文冠果種子高表達XsKCS7 基因的克隆和酵母表達功能鑒定

梁重鈞，李麟坤，胡振華，張 薇，許慧慧，王利兵*

(1. 海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3. 開魯縣林業(yè)和草原局，內(nèi)蒙古 通遼， 028400)

我國是世界油料主產(chǎn)國和最大進口國，糧油安全與國家安全息息相關(guān)。根據(jù)中華人民共和國國家統(tǒng)計局（http://www.stats.gov.cn/）數(shù)據(jù)顯示，2022年我國油菜籽、芝麻、大豆、花生等油料總產(chǎn)量約3 653 萬噸，而進口食用油籽達到9 610 萬噸，另外進口食用油648 萬噸。我國食用油對外依存度已達到70%，超過了國際安全警戒線[1]。因此，開發(fā)和利用木本油料，提高我國食用油產(chǎn)量和質(zhì)量，對滿足我國社會需求和降低食用油對外依存具有十分重要的現(xiàn)實意義。我國油料樹種資源十分豐富，適用于食用的含油量40%以上的油料樹種約150 多種，但目前開發(fā)利用程度較深的只有油茶（Camellia oleiferaAbel.）、核桃（Juglans regiaL.）、油橄欖（Olea europaeaL.）等10 余種。由此可見，有大量的木本油料資源有待發(fā)掘及進一步開發(fā)利用。

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）又名黃角（Yellowhorn），為無患子科（Sapindaceae）文冠果屬木本油料，是《關(guān)于加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》中明確提出的10 個木本油料樹種之一。文冠果種子油脂含量豐富，含油率達60%以上，其中不飽和脂肪酸含量高達92%，富含在植物中極為罕見的神經(jīng)酸（3%～7%）[2-4]。神經(jīng)酸（Nervonic acid，C24∶1Δ15，cis-tetracos-15-enoic acid），一種超長鏈單不飽和脂肪酸，是大腦白質(zhì)神經(jīng)組織的主要組成部分，具有修復(fù)大腦受損神經(jīng)纖維的獨特生理功效[5-6]，1925 年在人類和哺乳動物大腦中首次發(fā)現(xiàn)，次年從鯊魚腦中提取，并確定了神經(jīng)酸的結(jié)構(gòu)，又名鯊魚酸[7-8]。人體難以合成神經(jīng)酸，遠(yuǎn)未達到人體健康推薦攝取量300 mg·(60 kg)-1[9]，必須從食物中攝取，鯊魚腦中富含神經(jīng)酸，所提取的神經(jīng)酸純度高達98%，市場價格約120 萬元·kg-1，價格昂貴，國際社會也已禁止捕殺鯊魚；而神經(jīng)酸人工合成效率低，副產(chǎn)物多，同樣無法滿足人類的需求。由此可知，油料種子神經(jīng)酸已成為獲取神經(jīng)酸的主要途徑[10]。目前，元寶楓和文冠果已生產(chǎn)出對應(yīng)的食用油，應(yīng)用于食品行業(yè)。文冠果具有抗逆性強、易存活、含油率高、童期短等特點，更易批量種植和規(guī)?；a(chǎn)神經(jīng)酸。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)酸的生物合成通路已有報道[4,11-12]。脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)體中以乙酰輔酶A 為原料，合成終產(chǎn)物油酸（Oleic acid，C18∶1Δ9，cis-9-octadecenoic acid）；轉(zhuǎn)運蛋白長鏈?；o酶A 合成酶（LACS）將游離脂肪酸C18∶1 以C18∶1-CoA 的形式轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C18∶1-CoA 在脂肪酸延伸酶復(fù)合體的作用下經(jīng)過3 個重復(fù)延伸反應(yīng)依次生成輔酶A 形式的花生烯酸（cis-11-Eicosenoicacid，C20∶1Δ11）、芥酸（Erucic acid，C22∶1，cis-13-docosaenoic acid）和神經(jīng)酸（C24∶1）；最后以三酰甘油的形式儲存在植物種子和果實中。脂肪酸延伸酶復(fù)合體由4 個組分構(gòu)成，包括3-酮酯酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）、3-酮酯酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase，KCR）、3-羥酯酰-CoA 脫水酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrase，HCD） 和羥酯酰-CoA 還原酶（enoyl-CoA reductase，ECR）。其中KCS 為單體酶，具有底物特異性，是C18 以上超長鏈脂肪酸延長的限速酶；KCR、HCD 和ECR 為寡聚酶，是所有脂肪酸延長反應(yīng)共有[13]。根據(jù)文冠果基因組KCS基因在染色體的位置分布[14]，本研究將KCS基因編號為XsKCS1～XsKCS20以便于描述。文冠果參考基因組和種子發(fā)育不同時期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子中的表達量較其他KCS基因最高，可能調(diào)控種子油超長鏈脂肪酸的合成，然而其具體的功能尚未解析[15]。本研究在此基礎(chǔ)上，克隆文冠果XsKCS7基因，并進行生物信息學(xué)分析和生物酵母轉(zhuǎn)化功能鑒定。本研究初步鑒定了XsKCS7基因功能，為探索文冠果種子神經(jīng)酸的合成通路提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）特色抗旱栽培良種‘中石4 號’（國S-SV-XS-015-2020）五年以上穩(wěn)產(chǎn)實生苗生長于遼寧省阜新市彰武縣（42°37′ N, 122°53′ E），種植區(qū)域年平均降水量為504 mm，年平均溫度為7 °C，最低溫度為-36 °C，最高溫度為38 °C（數(shù)據(jù)來源于全國天氣網(wǎng)），林間正常管理。用于本研究基因克隆所需的文冠果發(fā)育中期種子樣品采集于2022 年6 月，種子樣品經(jīng)純凈水沖洗后擦干，液氮速凍后保存于-80 °C 待用。用于酵母表達實驗的生物酵母采用釀酒酵母菌株INVSc1。

