恩格列凈對慢性間歇缺氧大鼠心房纖維化的影響及機(jī)制探討*

劉永政 楊禹 王君 李瑞齡 袁夢 張躍 李廣平

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)是臨床常見的心律失常,其病理基質(zhì)是心房纖維化。心房纖維化導(dǎo)致心房功能下降、傳導(dǎo)異質(zhì)性增加,從而引起AF。既往研究顯示微小RNA-21(mi R-21)/軟脂?；椎鞍?1(Spr y1)信號(hào)通路的異常激活及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopr oteinase,MMP)的比例失衡可導(dǎo)致心房纖維化的發(fā)生[1－2]。

恩格列凈(empagliflozin)是鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(sodiu m-glucose cotransporter2 inhibitor,SGLT2i)之一,可以顯著降低2型糖尿病患者心血管疾病死亡率、心力衰竭(簡稱心衰)住院率以及全因死亡率[3],并且其心血管獲益獨(dú)立于其降糖作用之外[4]。除此之外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還表明恩格列凈可以改善高血壓心力衰竭、心肌梗死、代謝綜合征、肥胖合并2 型糖尿病導(dǎo)致的心臟纖維化[5－10]。慢性間歇缺氧可致心房組織發(fā)生明顯的纖維化[1－2],但恩格列凈對睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)患者心房結(jié)構(gòu)的影響尚未明確。

本研究擬建立慢性間歇缺氧大鼠OSAHS疾病模型,研究恩格列凈對慢性間歇缺氧大鼠心房纖維化的影響以及對mi R-21、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、Spry1以及MMP-2、MMP-9的作用以探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組 該實(shí)驗(yàn)得到天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):T MUa MEC2016012)。取180～200g SD 雄性大鼠60只(北京華阜康生物科技股份有限公司),經(jīng)過3天適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為對照組(C組),慢性間歇缺氧組(CI H 組)和慢性間歇缺氧-恩格列凈干預(yù)組(CI H-E組),每組20只。CI H 組以及CI H-E組接受為期40天的慢性間歇缺氧處理。每日接受間歇缺氧處理前,通過灌胃的方式給予CI H-E組自來水溶解的恩格列凈(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司,批號(hào):國藥準(zhǔn)字J20171073)2 mg/kg。每7天測量體重以調(diào)整恩格列凈給藥量。同時(shí)給予C、CI H 組自來水灌胃。三組大鼠在恒溫恒濕、光暗交替(12 h∶12 h)的環(huán)境里飼養(yǎng),并給予充足的嚙齒類動(dòng)物食物及自來水。

1.2 慢性間歇缺氧處理 采用氧濃度控制箱(黑龍江邁沃德工貿(mào)有限公司,MA WORDE 大/小老鼠低氧實(shí)驗(yàn)箱GC-A )對大鼠進(jìn)行慢性間歇缺氧處理。將CIH 組及CI H-E 組大鼠放入氧濃度控制箱,給予足夠的食物與自來水。沖入氮?dú)?使氧濃度逐漸下降至6.5%,維持5 min,隨后沖入壓縮空氣直至氧濃度逐漸上升至18%,維持5 min。循環(huán)反復(fù)。第一天維持缺氧2 h,隨后每日增加1 h,直至每天缺氧8 h。

1.3 一般數(shù)據(jù)采集 在完成40天慢性間歇缺氧程序后,三組同步進(jìn)行一般數(shù)據(jù)采集。測量體重后將大鼠裝進(jìn)溫暖的布袋中,露出鼠尾,待大鼠平靜后,應(yīng)用小動(dòng)物無創(chuàng)檢測儀(Softron T MC-213)測定鼠尾3次血壓,取平均值。

1.4 心臟超聲心動(dòng)圖檢查 在完成40天慢性間歇缺氧程序后,三組同步進(jìn)行進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢查。異氟烷(1～2 L/min)麻醉大鼠后,將其固定在動(dòng)物平臺(tái)上,左胸前區(qū)脫毛備皮,隨后應(yīng)用小動(dòng)物超聲儀(Philips 7500)測量如下數(shù)據(jù):室間隔厚度,左室收縮末內(nèi)徑,左室舒張末內(nèi)徑,左房前后徑,左室射血分?jǐn)?shù),肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間(PAT)。并依據(jù)公式:平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)＝75－0.45×PAT 計(jì)算mPAP。

