余甘子多酚提取工藝及測定方法研究進(jìn)展*

王 欣，郝 巖，楊鑫淼，孫莉歡，趙晉彤

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）為大戟科葉下珠屬植物余甘子的果實(shí)，在我國西南等地區(qū)分布廣泛，是我國藥食兩用的傳統(tǒng)藥材之一，具有清熱涼血、消食健脾、生津止咳等藥效[1]。余甘子內(nèi)富含多酚類、萜類、維生素及各種微量元素等多種活性成分[2]，大量研究表明，余甘子多酚具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、護(hù)肝、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3]，在藥物研發(fā)及食品保健等方面具有廣闊的前景。因此，余甘子多酚的高效提取對后續(xù)的深入研究及產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。本文在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，對余甘子多酚的多種提取工藝及測定方法進(jìn)行梳理綜述，以期為余甘子多酚的高效利用提供理論依據(jù)及參考。

1 余甘子多酚的提取工藝

1.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法作為多酚提取中的傳統(tǒng)方法，對于溶劑的選擇，首先，要求溶劑能夠較好地溶解多酚，其次，還要考慮其極性及安全性等性質(zhì)。提取多酚類化合物所用溶劑多為有機(jī)溶劑，例如甲醇、乙醇、丙酮等。曹維等[4]以廣東普寧產(chǎn)余甘子鮮果實(shí)為原料，通過正交實(shí)驗(yàn)對余甘子多酚的最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先，對3 種不同提取溶劑（50%甲醇、80%乙醇、蒸餾水）進(jìn)行考察，結(jié)果表明，50%甲醇提取得到的多酚含量為3.6%，提取效果最佳。進(jìn)而通過正交實(shí)驗(yàn)得出影響多酚提取效果的因素依次為料液比>提取次數(shù)>提取時間，且當(dāng)料液比為1∶10、提取時間為90min、提取次數(shù)為1 次時，多酚含量達(dá)到最高。吳丹玲等[5]在余甘子多酚提取條件優(yōu)化的研究中，以水及不同濃度的丙酮、甲醇、乙醇作為提取溶劑，對余甘子多酚進(jìn)行提取，并對提取溶劑的濃度及提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提取5次、70%丙酮提取3 次、70%甲醇提取4 次、80%乙醇提取3 次的多酚提取率均在96%以上。其中，當(dāng)70%丙酮提取3 次時，所得多酚含量最高，可達(dá)到17.21g·kg-1。甘瑾等[6]以乙醇為提取溶劑對余甘子果渣多酚進(jìn)行提取，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間為考察因素，以多酚提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對余甘子果渣中的多酚進(jìn)行了提取優(yōu)化。以此確定出余甘子果渣多酚的最佳提取條件為：提取溫度60℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間80min、料液比1∶33（g∶mL），在此條件下多酚的提取量為126.25mg·g-1。楊冰鑫等[7]選用四川產(chǎn)余甘子鮮果實(shí)為研究對象，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出浸提時間、浸提溫度和乙醇濃度3 個因素對總多酚提取影響較大，進(jìn)一步采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。當(dāng)浸提時間為135min、浸提溫度為70℃、乙醇濃度為45%時，總多酚含量為（0.2427±0.008）mg GAE·mg-1。

溶劑浸提法較其他提取方法來說，操作簡單、可行性高、整體實(shí)驗(yàn)更為穩(wěn)定，但其提取時間較長且得率較低，同時，有機(jī)溶劑消耗量大且成本較高。

1.2 酶解輔助提取法

植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素及果膠等構(gòu)成，因此，可以選用相應(yīng)的生物酶水解這些組成成分，以達(dá)到破壞植物細(xì)胞壁，有利于其中活性物質(zhì)提取的目的。提取生物活性物質(zhì)常用的生物酶類有纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶等。王小艷等[8]采用了酶解輔助法提取余甘子多酚并測定總多酚的含量。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L16（45）進(jìn)行工藝優(yōu)化，以總多酚的提取率作為參考指標(biāo)，最終確定余甘子總多酚的最佳提取工藝為：纖維素酶和果膠酶比例為1∶1、總加酶量為2%、提取溫度60℃、料液比1∶30（g∶mL）、最適pH 值為4.0、恒溫低速振蕩、提取時間為4h，總多酚提取率為13.68%。

