尿素包合法提純亞麻籽油中α-亞麻酸工藝的優(yōu)化研究*

郝文來，郝 健

（深圳市誠致生物開發(fā)有限公司，廣東 深圳 518000）

亞麻籽（linseed）是草本植物亞麻的種子，紅棕色的果實(shí)外觀并且具有獨(dú)特的堅(jiān)果風(fēng)味[1，2]。亞麻籽的種植已有5000 多年的歷史，廣泛分布在世界各地，品質(zhì)上等的亞麻籽一般生在寒帶地區(qū)，例如加拿大的西北部等，在我國種植區(qū)域主要分布在甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、山西、黑龍江以及新疆等省份。亞麻籽的應(yīng)用非常廣泛，可以用于加工面包、酸奶或者谷物食品中，深受消費(fèi)者喜愛。亞麻籽以其自身豐富的營養(yǎng)成分逐漸引起了世界眾多學(xué)者的關(guān)注，關(guān)于它的研究也越來越深入。亞麻籽中含有約40%各類油脂、28%多種膳食纖維、20%蛋白質(zhì)和氨基酸,剩余12%的水分和灰分[3，4]。大量的實(shí)驗(yàn)研究和臨床表現(xiàn)證實(shí)了亞麻籽對于人體健康和各項(xiàng)機(jī)能提升大有裨益，尤其是對于孕婦、嬰幼兒、“三高”人士。其主要的功效有降低血脂、減輕心臟負(fù)荷、促進(jìn)大腦發(fā)育、改善便秘、改善腎功能等，亞麻籽油的功效更是被人稱為“深海魚油”[4-6]。

亞麻籽油中含有豐富的多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及包合脂肪酸，其中α-亞麻酸（ALA）的含量可以占到亞麻籽油的53%[7]。Ω-3 多不飽和脂肪酸以α-亞麻酸為母體，是組成人體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要成分，也是細(xì)胞進(jìn)行正常新陳代謝必不可少的營養(yǎng)成分，是人體所必須的脂肪酸。亞麻籽油中的α-亞麻酸含量遠(yuǎn)高于其他的核桃油、花生油、大豆油等植物油，對于很多素食者而言，亞麻籽油成為了身體獲取Ω-3 多不飽和脂肪酸的一個(gè)非常重要的途徑[4，8]。

現(xiàn)階段，對α-亞麻酸的分離方法有很多種，常見的主要有色譜柱法、分子蒸餾法以及尿素包合法等[3，9-11]。色譜柱法主要用于少量的樣品分離和測試，對于大規(guī)模的放大生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)非常局限。分子蒸餾法容易造成產(chǎn)品純度不夠，產(chǎn)品中雜質(zhì)混合較多，大大影響產(chǎn)品品質(zhì)。尿素包合法具有投資小、工藝簡單的優(yōu)勢，非常適用于α-亞麻酸提純[4，5，12，13]。本文就以尿素包合法對提純亞麻籽油中的α-亞麻酸開展工藝研究。α-亞麻酸提取率最高可達(dá)81%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑和儀器

亞麻籽油（一級 錫林郭勒盟紅井源油脂有限責(zé)任公司），產(chǎn)品符合GB/T 8235-2019 涉及的特征指標(biāo)、質(zhì)量等級指標(biāo)及污染物限量等。

α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.50% 北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司）；甲醇、乙酸，色譜純，上海國藥供應(yīng)有限公司；石油醚（沸程60～90℃AR 東莞市大偉化工有限公司）；無水乙醇、KOH、HCl 溶液、甲醇、無水Na2SO4、尿素，均為分析純，鄭州博邦化工產(chǎn)品有限公司。

1200 型高效液相色譜儀（匹配兼容安捷倫的索福達(dá)M100 蒸發(fā)光散射檢測器 安捷倫）；R-1005 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（濟(jì)南禾普儀器設(shè)備有限公司）；MS204S型電子天平（梅特勒托利多）；SHJ-A6 型恒溫水浴鍋（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DHG-9070A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHZ-95B 型循環(huán)水式真空泵配套抽濾漏斗等抽濾系統(tǒng)（上海予華儀器設(shè)備有限公司）；錐形瓶、燒杯等玻璃陶瓷儀器（泰州市辰陽教學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞麻籽游離脂肪酸的制備 首先，制備濃度為1mol·L-1的KOH-乙醇溶液，然后將亞麻籽油與其按照1∶5 的體積比進(jìn)行混合，在80℃的恒溫水浴鍋中回流45min，在冷卻至室溫的混合液中加入一定量的去離子水進(jìn)行溶解，之后加入石油醚對其中不能皂化的部分萃取除去。取分層后的下層溶液，使用濃度為20%的HCl 溶液對其進(jìn)行酸化處理，并將溶液pH 值調(diào)節(jié)至2～3，然后將石油醚緩慢加入溶液中，同時(shí)開始攪拌混勻，再將溶液移至分液漏斗，待其充分靜置分層。分層后，將上層的有機(jī)相溶液從分液漏斗中倒出，對下層的溶劑繼續(xù)使用石油醚連續(xù)萃取至少3 次，將多次萃取的有機(jī)相合并待用。用5%的NaCl 水溶液對有機(jī)相洗至中性，再加入無水Na2SO4脫除有機(jī)相中所含有的水分，在溫度為55℃的條件下通過對濾液進(jìn)行旋蒸，對其中的石油醚進(jìn)行充分回收，最終從亞麻籽油中得到混合脂肪酸。

