側(cè)孢短芽孢桿菌和中藥對(duì)綿羊腸道線蟲的影響及應(yīng)用

王 巖，秦淑杰，李洪根，李 娟，于洪敏，王 剛，劉 艷,★，單春喬★

（1.大連三儀動(dòng)物藥品有限公司 116036；2.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心 221300；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心110003）

隨著我國經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模逐漸擴(kuò)大，由于綿羊肉的營養(yǎng)價(jià)值較高，環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，從家庭散養(yǎng)式向規(guī)?；?、集成化發(fā)展，但在養(yǎng)殖中，不可避免地受到寄生蟲的侵害。綿羊易感染球蟲、線蟲、絳蟲和肝片吸蟲，會(huì)對(duì)機(jī)體造成感染，帶來一系列危害[1-2]。目前驅(qū)蟲方法主要有化學(xué)合成藥品 （伊維菌素、丙硫咪唑、多拉菌素、氯氰碘柳胺鈉、左旋咪唑等）、抗生素、中藥材、外用殺蟲劑和消毒劑等[3-4]，其中中藥由于毒副作用小、不容易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)越來越受到關(guān)注[5]，中藥對(duì)綿羊驅(qū)蟲研究漸多[6-8]。此外，側(cè)孢芽孢桿菌菌株可通過產(chǎn)生細(xì)菌毒素接觸控制宿主動(dòng)物中的線蟲，該毒素能夠抑制線蟲卵的孵化和/或幼蟲的發(fā)育[9]，目前研究較多的是側(cè)孢芽孢桿菌的蛋白酶對(duì)植物線蟲的殺蟲作用，其代謝物酶等對(duì)動(dòng)物寄生性線蟲作用還較少研究。本實(shí)驗(yàn)從中藥、側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)綿羊寄生線蟲的影響研究出發(fā)，分析其影響規(guī)律，并開展應(yīng)用配伍實(shí)驗(yàn)，為綿羊選擇更好的驅(qū)蟲方式。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵罐發(fā)酵菌液、中藥均由大連三儀動(dòng)物藥品有限公司提供，共5 份樣品，分別為側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵液、側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵液上清液、5%中藥、10%中藥、側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵液和終濃度10%中藥配伍，中藥主要成分為常山、白頭翁等，121℃，20 min 滅菌后使用。

1.1.2 試劑與材料

氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉和氯化鈣均來源于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。碘化鉀和碘來源于天津市大茂化學(xué)試劑廠。試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水。

飽和鹽水配制：將400 g 食鹽在1000 mL 沸水中溶解，制成飽和鹽溶液，冷卻后備用。配置Earle’s 平衡液和魯哥氏(Lugol’s)溶液[10]。

1.1.3 設(shè)備

分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、光學(xué)顯微鏡（NIKON 100，沈陽儀豐鋮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、生物安全柜（Hfsafe 1200LC，上海力申科學(xué)儀器有限公司）、離心機(jī)（TG16-WS，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱 （BXS-250S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板（廈門登訊儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟲卵孵化實(shí)驗(yàn)

蟲卵收集：利用飽和鹽水漂浮法收集蟲卵，將糞樣加入飽和鹽水充分粉碎，紗布過濾，濾液倒入1000 mL燒杯，漂浮30 min 后，用吊環(huán)取一環(huán)于載玻片，蓋上蓋玻片計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后取10 mL Earle’s 平衡液反復(fù)將載玻片和蓋玻片上的蟲卵洗入小燒杯，直至10 mL 無菌水中含有5000 個(gè)蟲卵[10]。

蟲卵孵育：將24 孔培養(yǎng)板按列（4 孔）分為5 組編號(hào)，其中第6 組為對(duì)照組，每孔添加200 μL Egerl’s液、400 μL Egerl’s 液蟲卵懸浮液（約含200 個(gè)蟲卵）；第1 至第5 組每孔依次加入5 種樣品各200 μL、400 μL Egerl’s 液（約含200 個(gè)蟲卵），每組2 個(gè)平行。

孵育后計(jì)數(shù)：48 h 后用Lugol 氏液終止孵化，計(jì)數(shù)已孵出的幼蟲數(shù)和未孵化的蟲卵數(shù)，計(jì)算孵化率和蟲卵抑制率。

1.2.2 側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配置中藥終濃度為10%的中藥、側(cè)孢短芽孢桿菌混合液，室溫靜止放置，每24 h 取樣進(jìn)行涂布活菌計(jì)數(shù)。

