìn)行1，2，3，4 h時(shí)取1 mL樣品于試管中，試管放在冰水中冷卻，終止反應(yīng)。再分別加入10 mL蒸餾水稀釋，即為樣品溶液。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)確定木糖與紫蘇蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)的最適紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比。

1.3.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基的清除能力為響應(yīng)值，選取初始pH（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、紫蘇蛋白和木糖比例（C）為考察變量，應(yīng)用Design-Expert 12.0軟件，按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理建立三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇粕蛋白提取液濃度的測定

以測得的吸光值（Y）為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，作線性回歸方程，見圖1。

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.121 1X－0.033 6，R2=0.992，吸光值和牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液有良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出紫蘇蛋白提取液中蛋白質(zhì)含量，測得吸光值Y=0.051，X=0.699，即樣品中的蛋白質(zhì)含量為69.9%。蛋白含量偏低，原因可能是調(diào)節(jié)pH的過程中產(chǎn)生的偏差，pH不準(zhǔn)確，則紫蘇蛋白溶解不充分，造成蛋白含量較低；在離心的過程中，離心時(shí)間偏短，導(dǎo)致上層蛋白質(zhì)溶液含有一些雜質(zhì)，造成蛋白質(zhì)含量偏低。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備工藝

2.2.1 不同糖對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

分別以葡萄糖、果糖、木糖為修飾劑，制備紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，不同糖對抗氧化活性的影響見圖2。

由圖2可知，木糖與紫蘇蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物的抗氧化活性最高，在1～4 h內(nèi)，隨著加熱時(shí)間的增加，DPPH自由基清除率隨之增大，在4 h時(shí)達(dá)最大值。繼續(xù)加熱，產(chǎn)物的抗氧化活性反而降低。葡萄糖與紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性高于果糖，在1～3 h內(nèi)隨著加熱時(shí)間的增加葡萄糖與果糖，美拉德反應(yīng)值產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨之增大，在3 h時(shí)達(dá)最大。繼續(xù)加熱，產(chǎn)物的抗氧化活性隨之降低。木糖是五碳糖，葡萄糖和果糖是六碳糖，在理論上五碳糖美拉德反應(yīng)程度大于六碳糖美拉德反應(yīng)程度，還原糖美拉德反應(yīng)程度大于酮糖美拉德反應(yīng)程度，葡萄糖美拉德反應(yīng)程度大于果糖美拉德反應(yīng)程度，木糖更適于美拉德反應(yīng)，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 不同溫度對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

分別以80，90，100 ℃為反應(yīng)溫度，制備紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，作圖比較3種反應(yīng)溫度下制備的紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，見圖3。

由圖3可知，各溫度條件下，在1～4 h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，抗氧化活性隨之增大。隨著溫度的升高，產(chǎn)物的抗氧化活性提高，當(dāng)溫度達(dá)100 ℃時(shí)，抗氧化活性最大，且100 ℃＞90 ℃＞80 ℃，溫度相差10 ℃，美拉德反應(yīng)程度相差很多倍。美拉德反應(yīng)在20～25 ℃就會(huì)發(fā)生，在一定范圍內(nèi)，溫度越高，越有利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生，美拉德反應(yīng)程度越大，產(chǎn)物越多，產(chǎn)物的抗氧化活性越高。溫度過高，超過180 ℃，則會(huì)產(chǎn)生致癌物質(zhì)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件選擇美拉德反應(yīng)的最適溫度為100 ℃。

2.2.3 不同初始pH對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

分別以初始pH 8.0，9.0，10.0制備紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，作圖比較3種初始pH下制備的紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，見圖4。

向冷凍干燥后的紫蘇蛋白樣品中加入蒸餾水，使其溶解。紫蘇蛋白樣品的溶解度較低，這是因?yàn)樽咸K蛋白是在堿性條件下溶解出來、在等電點(diǎn)時(shí)沉淀得到的，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)才能溶解，因此紫蘇蛋白樣品經(jīng)過加堿后才能完全溶解。在偏堿環(huán)境下有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，但過堿環(huán)境則適得其反。由圖4可知，pH為9.0時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性最高，pH為8.0時(shí)的清除率大于pH為10.0時(shí)的清除率，這是由于pH為10.0時(shí)為過堿環(huán)境，對紫蘇蛋白與木糖發(fā)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生不利影響。在進(jìn)行美拉德反應(yīng)的過程中，反應(yīng)體系的pH呈逐漸下降的趨勢，下降到一定程度停止。因此，選擇pH 9.0為起始反應(yīng)pH值。

2.2.4 不同蛋白與糖的質(zhì)量比對紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

分別按照紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比為10∶1、15∶1、20∶1制備紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，以加熱時(shí)間為橫坐標(biāo)、DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，作圖比較3種蛋白與糖比例的紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，見圖5。