1.2.2 亞麻籽α-亞麻酸尿素包合方法 稱量一定質(zhì)量尿素和一定體積的乙醇，充分混合溶解，將一定濃度的尿素-乙醇溶液按照特定比例與已制備的亞麻籽油脂肪酸混合，置于60℃水浴鍋中充分?jǐn)嚢杌旌现敝脸尸F(xiàn)透明狀態(tài)。隨后，在不同包合溫度下設(shè)定不同時(shí)間進(jìn)行包合反應(yīng)。連接真空泵及抽濾設(shè)備，對混合液進(jìn)行抽濾處理以分離出其中的尿素結(jié)晶包合物，并得到剩余濾液。將一定量的石油醚加入到剩余濾液中，并用10%的HCl 調(diào)節(jié)濾液的pH 值至2～3，加入一定量的去離子水，保證萃取充分，分層取出有機(jī)相，多次重復(fù)萃取過程，將得到的有機(jī)相合并。將合并的有機(jī)相用5% NaCl 多次清洗，直至pH 值呈中性，用一定量的無水Na2SO4脫除去有機(jī)相殘留的水分，在溫度為50℃的條件下，對有機(jī)相進(jìn)行旋蒸，以獲取高濃度的α-亞麻酸。。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 依據(jù)1.2.2 中的提取方法，分別對尿素溶液與脂肪酸體積比、包合溫度、包合時(shí)間、尿素溶液濃度等多組變量因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，分析每個(gè)變量因素對α-亞麻酸提純率的影響。

1.3 α-亞麻酸含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱及其參數(shù) C18色譜柱填料，250mm×2.6mm，填充顆粒直徑5μm。

流動相參數(shù) 甲醇∶1%乙酸溶液體積比為90∶10，流動速率為1mL·min-1；色譜柱溫度為30℃；檢測波長為205nm；進(jìn)樣量為20μL。

蒸發(fā)光散射檢測儀參數(shù) 索福達(dá)M100，載氣流速為2L·min-1，漂移管溫為75℃。

1.3.2 α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱取10mg α-亞麻酸于10mL 容量瓶中，并用甲醇溶液定容到容量瓶刻度線，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)α-亞麻酸溶液濃度為1mg·mL-1。然后分別用移液槍移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)α-亞麻酸溶液于10mL 的容量瓶中，再用甲醇溶液定容至容量瓶刻度線，得到α-亞麻酸溶液濃度分別為0.01、0.002、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜測定，用濃度和α-亞麻酸色譜圖峰強(qiáng)度進(jìn)行作圖，通過Origin 9.1 進(jìn)行擬合，擬合數(shù)據(jù)見表1和圖1，擬合方程：Y=1.563X+330.658，相關(guān)系數(shù)R2=1，X 為標(biāo)準(zhǔn)α-亞麻酸溶液濃度，Y 為峰面積。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)α-亞麻酸溶液濃度和峰面積線性擬合Fig.1 Standards α-Linear fitting of concentration and peak area of α-linolenic acid solution

表1 標(biāo)準(zhǔn)α-亞麻酸溶液濃度和峰面積關(guān)系Tab.1 Relationship between concentration and peak area of standard α-linolenic acid solution

1.4 α-亞麻酸含量測定

使用梅特勒托利多分析天平準(zhǔn)確稱取待測樣品0.1000g 加入到100mL 錐形瓶中，加入0.5mol·L-1的堿性甲醇溶液30mL，震蕩均勻，將錐形瓶封存嚴(yán)密，在60℃水浴鍋條件下對混合液充分震蕩40min，保證其充分混合。將錐形瓶取出，靜置冷卻至室溫，滴加一定量的HCl 溶液將pH 值調(diào)節(jié)至中性，將溶液整體轉(zhuǎn)移至250mL 容量瓶中，用色譜純度甲醇定容備用。移液管精確移取1.00mL 上述溶液至10mL 容量瓶并用色譜純甲醇定容，用10mL 注射器吸取一定量的溶液，通過過濾膜后將液體打入進(jìn)樣瓶。在上述制定的色譜設(shè)備和參數(shù)條件下，對樣品進(jìn)行液相色譜測定和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 混合脂肪酸與尿素溶液體積比對α-亞麻酸提取率的影響 采用尿素-乙醇濃度為0.9mol·L-1，包合溫度為-20℃，包合時(shí)間20h，考察脂肪酸和尿素的體積比分別為1∶5、1∶25、1∶45、1∶65、1∶85 對提純α-亞麻酸的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 脂肪酸與尿素溶液體積比對α-亞麻酸提取率的影響Fig.2 Effect of the volume of fatty acid to urea solution on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖2 可見，隨著脂肪酸與尿素溶液的體積比增大，α-亞麻酸的提取率先增大后減小，脂肪酸和尿素的體積比1∶5、1∶25、1∶45、1∶65、1∶85 分別對應(yīng)10%、62%、75%、60%、49%的提取率。當(dāng)脂肪酸與尿素的體積比為1∶45 時(shí)，α-亞麻酸的的提取率最大，為75%。當(dāng)脂肪酸與尿素體積比過小時(shí)，脂肪酸反應(yīng)不完全，脂肪酸過量，α-亞麻酸提取率過低。當(dāng)脂肪酸和尿素的體積比過大，尿素過量影響與脂肪酸的包埋效果，從而也會影響α-亞麻酸的提取率。因此，綜合考慮，確定最佳的脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45。