1.5 心房組織取材 以1～1.5 ml 10%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,待麻醉完全后自胸骨正中,逐層剪開皮膚、皮下組織、胸骨,分離組織,充分暴露心臟。以5 ml注射器刺入大鼠右心室取靜脈血2 ml存于抗凝采血管中。取血后鉗夾主動(dòng)脈根部,迅速剪下大鼠心臟,于臺(tái)式液中充分清洗心臟殘余血液后置于濾紙上晾干稱重,小心剪下心房組織。每組取5只大鼠的心房組織置于4%中性甲醛溶液中固定,常溫保存。剩余15只大鼠的心房組織用錫紙包裹,經(jīng)液氮預(yù)冷并轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。留取血液?jīng)4℃、4 000 r/min離心20 min,取上清液于2.5 ml EP 管,置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 組織病理學(xué)檢查 應(yīng)用Massion染色比較心房纖維化的程度并計(jì)算膠原分?jǐn)?shù)。取甲醛溶液固定后的心房組織進(jìn)行梯度脫水,隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片(每片5μm),置于載玻片上,60℃烤干待用。應(yīng)用改良Massion 三色染色液(Beijing SOLARBIO&TECHNOLOGY CO.,LTD),依據(jù)說明書步驟進(jìn)行染色。隨后光鏡下觀察心房組織的纖維化程度。應(yīng)用i mage J軟件進(jìn)行膠原分析,去除心外膜、心內(nèi)膜以及血管周圍的結(jié)締組織以外纖維化的結(jié)締組織面積與組織總面積的比值,得到膠原分?jǐn)?shù)。

1.7 靶mRNA 檢測 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法測定mi R-21、Spry1、ERK1/2、MMP-2、MMP-9的mRNA。應(yīng)用RNA 提取試劑盒(Eastep R Super Total RNA Extraction Kit,LS1040,Shanghai Pro mega)按說明書提取大鼠心房組織總RNA,并應(yīng)用Nanodrop 核算定量儀(Ther mo)測定RNA 的濃度。隨后應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[Fast King RT Kit(Wit h g DAase,TIANGEN)],依據(jù)說明書配置20μL 反轉(zhuǎn)錄體系,應(yīng)用Eppendorf梯度PCR 儀完成反轉(zhuǎn)錄以獲取c DNA。將c DNA 放置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取PCR用8聯(lián)管,加入c DNA 及引物,配制25μL 反應(yīng)體系。將PCR八聯(lián)管放入ABI 7500定量PCR反應(yīng)儀,依照各引物設(shè)定反應(yīng)條件,測定目的基因CT 值,并計(jì)算目的基因表達(dá)量(2－△Ct法)。25μL 反轉(zhuǎn)錄體系包括:Double Distilled H2O 8.5μL,SYBR GREEN 熒光染料12.5 μL,For ward Pri mer 1μL,Reverse Pri mer 1μL,c DNA 2μL。GAPDH、Spry1、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、mi R-21引物序列見表1。

表1 RT-q PCR 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.8 靶蛋白檢測 應(yīng)用Wester n blot法測定并比較各靶蛋白的表達(dá)。將大鼠心房組織(約50 mg)與細(xì)胞裂解緩沖液(RIPA Lysis Buff er,CWBIO)1 ml、蛋白酶抑制劑(PMSF)10μL 及磷酸酶抑制(Roche)1/10 片置于EP 管中,加入鋯珠8 粒,于Q24R 低溫快速組織研磨勻漿儀(DHS)中4℃,6.5 m/s,震蕩15 s,靜置1 min,共研磨4 個(gè)循環(huán)。研磨結(jié)束后,將各樣本對稱放入高速離心機(jī)中,4℃、12 000 r/min,離心20 min,取上清200μL,加入50μl 5×蛋白上樣緩沖液,100℃煮沸10 min。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)比色法測定蛋白濃度。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳將不同分子量蛋白分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF 膜孵育下列抗體:β-actin (1∶4 000 Pr oteintech,USA),phospho-ERK1/2(1∶10 000 Abcam,USA),ERK1/2(1∶10 000 Abcam,USA),MMP-2(1∶5 000 Abcam,USA),MMP-9(1∶5 000 Abcam,USA),Spr y1 (1∶2 000 Cell Signaling Technology,USA)。隨后孵育相應(yīng)的二抗(鼠或兔1∶10 000)。將條帶置于化學(xué)發(fā)光液(EZ ECL plco)2 min后于自動(dòng)曝光儀中進(jìn)行熒光顯色。應(yīng)用I magin J對顯影的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)量資料組間比較,采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 三組一般情況以及心臟超聲指標(biāo)的比較與C組、CI H 組比較,CI H-E 組體重減輕,舒張壓下降(P＜0.05),心臟重量有下降趨勢,但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與C 組比較,CI H 組mPAP 升高;與CIH 組 比 較,CIH-E 組mPAP 下 降(P＜0.05)。其他一般情況以及心臟超聲指標(biāo)無差異(表2)。

表2 三組一般情況以及心臟超聲指標(biāo)比較

2.2 三組心房組織病理學(xué)的比較 與C 組比較,CI H 組心房肌組織纖維化程度加重,膠原分?jǐn)?shù)升高[9.77%±1.88%(n＝10)vs 1.62%±0.75%(n＝10),P＜0.01];與CI H 組比較,CI H-E 組心房的纖維化程度減輕,膠原分?jǐn)?shù)下降[6.77%±1.81%(n＝10)vs 9.77%±1.88%(n＝10),P＜0.05],但仍高于C組(P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 三組大鼠心房組織Masson染色(40×)