1.2.3 綿羊驅(qū)蟲實(shí)驗(yàn)

針對(duì)蟲卵孵化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)寄生蟲影響較大的樣品進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。具體為于河北省張家口市張北縣圣達(dá)養(yǎng)殖場選取未做驅(qū)蟲、散養(yǎng)為主要飼養(yǎng)方式的羊群進(jìn)行試驗(yàn)，年齡在1.5～2.5 歲。

試驗(yàn)選取前期確定的寄生蟲感染陽性羊120 只，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組60 只。于給藥前0 d、給藥后第4 d、第7 d 和第14 d 隨機(jī)取若干只羊取糞便并計(jì)數(shù)每克糞便中蟲卵數(shù) （eggs per gram，EPG）；同時(shí)進(jìn)行第二次給藥。

給藥具體過程：實(shí)驗(yàn)場地有三個(gè)飲水槽，每個(gè)飲水槽放50 L 水，每個(gè)水槽加產(chǎn)品30 mL，首先放15 只羊進(jìn)去自由飲水，最后剩約10 L 左右的水，再蓄滿，繼續(xù)加產(chǎn)品20 mL，讓另15 只羊進(jìn)來飲水。以此類推，直至全部完成飲水，對(duì)照組給予同產(chǎn)品等量的生理鹽水。

1.2.4 鏡檢寄生蟲判定

飽和鹽水處理的糞便，于載玻片或麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)板上觀察蟲卵形態(tài)特點(diǎn)，鑒定寄生蟲蟲卵[3]。

1.2.5 綿羊糞便寄生蟲檢測(cè)

糞便采集后置于冷藏箱，快遞2 d 內(nèi)寄到實(shí)驗(yàn)室，立即展開實(shí)驗(yàn)。采用飽和水漂浮法分離寄生蟲，采用麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)法對(duì)感染陽性糞便進(jìn)行計(jì)數(shù)，每克糞便蟲卵數(shù)（EPG）計(jì)算公式為：

N1、N2：麥克馬斯特兩個(gè)計(jì)數(shù)室蟲卵數(shù)；

60：總體積60 mL；

0.15：計(jì)數(shù)室體積，1 cm×1 cm×0.15 cm；

m：稱樣質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用EXCEL 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 21 數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)孢短芽孢桿菌、中藥對(duì)蟲卵孵化的影響

側(cè)孢短芽孢桿菌、中藥對(duì)蟲卵孵化的影響如表1 所示，對(duì)照組、5%和10%中藥組存在幼蟲孵化，其中對(duì)照組孵化率最高，為18.67%，其次是5%中藥組。10%中藥組孵化率比5%中藥組低說明中藥具有一定抑制蟲卵孵化作用。含有側(cè)孢短芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組沒有幼蟲孵化，表明該菌株有抑制蟲卵孵化的作用。

表1 側(cè)孢短芽孢桿菌、中藥對(duì)蟲卵孵化影響的結(jié)果

由蟲卵抑制率可知，對(duì)照組出現(xiàn)36.88%抑制率，由于對(duì)照組為孵化液，此值代表了蟲卵自然死亡率。與對(duì)照組相比，5%中藥組抑制蟲卵發(fā)育、生長能力最低，其次是10%中藥組、發(fā)酵液上清組。發(fā)酵液組、發(fā)酵液和10%中藥配伍組差異性不大，但發(fā)酵液和10%中藥配伍組能力最強(qiáng)，表明起到了一個(gè)協(xié)同增效作用，排除自然死亡率影響后，實(shí)際抑制率為59.21%。

由發(fā)酵液上清和發(fā)酵液的抑制能力，初步可分析抑制能力物質(zhì)來源，發(fā)酵液上清主要為菌株代謝產(chǎn)物，包括蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液中除以上成分外還包括菌體蛋白及孢子等，發(fā)酵液蟲卵抑制率為87.38%，發(fā)酵液上清為82.67%，發(fā)酵液的抑制能力較上清液強(qiáng)，表明發(fā)酵液中起抑制作用物質(zhì)較多，但上清液抑制能力比發(fā)酵液稍低，因此上清液物質(zhì)起主要作用，即代謝產(chǎn)物蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等代謝產(chǎn)物，其次是菌體蛋白及孢子等。

2.2 10%中藥對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)的影響

從表2 可看出，配伍菌株活菌數(shù)為1.57×109CFU/mL，96 h 內(nèi)10%中藥對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)無影響，中藥未體現(xiàn)對(duì)該菌株的殺菌、抑菌作用，配伍應(yīng)用不會(huì)影響菌株對(duì)寄生蟲的作用效果。同時(shí)菌株未增加或減少，說明產(chǎn)品較穩(wěn)定。