酶解輔助提取法具有作用條件溫和、提取率較高、有機(jī)溶劑使用量少等優(yōu)點(diǎn)，但提取時間相對較長，且酶制劑成本較高。

1.3 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是在超聲波所產(chǎn)生的空化作用和機(jī)械作用下，使組織細(xì)胞發(fā)生破裂，進(jìn)而在超聲波高頻振動作用下，能夠促進(jìn)多酚類物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散。黃秋萍等[9]以丙酮為提取試劑，通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，對超聲波輔助提取余甘子果核多酚工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取條件為：體積分?jǐn)?shù)70%的丙酮、料液比1∶4（g∶mL）、提取溫度40℃、提取時間30min，在此條件下，余甘子果核多酚的提取率為7.37%。林長彬等[10]以乙醇為提取試劑，以余甘子總多酚的提取量為評價指標(biāo)，采取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken 響應(yīng)面法，探究乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度對余甘子多酚提取工藝的影響，并對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，余甘子多酚提取的影響因素為乙醇濃度>超聲溫度>超聲時間；最佳提取條件為：乙醇濃度64%、超聲時間39min、超聲溫度43℃，余甘子總多酚的提取量可達(dá)186.17mg·g-1。Tsai 等[11]選取提取時間、乙醇濃度及超聲頻率等影響因素，通過L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對超聲輔助提取余甘子多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶50（g∶mL），在提取時間為15min、提取溫度60°C、超聲頻率為56kHz 的條件下，酚類化合物的浸出量達(dá)55.34mg·g-1，其得率可達(dá)56.82%。而常規(guī)溶劑（70%乙醇）萃取酚類成分的產(chǎn)率為16.78%，遠(yuǎn)低于超聲輔助提取法。

超聲波輔助提取法操作簡便、提取時間短且效率高，作為新型提取方法，具有廣闊前景。

1.4 微波輔助提取法

微波輔助提取法是指電磁波與極性化合物相互作用時所產(chǎn)生熱量，能夠提高提取溶劑的溫度，進(jìn)而增加溶劑在樣品中的滲透率，同時高溫可破壞植物細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁，更有利于活性成分的溶出。李潔等[12]采用微波-熱水浸提法對余甘子多酚進(jìn)行提取，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在微波功率640W 條件下處理3min，料液比為1∶20（g∶mL），在50°C 下浸提6min 后，與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，總酚提取量提高了50.26%。Li 等[13]選用產(chǎn)自福建省惠安縣的余甘子進(jìn)行研究，通過響應(yīng)面分析法，以總多酚含量為評價指標(biāo)，對微波功率、輻照時間、乙醇濃度及料液比進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳提取工藝：在微波功率為480W，輻射時間29s、乙醇濃度為66%、料液比為1∶25（g∶mL）的條件下，總酚含量可達(dá)（133.58±15.61）mg·g-1。

因此，微波輔助提取法因其提取效率高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于植物多酚的提取。

1.5 亞臨界水萃取法

亞臨界水萃取法是以水作為提取溶劑，在溫度為100～374℃之間時，通過改變壓力使其仍然保持液體狀態(tài)。亞臨界狀態(tài)下，亞臨界水的氫鍵強(qiáng)度會隨著溫度的升高而減弱，使其具有與有機(jī)溶劑相似的性質(zhì)，有利于提取率的增加[14]。該方法已被廣泛應(yīng)用于多酚、多糖以及精油等天然產(chǎn)物提取，且提取效果較好。唐仕榮等[15]以余甘子干果粉作為實(shí)驗(yàn)材料，通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)探究了亞臨界水萃取余甘子多酚的提取條件，進(jìn)而利用響應(yīng)曲面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。得到最佳提取條件為：余甘子干果粉碎過40 目篩、純水80mL、液料比47∶1（mL∶g）、亞臨界萃取溫度212℃、提取時間11min，此時余甘子多酚的平均提取率為17.08%。李曉強(qiáng)等[16]采用5 種提取方法（亞臨界水提取法、溶劑提取法、微波-熱水提取法、微波提取法、超聲波提取法）對5 個產(chǎn)地（廣東、廣西、福建、云南、海南）的余甘子多酚進(jìn)行提取并比較其提取效果。結(jié)果表明，在不同產(chǎn)地中，產(chǎn)自云南的余甘子中多酚含量最高，可達(dá)345.24mg GAE·g-1，繼而選取云南余甘子，評估不同方法的提取效果，其中亞臨界水提取所得余甘子多酚含量最高，為387.33mg GAE·g-1。