蛋白質(zhì)中的氨基和糖分子中的羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)的分子量較大，在蛋白質(zhì)和糖的質(zhì)量相同的情況下，糖分子中的羰基比蛋白質(zhì)中的氨基多，因此蛋白質(zhì)的質(zhì)量要比糖的質(zhì)量大一些，才有足夠的氨基與糖分子中的羰基發(fā)生縮合反應(yīng)，美拉德反應(yīng)才能更好地發(fā)生。由圖5可知，當(dāng)紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比為15∶1時(shí)，自由基清除率最大，且在1～4 h內(nèi)呈持續(xù)上升的趨勢，而紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比為10∶1和20∶1時(shí)相對較小。紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比為10∶1時(shí)，自由基清除率曲線呈先下降后上升的趨勢，在加熱3 h時(shí)達(dá)到最大，隨后又降低。紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比為20∶1時(shí)，自由基清除率呈先上升后下降的趨勢，在加熱2 h時(shí)達(dá)到最大。因此，選擇紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比為15∶1。

綜上所述，單因素實(shí)驗(yàn)制備糖-紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最適工藝為最適糖種類為木糖，紫蘇蛋白于100 ℃加熱4 h，蛋白與木糖最適質(zhì)量比15∶1，起始pH 9.0。

2.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備工藝

2.3.1 響應(yīng)面模型分析

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 12.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，見表3。

由表2和表3可知，對設(shè)計(jì)方案中17 組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=57.13－10.58A+1.96B+9.60C+1.77AB+9.73AC－0.45BC－9.88A2－7.49B2－9.29C2。該實(shí)驗(yàn)所建立的回歸模型的P值為0.000 1，具有高度顯著性，失擬項(xiàng)的P值為0.087 2，不顯著，說明無失擬因素存在，該回歸模型的預(yù)測值與實(shí)測值的擬合水平較好，所選模型較適宜?；貧w系數(shù)R2 為0.971 8，表明該模型相關(guān)度較好，RAdj2為0.935 6，表明該模型可以解釋93.56%的DPPH自由基清除能力的變化，即大多數(shù)變異可以被該模型預(yù)測，進(jìn)一步說明了回歸方程的擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，建模成功。

回歸方程各項(xiàng)的方差分析表明，A、C、AC、A2 、B2 、C2 均達(dá)到差異極顯著水平?；貧w方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小決定著各因素對響應(yīng)值影響的主次順序，可知3個(gè)因素對響應(yīng)值影響的主次順序?yàn)锳（初始pH）>C（紫蘇蛋白與木糖的質(zhì)量比）>B（反應(yīng)時(shí)間）。

2.3.2 響應(yīng)面和等高線分析

通過Design-Expert 12.0軟件對反應(yīng)時(shí)間與初始pH值、蛋白和糖的質(zhì)量比與初始pH值、蛋白和糖的質(zhì)量比與反應(yīng)時(shí)間之間的交互作用進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6～圖8。

由圖6～圖8可知響應(yīng)值的變化趨勢，曲面越陡，說明影響越顯著：曲面越平緩，說明影響越不明顯。二維等高線圖可以進(jìn)一步判斷各變量間交互作用的強(qiáng)弱并確定最優(yōu)點(diǎn)，等高線圖越近似橢圓形，表明交互作用越強(qiáng)；等高線圖越近似圓形，表明交互作用越弱。由圖6～圖8可知，在3組交互作用中，蛋白與糖的質(zhì)量比與初始pH值的交互作用最強(qiáng)，反應(yīng)時(shí)間與初始pH值、蛋白和糖的質(zhì)量比與反應(yīng)時(shí)間的交互作用不明顯，這與表3中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果完全符合。由響應(yīng)面圖可知，響應(yīng)面的最高點(diǎn)為該模型在所選范圍內(nèi)的最佳值 。

經(jīng)過回歸模型的分析，使用響應(yīng)面分析優(yōu)化后獲得紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最佳工藝條件為pH 8.19、反應(yīng)時(shí)間4.85 h、紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比15∶1，預(yù)測DPPH自由基清除率達(dá)到54.18%?？紤]實(shí)際操作，將初始pH調(diào)整為8.2，反應(yīng)時(shí)間調(diào)整為4.8 h，在該條件下進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值為55.3%，與預(yù)測值54.18%接近，說明建立的模型可以較好地預(yù)測紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力，實(shí)測結(jié)果與預(yù)測值誤差較小。