1.2 實驗方法

1.2.1 文冠果KCS家族基因表達分析 下載Wang 等公開的文冠果種子不同發(fā)育時期種子（開花后第40、54、68、81 d）轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)（SRA 編號：PRJNA493982），以本研究室文冠果基因組數(shù)據(jù)為參考基因組進行聯(lián)合分析[16]，基因的表達水平根據(jù)FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）進行計算。

1.2.2 RNA 提取和cDNA 鏈合成 文冠果發(fā)育中期種子樣品RNA 的提取方法參照多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（天根，中國）說明書，經(jīng)過降解酶RQ1 RNase-Free Dnase（Promega ，美國）降解殘留的基因組DNA 后，以1 μg RNA 為模板，利用GoScriptTM Reverse Transcription System（Promega，美國）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.2.3 基因克隆和生物信息學(xué)分析 依據(jù)文冠果基因組XsKCS7基因參考序列，設(shè)計上游（5′-CTCTTCTTGTTTAGCTACCCTTT -3′）和下游（5′- ATCCTTTTTATTCCATTCTCTTT -3′）特異性引物；以采集的文冠果發(fā)育中期種子cDNA 為模板，利用kod 高保真擴增酶（Toyobo，日本）擴增，經(jīng)測序驗證無突變的XsKCS7連接至克隆載體pGEM?-T Easy 載體系統(tǒng)構(gòu)建（Promega，美國）并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α；再次測序驗證序列后，將陽性菌液保存于-80 °C。

多重序列比對通過軟件DNAMAN 7.0 中的clustal X 程序進行；系統(tǒng)性進化樹分析由軟件MEGA5.0 中的neighbor-joining 程序進行。