亞臨界水萃取法具有無需利用有機(jī)溶劑且提取時間短、提取率高、價廉易操作等優(yōu)點(diǎn)，是極具開發(fā)潛力的綠色、高效提取技術(shù)。

2 測定方法

2.1 紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法是常見的光譜學(xué)測量方法，常用于多酚類成分的測定。亓旗等[17]采用三氯化鐵-鐵氰化鉀比色法，以沒食子酸為對照品，對余甘子提取物中總酚含量進(jìn)行測定。該方法平均回收率為101.57%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.65%。王宬研等[18]通過Folin-Ciocalteu 試劑比色法對余甘子的乙醇-水溶液提取物中的多酚含量進(jìn)行測定，樣品中總多酚含量為77.8%。

紫外-可見分光光度法具有操作簡便、靈敏準(zhǔn)確、儀器易得及降低檢測成本等優(yōu)點(diǎn)。

2.2 色譜法

液相色譜法具有高效高速、靈敏度高、易操作等優(yōu)點(diǎn)，也常用于多酚類成分的檢測。吳玲芳等[19]建立高效液相色譜法（HPLC）對8 個不同產(chǎn)地的余甘子藥材中的8 種成分（沒食子酸、安石榴苷B、沒食子酸甲酯、老鸛草素、柯里拉京、訶子林鞣酸、訶黎勒酸和鞣花酸）進(jìn)行含量測定。采用Diamonsil C18色譜柱（250×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.2%冰醋酸水溶液，檢測波長為270nm。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的余甘子藥材中主要成分含量具有一定差異，其中產(chǎn)自尼泊爾的余甘子所含的沒食子酸、訶黎勒酸和鞣花酸含量較高，產(chǎn)自印度的余甘子所含的安石榴苷B 和沒食子酸甲酯含量較高，而產(chǎn)自四川的余甘子所含老鸛草素含量最高。于濤等[20]建立超高效液相色譜法（UPLC）對余甘子中的沒食子酸和葡糖倍苷的含量進(jìn)行測定。采用CAPCELL PAK C18MG 色譜柱（150×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.2%乙酸水溶液，檢測波長為273nm。結(jié)果表明，兩種成分質(zhì)量濃度與峰面積在測定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為100.57%和99.22%。利用該方法對3 批中試規(guī)模加工獲得的余甘子原料藥進(jìn)行檢測，兩種成分含量之和均高于50%以上。所建立的方法可用于余甘子總酚原料的質(zhì)量控制。

2.3 多方法聯(lián)合測定

超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜（UPLCESI-QTOF-MS）聯(lián)用技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、高質(zhì)量精度等優(yōu)點(diǎn)，是復(fù)雜未知樣品中化學(xué)組成分析、鑒定的重要工具，為中藥質(zhì)量控制研究提供了高效地分析手段。Wu 等[21]建立UPLC-ESI-QTOF-MS方法對余甘子多酚提取物進(jìn)行分析，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100×2.1mm，1.7μm），流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈-0.1%甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，余甘子中含有大量的酚酸，主要包括15 種羥基苯甲酸和10 種羥基肉桂酸，例如沒食子酸、丁香酸、鞣花酸以及咖啡酸、綠原酸。

3 結(jié)語

我國余甘子資源豐富，多酚類化合物是余甘子的主要活性成分，且具有多種藥理活性，在預(yù)防及治療各種疾病方面已被廣泛應(yīng)用。因此，對余甘子中多酚類成分的提取工藝進(jìn)行探索及優(yōu)化具有重要的意義。目前，所應(yīng)用的提取方法均較為傳統(tǒng)，應(yīng)嘗試采用新技術(shù)，如超臨界提取、雙水相提取、低共熔溶劑提取等對余甘子多酚進(jìn)行高效提取。對于總酚含量的測定多選用紫外-分光光度法，而對于單一成分的測定則需要選擇準(zhǔn)確度、精密度較高的色譜法及聯(lián)用檢測技術(shù)。