表2 10%中藥對(duì)側(cè)孢短芽孢桿菌活菌數(shù)影響的結(jié)果

2.3 側(cè)孢短芽孢桿菌配伍中藥對(duì)綿羊寄生蟲的影響

側(cè)孢短芽孢桿菌配伍10%中藥對(duì)綿羊感染寄生蟲的影響如表3 所示，由陽性率可知，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組陽性率呈逐漸降低趨勢(shì)，第14 d 降到10%，陽性率降低90%。由平均感染強(qiáng)度可知，實(shí)驗(yàn)組也呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，與給藥前（0 d）相比，降低約87.74%，而對(duì)照組總體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。

表3 側(cè)孢短芽孢桿菌配伍中藥對(duì)綿陽驅(qū)蟲結(jié)果

2.4 鏡檢蟲卵

線蟲和孵化幼蟲如圖1 所示，采用飽和鹽水法收集的蟲卵和臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的蟲卵基本都是線蟲，主要為細(xì)頸線蟲卵，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲卵和食道口線蟲，孵化的幼蟲為蟲卵孵化篩選實(shí)驗(yàn)中孵化得到。

圖1 綿羊線蟲卵及幼蟲（顯微鏡10 x 40）

3 討論

胃腸道寄生蟲感染是反芻動(dòng)物生產(chǎn)的重要制約因素之一，化學(xué)藥物的預(yù)防和控制造成了寄生蟲抗藥性的增加，再加上某些農(nóng)作物可以從施用于土壤的牲畜糞便中吸收抗生素，這對(duì)人類健康有影響，新的控制寄生蟲方法急需研究。

微生物殺蟲劑作為活的有機(jī)體或其產(chǎn)品或副產(chǎn)品，是一種具有目標(biāo)特異性的環(huán)境友好型替代品，通過對(duì)害蟲的致病性來控制它們。芽孢桿菌科的研究最多的是蘇云金芽孢桿菌。除此之外，還有一些細(xì)菌被報(bào)道為有效的生物防治，如球形芽孢桿菌、日本金龜芽孢桿菌、緩病芽抱桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌等。Zheng 等[11]收集了30 個(gè)種共120 株芽孢桿菌和類芽孢桿菌，研究表明蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、球形賴氨酸芽孢桿菌、側(cè)孢短芽孢桿菌和短芽孢桿菌具有很強(qiáng)的殺線蟲活性，由基因組測(cè)序分析推導(dǎo)出了四種可能的機(jī)制，包括晶體蛋白的成孔機(jī)制，蘇云金素抑制類似的機(jī)制和蛋白酶和/或幾丁質(zhì)酶的降解機(jī)制，不同家族的120 種產(chǎn)芽孢桿菌均具有可能有助于其殺線蟲能力的毒力因子，每個(gè)菌株平均有10 個(gè)假定的毒力因子。

其中側(cè)孢短芽孢桿菌是一種無脊椎動(dòng)物病原體和抗菌物種，其形態(tài)特征是典型的孢子被牢固附著的獨(dú)木舟狀副孢體包圍，其全基因組測(cè)序揭示了它產(chǎn)生聚酮化合物、非核糖體肽和毒素的潛力，被列入用于哺乳動(dòng)物和鳥類的益生菌，以及從中提取的特定抗生素已在醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。生物防治研究領(lǐng)域研究有蠅、蚊子、鞘翅目害蟲和線蟲等無脊椎動(dòng)物。對(duì)線蟲作用機(jī)制研究有兩種，即堿性蛋白酶BLG4 殺線蟲和低分子量(2900 Da) 蛋白質(zhì)殺線蟲[18]。堿性蛋白酶殺線蟲主要研究在植物方面，動(dòng)物寄生性線蟲研究較少。低分子量蛋白對(duì)牛腸道線蟲作用效果研究表明，側(cè)孢芽孢桿菌殺線蟲的毒素是孢子提取物，它的特點(diǎn)是溶菌酶可增強(qiáng)其活性，加熱也可增加其殺傷力[9]，有研究表明孢子表面蛋白是一組復(fù)雜的毒素和毒力因子的一部分。