3 結(jié)論

在料液比1∶12、堿溶pH 9.0、50 ℃、溶解40 min、酸沉pH 4.4的條件下，提取紫蘇蛋白純度達(dá)69.9%。通過單因素實(shí)驗(yàn)得出，糖-紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最適制備工藝為最適糖種類為木糖、紫蘇蛋白于100 ℃加熱4 h、紫蘇蛋白與木糖最適質(zhì)量比15∶1、起始pH 9.0。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示各因素對抗氧化能力影響的主次順序?yàn)槌跏紁H值＞紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比＞反應(yīng)時(shí)間；考慮實(shí)際操作，將最佳工藝調(diào)整為初始pH 8.2、反應(yīng)時(shí)間4.85 h、紫蘇蛋白和木糖的質(zhì)量比15∶1，此時(shí)對DPPH自由基的清除率達(dá)54.18% ，紫蘇蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物有較好的抗氧化活性，可為紫蘇粕蛋白食品和天然蛋白抗氧化劑的研究和開發(fā)提供參考和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張玲.紫蘇多種活性成分測定及抗氧化活性初步研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2016.

[2]蹇黎，付淑芬，楊婧.紫蘇資源的SWOT分析[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2020，26（21）：29-30.

[3]AHMED H? M， AL-ZUBAIDY A M， OTHMAN-QADIR G. Biological investigations on macro-morphological characteristics， polyphenolic acids， antioxidant activity of Perilla frutescens （L.） Britt. grown under open field[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2022，29（5）：3213-3222.

[4]DING S Y， YAN Z Q， LIU H P， et al. Structural characterization and antitumor activity of a polysaccharide extracted from Perilla frutescens var. frutescens[J].Industrial Crops and Products，2022，187（A）：115334.

[5]HOU T Y， REDDY N V， ZHANG H J， et al. Perilla frutescens： a rich source of pharmacological active compounds[J].Molecules，2022，27（11）：3578.

[6]劉思佳，邢鈺彬，星萍，等.紫蘇黃酮抗菌活性表征[J].食品研究與開發(fā)，2021，42（23）：163-168.

[7]NAPAPAN K， KOMSAK P， CHAKKRIT K， et al. Anti-inflammatory effect of Perilla frutescens seed oil rich in omega-3 fatty acid on dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J].Research in Pharmaceutical Sciences，2021，16（5）：464-473.

[8]余順波，龍久鈴，陳長艷，等.紫蘇的生理活性研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（6）：75-83.

[9]NGOC P N， THANH H D， LE Y N， et al. Melanogenesis inhibitory effect of Perilla Frutescens （L.） Britt. on a hyperpigmentation model in rabbit[J].Pharmaceutical Sciences Asia，2022，49（3）：242-248.

[10]范三紅，賈槐旺，張錦華，等.不同提取方法對紫蘇籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響[J].中國調(diào)味品，2021，46（12）：61-69.

[11]溫賀，楊森，趙振新，等.冷榨與熱榨紫蘇粕營養(yǎng)成分分析[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2020，35（10）：136-140.

[12]林曉彤，李蒙，張玉蒼.蝦殼蛋白質(zhì)的提取、美拉德反應(yīng)改性及抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2023，49（7）：218-224.

[13]董燁，張益奇，張曉頔，等.鳙魚皮水解物美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2022，36（11）：2199-2209.

[14]黃建蓉，李秋萌，姚逸澄，等．酪蛋白-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性研究[J]．中國調(diào)味品，2022，47（10）：18-21.

[15]丁小強(qiáng)，陳麗麗，白春清，等.美拉德反應(yīng)對魚蛋白酶解物抗氧化活性的影響[J].中國調(diào)味品，2017，42（11）：29-34.

[16]KIM J M， YOON K Y. Functional properties and biological activities of perilla seed meal protein hydrolysates obtained by using different proteolytic enzymes[J].Food Science and Biotechnology，2021，29（11）：1553-1562.

[17]ZHAO Q L， WANG L F， HONG X， et al. Structural and functional properties of perilla protein isolate extracted from oilseed residues and its utilization in Pickering emulsions[J].Food Hydrocolloids，2020，113（7）：106412.

[18]王麗娜，孫洪蕊，李鳳林，等.酶解對紫蘇蛋白乳化特性的影響[J].食品研究與開發(fā)，2020，41（20）：66-72.

[19]ZHANG H H， ZHANG Z J， HE D L， et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of perilla meal protein for hydrolysate with high hydrolysis degree and antioxidant activity[J].Molecules，2022，27（3）：1079.

[20]姜文鑫，王曉飛，崔玲玉，等.紫蘇分離蛋白酶解制備抗菌肽的工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（3）：138-142.

[21]鄭志強(qiáng)，李寶林，郝利民，等.不同蛋白酶對小麥蛋白酶解物抗氧化活性的影響[J].食品科學(xué)，2017，38（7）：161-166.