1.2.4 生物酵母轉(zhuǎn)化與表達 限制性內(nèi)切酶HindⅢ 酶切酵母表達載體pYES2.0，設(shè)計帶有同源臂的上游引物（5′-taagcttggtaccgagctcgATGGCT AATGAGAACAAAAA -3′）和下游引物序列（5′-gcggccgttactagtggatcTTAAATAACAATCGATGC AA -3′）擴增XsKCS7，以同源重組法構(gòu)建酵母表達載體pYES2.0-ProGAL1::XsKCS7，操作方法參照試劑盒SeamLess Assembly Cloning Kit（中美泰合，中國）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1（Invitrogen, USA）菌株的轉(zhuǎn)化采用聚乙二醇/醋酸鋰（PEG/LiAc）誘導(dǎo)法[17]。

轉(zhuǎn)基因酵母在SD-U 液體培養(yǎng)基中震蕩至吸光值A(chǔ)600至0.4～0.5 后，加入總?cè)芤?/10 體積的20%半乳糖水溶液（m/v）激活酵母載體啟動子GAL1表達XsKCS7，同時分別加入底物0.5 mmol·L-1花生烯酸C20∶1 芥酸C22∶1 以及不加底物（酵母提取物自身含有油酸C18∶1），20 °C培養(yǎng)4 d；培養(yǎng)物于3 500 g 離心10 min，收集酵母菌體，以真空冷凍干燥機在-40 °C 環(huán)境下干燥12 h 成粉末狀，-80 °C 保存用于脂肪酸含量和組分測定。

1.2.5 脂肪酸測定 酵母提取物脂肪酸提取采用硫酸甲醇酯化法[18]，提取的脂肪酸甲酯由乙酸乙酯溶解。吸取1.0 μL 乙酸乙酯用于GC 檢測，檢測儀器使用氣相色譜儀，柱子使用強極性氣相色譜柱DB-23。GC 檢測設(shè)置條件為：170 ℃，5 min；2 ℃·min-1到210 ℃；柱箱210 ℃；壓力163.8 kpa；總流量48.3 mL·min-1；柱流量4.2 mL·min-1；分流比10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果KCS 家族基因表達分析

SapBase 數(shù)據(jù)庫（http://www.sapindaceae.com/）公開了由本研究室測序獲得的文冠果基因組數(shù)據(jù)，共注釋KCS基因20 個[14,16]，根據(jù)這些基因在染色體的位置分布，編號為XsKCS1～XsKCS20（圖1）。基于參考基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，分析得到文冠果KCS基因家族在高油文冠果種子不同發(fā)育時期的表達模式。結(jié)果如圖2 所示，XsKCS5、XsKCS6、XsKCS19及XsKCS20在文冠果種子各個發(fā)育時期的表達量均為0，不參與基因表達熱圖繪制；XsKCS7基因在種子中的表達量遠(yuǎn)高于其他KCS基因，表明XsKCS7基因可能調(diào)控文冠果種子油超長鏈脂肪酸的合成功能。

圖1 KCS 基因在文冠果染色體中的位置Fig. 1 The position of KCS genes in the chromosome of Xanthoceras sorbifolium

圖2 XsKCS 基因在文冠果不同發(fā)育時期種子中的表達量Fig. 2 Expression of XsKCS genes in seeds of Xanthoceras sorbifolium at different developmental stages

2.2 XsKCS7 基因的克隆

將采集的文冠果發(fā)育中期種子用液氮研磨后，使用RNA 提取試劑盒抽提種子RNA，經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)RNA 具有清晰的28S 和18S 條帶（圖3A），同時Agilent 2100 Bioanalyzer 分析儀檢測RIN（RNA integrity number）值大于7.0，表明RNA完整性較好；分光光度計測量其OD260/OD280值在1.95～2.05 之間，表明RNA 純度高。

圖3 RNA 電泳圖（A）；XsKCS7 基因擴增電泳圖（B）Fig. 3 Electrophoresis of RNA(A) and electrophoresis of the amplification of XsKCS7 gene(B)

以種子cDNA 為模板，依據(jù)文冠果基因組XsKCS7基因參考序列設(shè)計的特異性引物擴增，連接至克隆載體后使用通用引物T7/SP6 擴增并測序，最終獲得包括XsKCS7基因CDS 區(qū)的1 512 bp 序列，擴增產(chǎn)物長度包括克隆載體骨架共1 681 bp（圖3B）。