本次蟲卵孵化實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果稍有不同，菌株發(fā)酵液與上清液抑制蟲卵孵化的能力沒有顯著性差異，但發(fā)酵液抑制能力稍強(qiáng)，表明該菌起主要作用的不是孢子，極有可能是胞外分泌物，如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶或其他代謝物等，孢子作用次之。對(duì)其堿性蛋白酶酶活進(jìn)行檢測(cè)，酶活約為756 U/mL（發(fā)酵罐發(fā)酵約45 h，根據(jù)GB/T 23527-2009 方法檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.01X+0.0054，R2=0.9996），高于郭菁[12]等研究的620 U/mL，具體起到抑制蟲卵孵化作用的物質(zhì)需要進(jìn)行酶純化或代謝物分析、提取后去驗(yàn)證。

除對(duì)無脊椎動(dòng)物的致病性外，側(cè)孢短芽孢桿菌還表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌和真菌廣譜抗菌活性。飼喂芽孢桿菌可以增加雛雞體重和抑制病原菌生長，側(cè)孢短芽孢桿菌以106孢子/g 成品飼料飼喂雛雞，可以顯著減少盲腸沙門氏菌。于道德等[13]研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌能夠促進(jìn)對(duì)蝦生長、激活免疫系統(tǒng)、提高抗病力、抑制周圍環(huán)境弧菌生長，推薦對(duì)蝦養(yǎng)殖飼料中使用量為105CFU/g。

植物產(chǎn)品或中藥材也可控制寄生蟲，減少土壤中的抗生素污染，減少某些寄生蟲中正在形成的抗菌素耐藥性。如從大蒜、五倍子、青蒿、棕櫚花、仙鶴草、石榴等植物中提取物能對(duì)寄生蟲引起的氧化應(yīng)激表現(xiàn)出保護(hù)作用，杜松和黃松對(duì)體內(nèi)寄生蟲治療有效，英屬哥倫比亞省用艾草、蒲公英、異株蕁麻和牛蒡等藥用植物治療兔和家禽體內(nèi)、體外寄生蟲。在我國中藥控制寄生蟲的研究較多，復(fù)方中藥中常山應(yīng)用的最多，常山堿是有效抗球蟲成分[14]，其次是白頭翁，白頭翁總皂苷對(duì)體外不同發(fā)育階段的日本血吸蟲有殺滅效果[15]，對(duì)球蟲的孢子化抑制效果較好[16]。宮新城等[17]研究表明青蒿、常山、秦皮、鴉膽子、白頭翁、地錦草、仙鶴草、金雞納和黃芪組成的中藥方劑通過抑制球蟲孢子化，殺滅球蟲。李峰等[18]用中藥組成的蒙獸藥方劑驅(qū)蟲研究表明，每日飼喂育肥羔羊至出欄，有明顯驅(qū)蟲效果，對(duì)寄生蟲重度感染的羊連續(xù)飼喂21 d 也表現(xiàn)出良好的驅(qū)蟲效果。韓楠等[19]研究表明常山、苦參等中藥與芽孢桿菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌組成的中草藥微生態(tài)制劑對(duì)羊球蟲病治療具有較好效果，還可提高免疫力。由蟲卵孵化實(shí)驗(yàn)可知，中藥對(duì)綿羊寄生蟲有顯著的抑制作用，與側(cè)孢短芽孢桿菌配伍后，可以提高抑制能力，動(dòng)物驅(qū)蟲實(shí)驗(yàn)表明使用中藥與菌株配伍產(chǎn)品后較使用前有明顯的驅(qū)蟲效果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)蟲卵孵化有抑制作用，發(fā)酵液與發(fā)酵液上清對(duì)蟲卵孵化有顯著性差異，發(fā)酵液強(qiáng)于發(fā)酵液上清，根據(jù)發(fā)酵液及上清成分推測(cè)主要起作用物質(zhì)為菌株代謝產(chǎn)物蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等，目前有關(guān)側(cè)孢短芽孢桿菌蛋白酶對(duì)線蟲的殺蟲研究主要集中在植物線蟲，該研究表明菌株代謝物對(duì)動(dòng)物腸道線蟲也同樣具有毒力作用。不同濃度中藥對(duì)蟲卵孵化有顯著性差異，10%濃度具有更強(qiáng)的抑制能力。側(cè)孢短芽孢桿菌和中藥配伍后起到協(xié)同增效，增強(qiáng)抑制能力的作用，用于臨床實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了配伍后具有對(duì)綿羊寄生蟲的驅(qū)蟲作用，側(cè)孢短芽孢桿菌和中藥對(duì)綿羊寄生蟲治療具有較好效果。