2.2.2 尿素-乙醇溶液濃度對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45，包合溫度為-20℃，包合時(shí)間20h，考察尿素-乙醇溶液濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol·L-1對α-亞麻酸提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同尿素-乙醇溶液濃度對α-亞麻酸提取率的影響Fig.3 Effect of different urea ethanol solution concentrations on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖3 可見，隨著尿素-乙醇溶液濃度增大，α-亞麻酸提取率先增大后減小，尿素-乙醇溶液濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol·L-1，α-亞麻酸的提取率分別為50%、59%、65%、69%、78%、73%、66%，當(dāng)尿素-乙醇溶液濃度為1.0mol·L-1時(shí)，α-亞麻酸提取率最大，為78%。當(dāng)尿素-乙醇溶液濃度較低時(shí)，尿素含量較少，尿素的溶解性好，因此，隨著尿素-乙醇溶液濃度增大，α-亞麻酸提取率增大，當(dāng)尿素-乙醇溶液超過1mol·L-1后，溶液幾乎呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，當(dāng)尿素-乙醇濃度繼續(xù)增加，尿素溶解率下降，從而影響包合效果，造成α-亞麻酸提取率下降。因此，綜合考慮，確定最佳尿素-乙醇溶液濃度為1.0mol·L-1。

2.2.3 包合溫度對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45，包合時(shí)間20h，尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1，考察包合溫度-25、-15、-5、10、15、20、35℃對提純α-亞麻酸的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同包合溫度對α-亞麻酸提取率的影響Fig.4 Effect of different inclusion temperatures on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖4 可見，隨著包合溫度的增加，α-亞麻酸提取率下降，包合溫度-25、-15、-5、10、15、20、35℃分別對應(yīng)α-亞麻酸提取率為79%、78%、70%、62%、57%、50%。當(dāng)溫度超過-15℃后，α-亞麻酸提取率迅速下降，溫度為25℃時(shí)，α-亞麻酸提取率僅為50%?？梢钥闯鰷囟仍降驮接欣谀蛩氐陌希珳囟冗^低，一方面能耗增加，另一方面實(shí)驗(yàn)室常用的冰箱冷藏溫度僅為-20℃，因此，綜合考慮，確定最佳包合溫度為-15℃。

2.2.4 包合時(shí)間對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素體積比為1∶45，包合溫度-15℃，尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1。考察包合時(shí)間12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h 對提純α-亞麻酸的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同包合時(shí)間對α-亞麻酸提取率的影響Fig.5 Effect of different inclusion time on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖5 可見，隨著包合時(shí)間的增加，α-亞麻酸提取率先增大后減小，包合時(shí)間12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h 對應(yīng)的α-亞麻酸提取率為58%、67%、81%、76%、71%、67%、63%、62%、62%、61.8%、62%。當(dāng)包合時(shí)間為24 h 時(shí)，α-亞麻酸提取率最大，為81%。當(dāng)包合時(shí)間超過24h 后，α-亞麻酸提取率下降，但當(dāng)時(shí)間超過48h 后，α-亞麻酸提取率維持不變。因此，綜合考慮，確定最佳包合時(shí)間為24h。

2.3 α-亞麻酸液相色譜圖分析

以脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45、包合溫度為-15℃、包和時(shí)間24h、尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1對亞麻酸進(jìn)行提純。α-亞麻酸的液相色譜圖見圖6。

圖6 α-亞麻酸的液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography of α-linolenic acid

α-亞麻酸在12.5min 出峰，符合α-亞麻酸的出峰位置。

3 結(jié)論

（1）以亞麻籽油為原料，α-亞麻酸為提取目標(biāo)產(chǎn)物，采用單因素法研究了不同脂肪酸與尿素溶液體積比、尿素-乙醇溶液濃度、包合溫度、包合時(shí)間對α-亞麻酸提取率的影響，優(yōu)化了α-亞麻酸提取工藝，并采用液相色譜對提純的α-亞麻酸進(jìn)行了表征。

（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳實(shí)驗(yàn)條件下，濃度為1mol·L-1的尿素-乙醇溶液、脂肪酸與尿素溶液的體積比為1∶45、包合溫度為-15℃、包合時(shí)間為24h 時(shí)，α-亞麻酸提取率最高可達(dá)81%。

（3）通過液相色譜對提純的α-亞麻酸進(jìn)行表征，α-亞麻酸在12.5min 出峰，符合α-亞麻酸的出峰位置。