2.3 XsKCS7 蛋白序列分析

通過軟件DNAMAN5.0 將文冠果XsKCS7 蛋白、梣葉槭（Acer negundoL.）AnKCS（NCBI注冊號：KAI9194759.1；下同）、橡膠[Hevea brasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.]HbKCS11（XP_021653194.1）、石榴（Punica granatumL. ）PgKCS11 （XP_031382877.1 ）、木薯（Manihot esculentaCrantz ）MeKCS20（XP_021595702.1 ） 和白時鐘花（Turnera subulataSmith）TsKCS11（KAJ4840348.1）蛋白進行多重序列比對。結(jié)果如圖4 所示，文冠果XsKCS7 蛋白與其他植物KCS 基因具有相似的保守基序（紅框標(biāo)出）。

圖4 KCS 蛋白多重序列比對Fig. 4 Multiple sequence alignment of KCS protein

采用軟件MEGA5.0 neighbor-joining 程序?qū)sKCS7 蛋白與其他物種KCS 蛋白進行系統(tǒng)性分析，參與構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的物種包括：蓖麻（Ricinus communisL. ）RcKCS6 （XP_0025 10886.3）、大豆[Glycine max(L.) Merr.]GmKCS5（XP_003555356.2）、甘藍型油菜（Brassica napusL.）BnKCS6（LOC106410639）、花生（Arachis hypogaeaLinn.）AhKCS5（XP_02562 0215.1）、苦楝（Melia azedarachL.）MaKCS（KAJ4706144.1）、簸箕柳（Salix suchowensisW. C. Cheng in S. Y. Jin）SsKCS（KAG523 0593.1） 、 山 核 桃[Carya illinoinensis(Wangenh.) K. Koch]CiKCS5（XM_043119331.1）、蒜頭果（Malania oleiferaChun & S. K. Lee）MoKCS（MK210592.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtKCS10（NP_180193.1）、桃[Prunus persica(L.) Batsch]PpKCS5（XP_020411733.1）、梣葉槭AnKCS（KAI9162263.1）、漾濞槭（Acer yangbienseY. S. Chen & Q. E. Yang）AyKCS（TXG70798.1）、薔薇（Rosa chinensisJacq.）RsKCS6（XP_024164718.1 ）、 巴西橡膠樹HbKCS11（XM_021797502.1）、阿月渾子（Pistacia veraL.）PvKCS20（XM_031416789.1）。結(jié)果如圖5 所示，XsKCS7 蛋白與其他物種KCS 蛋白親緣性關(guān)系較近，其中與橡膠樹親緣關(guān)系最近，為67.62%。

圖5 KCS 蛋白系統(tǒng)性進化樹分析Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of KCS protein

2.4 轉(zhuǎn)基因酵母鑒定XsKCS7 基因功能

將重組質(zhì)粒pYES2.0-ProGAL1::XsKCS7（簡寫為pYES2.0-XsKCS7）和對照空載體pYES2.0轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌株INVSc1。釀酒酵母本身不具有超長鏈延長酶活性，pYES2.0 對照組中未檢測到花生烯酸（C20∶1）、芥酸（C22∶1）以及神經(jīng)酸（C24∶1）。與pYES2.0 對照組相比，pYES2.0-XsKCS7 轉(zhuǎn)基因酵母提取物未檢測到其他脂肪酸（圖6A1、B1）；與pYES2.0 + C20∶1 對照組相比，pYES2.0-XsKCS7 轉(zhuǎn)基因酵母提取物中檢測到了芥酸和微量的神經(jīng)酸（圖6A2、B2）；與pYES2.0 + C22∶1 對照組相比，pYES2.0-XsKCS7轉(zhuǎn)基因酵母提取物中檢測到神經(jīng)酸（圖6A3、B3）。上述結(jié)果表明XsKCS7基因具有催化花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神經(jīng)酸的功能，但不具備油酸生成花生烯酸的功能。