2.3 三組目標(biāo)基因及蛋白的比較 與C 組比較,CI H 組mi R-21、ERK1/2、MMP-2、MMP-9的mRNA 明顯升高,而Spr y1的mRNA 明顯下降,相應(yīng)的ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、MMP-9 表 達(dá) 升高,Spr y1 表 達(dá) 下 降;與CI H 組 比 較,CI H-E 組mi RNA-21、ERK1/2、MMP-2、MMP-9 的mRNA明顯下降,Spr y1的mRNA 升高,相應(yīng)的ERK1/2、p-ERK1/2、MMP-2、MMP-9表達(dá)下降,Spry1 表達(dá)升高。與C 組 比 較,mi R-21、ERK1/2、MMP-9 的mRNA 明顯升高,而Spry1、MMP-2 的mRNA 無明顯變化。詳見表3、4及圖2。

圖2 三組各蛋白表達(dá)

表3 三組mRNA 的比較

表4 三組各蛋白表達(dá)比較

3 討論

筆者發(fā)現(xiàn)慢性間歇缺氧可以使大鼠的心房組織發(fā)生明顯的纖維化,這與之前的研究是一致的[1－2,11]。而恩格列凈可以改善慢性間歇缺氧導(dǎo)致的心房纖維化,且其機(jī)制可能是通過抑制mi R-21/ERK 信號(hào)通路以及MMPs途徑發(fā)揮抗心房纖維化的作用。

經(jīng)過40 天的缺氧程序之后,CI H-E 組體重較另外兩組體重明顯偏輕。由于慢性間歇缺氧期間CI H 及CI H-E兩組大鼠進(jìn)食均減少,而CIH 組大鼠體重?zé)o明顯下降,所以可基本排除CI H-E 大鼠是因缺氧期間進(jìn)食減少導(dǎo)致的體重下降。有研究表明恩格列凈可通過降低體重以及減少脂肪合成降低心肌代謝的風(fēng)險(xiǎn)[12－13],但筆者的研究表明,盡管CIHE組體重較C 組、CIH 組明顯下降,但三組大鼠的心臟重量沒有差異,基本排除了由于體重的差異對大鼠心房纖維化的影響。

筆者的研究發(fā)現(xiàn),與C 組及CI H 組相比,CHIE組大鼠的舒張壓明顯下降,而收縮壓并沒有明顯下降。CI H-E組大鼠DBP明顯下降的主要原因,結(jié)合恩格列凈的藥理學(xué)作用,推測是由于恩格列凈增加大鼠的尿糖水平,滲透性利尿?qū)е卵萘肯陆?進(jìn)而主要影響舒張壓,但是本研究并未檢測大鼠尿糖,具體機(jī)制需要試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,SGLT2i可明顯降低MMP-2以及MMP-9的水平[14]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)恩格列凈對MMP-2、MMP-9的影響與文獻(xiàn)一致,可明顯降低由間歇缺氧導(dǎo)致的大鼠心房組織中的MMP-2、MMP-9水平的升高。

本研究表明慢性間歇缺氧可以升高大鼠心房組織中的mi R-21 的mRNA 水平,并降低其下游靶基因Spr y1 的mRNA 水平。而Spry1 是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路中特異性抑制蛋白,可以抑制纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路MAPK/ERK1/2 通路。Spr y1 的下降進(jìn)一步促進(jìn)了心房組織纖維化。本實(shí)驗(yàn)中,恩格列凈可以降低mi R-21 水平并升高Spr y1水平,進(jìn)而抑制MAPK/ERK1/2通路,使ERK1/2、p-ERK1/2較CHI組大鼠明顯下降,證明恩格列凈可以通過抑制mi R-21/ERK1/2信號(hào)通路減輕慢性間歇缺氧大鼠的心房纖維化程度。

以往研究表明恩格列凈可以降低2型糖尿病患者的心血管事件以及全因死亡率[3],且其心血管獲益獨(dú)立于降糖作用之外[4,15]。本研究提示盡管沒有明確的證據(jù)表明恩格列凈可直接影響心臟組織的分子靶點(diǎn),但恩格列凈可通過非SGLT2受體途徑影響慢性間歇缺氧導(dǎo)致的心房肌的纖維化。

本研究的局限性:大鼠沒有單獨(dú)飼養(yǎng),所以沒有收集尿液以及與尿液有關(guān)糖尿、蛋白尿和尿鈉排泄的信息。沒有單獨(dú)設(shè)置非缺氧大鼠恩格列凈組以及利尿劑對照組。由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和材料有限,只選擇了RT-q PCR 作為檢測mi R-21 的手段,沒有進(jìn)行mi R-21 的Wester n blot檢測;之前的實(shí)驗(yàn)表明p-ERK1/2 不適合做RT-qPCR 實(shí)驗(yàn),故缺少p-ERK1/2 的RT-q PCR 數(shù)據(jù)。另外,沒有檢測其他的MMPs以及基質(zhì)金屬蛋白酶類組織抑制劑。