圖6 酵母細(xì)胞提取物脂肪酸甲酯GC-MS 峰圖Fig. 6 GC-MS analysis for FA components in yeast cells

3 討論

文冠果是一種罕見的種子中富含神經(jīng)酸的經(jīng)濟油料樹種，而神經(jīng)酸具有潛在的藥用保健效用[5]，是近年來國內(nèi)外研究的熱點。3-酮酯酰-CoA 合酶基因（KCS）是調(diào)控超長鏈脂肪酸合成的限速酶基因，已在蒜頭果[19]、銀扇草（Lunaria annuaL.）[20]、碎米薺（Cardamine graecaL.）[21]等物種中克隆并鑒定其具有調(diào)控神經(jīng)酸合成的功能，然而在文冠果中尚未解析。

本研究以文冠果基因組為參考基因組，重新分析文冠果種子不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子的表達量明顯高于其他KCS基因。通過PCR 法擴增得到XsKCS7基因序列，編碼503 個氨基酸；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，XsKCS7蛋白序列與其他物種KCS 蛋白序列均具有KCS 家族保守基序“GMGCSA”、“FGNTSSSS”以及“GSGFKCNSAVW”[22]；系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明XsKCS7 與其他物種KCS 蛋白親緣性關(guān)系較近，與橡膠樹最近（圖5）。以上結(jié)果表明克隆的XsKCS7基因具有潛在的3-酮酯酰-CoA 合酶功能，然而其具體的功能還需進一步研究。

真核釀酒酵母表達是適合研究具有單一催化功能蛋白的異源表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)已被許多研究用于鑒定KCS 酶的功能。例如，在釀酒酵母菌株INVSc1 中異源表達毛果楊（Populus trichocarpaL.）PtKCS1和PtKCS2，發(fā)現(xiàn)PtKCS1底物偏好為單不飽和脂肪酸，而PtKCS2偏好為多不飽和脂肪酸[23]；銀扇草和碎米薺KCS也通過酵母表達系統(tǒng)鑒定其具有以花生烯酸（C20∶1）為底物，生成神經(jīng)酸的功能[20-21]。本研究同樣使用釀酒酵母菌株INVSc1 表達系統(tǒng)，分別以油酸（C18∶1）、花生烯酸、芥酸（C22∶1）為底物異源表達文冠果XsKCS7基因，發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因具有調(diào)控花生烯酸生成芥酸和催化芥酸生成神經(jīng)酸的功能。以上結(jié)果表明不同物種KCS基因具有明顯的底物特異性調(diào)控功能，而至今為止已被功能鑒定的KCS基因較少，應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測其功能的準(zhǔn)確性較差，由此可見，單一KCS基因的功能研究極為必要。本研究通過酵母異源表達系統(tǒng)鑒定XsKCS7基因具有調(diào)控芥酸和神經(jīng)酸的合成的功能，同時前期研究表明XsKCS7基因在文冠果種子發(fā)育期高表達，由此可見，XsKCS7基因是調(diào)控文冠果種子油超長鏈脂肪酸芥酸和神經(jīng)酸合成的關(guān)鍵基因，為解析文冠果神經(jīng)酸合成通路提供了扎實基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

依據(jù)KCS基因在文冠果基因組染色體中的位置分布將20 個KCS基因編號為XsKCS1～XsKCS20。以本研究室測序得到的文冠果基因組為參考基因組，重新分析文冠果種子不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRA 編號：PRJNA493982），發(fā)現(xiàn)XsKCS7基因在種子中的表達量遠(yuǎn)高于其他KCS基因。本研究克隆了文冠果XsKCS7基因，生物信息學(xué)分析其具有潛在的3-酮酯酰-CoA 合酶功能，在釀酒酵母異源表達XsKCS7基因鑒定其具有調(diào)控芥酸和神經(jīng)酸的合成功能。綜上所述，XsKCS7基因是調(diào)控文冠果種子芥酸和神經(jīng)酸合成的關(guān)鍵基因。