釀酒酵母Y-8對發(fā)酵香腸品質與風味的影響

范鑫洋，張香美，劉程鵬，紀錫偉，車 淇

（河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061）

近年來，隨著消費者綠色健康觀念的增強，發(fā)酵香腸逐漸趨向于低鹽、低脂化，但此類發(fā)酵香腸存在香氣缺陷[1]。酵母菌作為一種潛在的生香菌株，能將糖等有機物轉化成乙醇、CO2以及一系列芳香化合物[2]，接種到發(fā)酵香腸中可以改善其香氣和口感[3]。Flores等[4]發(fā)現(xiàn)，酵母菌在香腸發(fā)酵過程中能夠消耗乳酸，提升發(fā)酵香腸pH值并產(chǎn)生酯類化合物，有助于增強發(fā)酵香腸的果味與腌制香味；Lü Jing等[5]研究表明，酵母菌的添加可以改善由傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵肉制品造成的滋味過酸、香氣缺陷及感官品質不佳等問題；Panda等[6]認為，酵母菌主要通過發(fā)酵改善食品質地、提高產(chǎn)品營養(yǎng)價值。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）常作為乙醇類飲料和面包的發(fā)酵劑，具有脂解活性、蛋白水解活性，可以產(chǎn)生醇、酯等風味化合物，具有作為肉類發(fā)酵劑的潛力，已報道的適用于肉類發(fā)酵的釀酒酵母菌株有Y70[1]、LXPSC1[5]等。本研究擬將分離自發(fā)酵面團的釀酒酵母Y-8接種到發(fā)酵香腸中，探究其對發(fā)酵香腸品質和風味的影響，為釀酒酵母在發(fā)酵香腸中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉 石家莊市雙鴿集團；菌種：植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）Z43、釀酒酵母Y-8由河北經(jīng)貿(mào)大學生物科學與工程學院益生菌研究室分離并保存。

恒康精制天然豬腸衣（直徑25 mm）北京京東世紀貿(mào)易有限公司；YPD液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；MRS培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

759CKT紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；CM-700d1分光測色計 日本柯尼卡美能達公司；LE427 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CT3質構儀 美國博勒飛有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；FlavourSpec?風味分析儀德國G.A.S公司；Trace ISQ氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵香腸的制作

工藝流程：原料肉處理→加入調味品→攪拌均勻→接入發(fā)酵劑→攪拌均勻→灌腸→發(fā)酵→成品。

分別將活化好的植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種到MRS和YPD液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。然后于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌3 次后重懸[7]。

發(fā)酵香腸制作方法及配方參考裴正鈺[8]的方法。實驗共分4 組：CK組接種植物乳植桿菌Z43；A組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為20∶1；B組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為10∶1；C組植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例為5∶1。其中，植物乳植桿菌Z43接種量均為107CFU/g。將制作完成的發(fā)酵香腸置于37 ℃發(fā)酵3 d。

1.3.2 發(fā)酵香腸感官評價

參考曹辰辰等[9]的方法并作修改。對不同組別的發(fā)酵香腸進行感官評定，選取10 名經(jīng)過專業(yè)培訓的人員組成評定小組，隨機對各組別發(fā)酵香腸進行品嘗。分別從顏色、氣味、組織狀態(tài)和滋味4 個方面對樣品進行感官評價。具體評分標準見表1。

表1 發(fā)酵香腸感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented sausages

1.3.3 發(fā)酵香腸pH值測定

取發(fā)酵0、1、2、3 d的各組發(fā)酵香腸，利用pH計進行測定。

1.3.4 發(fā)酵香腸色度測定

參考曹辰辰[10]的方法并稍作修改。將發(fā)酵結束后的發(fā)酵香腸切成直徑2 cm、厚度1 cm的平整圓柱體，利用校準后的色差儀進行色度測定，記錄亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。每組樣品做3 個平行實驗。色度值（C）按下式計算[11]：

1.3.5 發(fā)酵香腸質構測定

參考文港等[12]的方法稍作修改。取發(fā)酵結束后的發(fā)酵香腸，切成厚度與直徑均為2 cm的平整圓柱體，質構儀選取TA3/100圓柱形探頭與TA-RT-KIT夾具，運行速率1 mm/s、觸發(fā)點負載10 g、壓縮度30%、等待時間0 s，測定硬度、彈性、膠著性和咀嚼性。每個樣品重復測定3 次。

1.3.6 發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)測定

參照GB 4789.41—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》[13]。

1.3.7 發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質測定

使用風味分析儀進行揮發(fā)性風味物質測定。取3.0 g樣品置于20 mL頂空瓶中，在60 ℃條件下，以500 r/min的轉速孵育20 min后進樣。頂空進樣單元的設定條件為：進樣體積200 μL、進樣針溫度85 ℃。每組發(fā)酵香腸平行測定3 次。

GC相關參數(shù)為：WAX色譜柱（30 m×0.53 mm，1 μm），色譜柱溫度60 ℃；離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）溫度為45 ℃，載氣為N2，分析時間30 min，載氣起始流速為2 mL/min，10 min時增至10 mL/min，20 min時增至100 mL/min，直至分析結束。

采用C4～C9正構酮為標準品進行定性。

1.3.8 發(fā)酵香腸脂肪酸組成測定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[14]中的方法稍作修改。

色譜條件：TG-FAME色譜柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度120 ℃，保持1 min；以7 ℃/min升溫至198 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至230 ℃。

質譜條件：電子電離源，電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，全掃描模式，質量掃描50～500 au，溶劑延遲3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS Statistics 26軟件進行顯著性分析，用GraphPad_Prism_8.0.2.263軟件進行作圖。利用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（principal components analysis，PCA）與正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸感官評價的影響

由圖1可知，接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發(fā)酵香腸的氣味評分均高于CK組（7.07）。A組的滋味（8.60）、組織狀態(tài)（8.51）、氣味（8.63）與顏色（8.86）的感官評分均高于其余3 組。隨釀酒酵母Y-8接種量的增加，滋味與組織狀態(tài)的評分逐漸降低。推測是因為釀酒酵母Y-8接種量過大導致產(chǎn)氣過多，從而使組織狀態(tài)變差，滋味也受到一定影響。接種釀酒酵母Y-8可以改善發(fā)酵香腸的香氣，但接種過量釀酒酵母Y-8可能會影響發(fā)酵香腸的滋味與組織狀態(tài)。植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8以20∶1比例復配發(fā)酵香腸色澤鮮亮、肉餡鮮紅、切面較為緊實、無明顯酸味、滋味與氣味評分最高，且綜合評分（34.6）最佳。

圖1 不同發(fā)酵香腸感官評價Fig.1 Sensory evaluation results of different fermented sausages

2.2 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸pH值的影響

由圖2可知，在發(fā)酵0～2 d過程中，各組發(fā)酵香腸pH值呈下降趨勢；在發(fā)酵2～3 d過程中，A、B組pH值有所上升。這與Lü Jing[5]、Flores[4]等研究結果一致，發(fā)酵后期pH值的升高可能與酵母菌通過同化作用消耗有機酸有關。在發(fā)酵1 d時，A、B組的pH值迅速降低至5.0以下，然后緩慢下降。Flores等[15]研究認為，較低的pH值可以抑制有害細菌生長，有助于保持產(chǎn)品安全性并延長保質期。A、B、C組樣品在發(fā)酵結束時pH值均高于CK組，接種釀酒酵母Y-8可以提高發(fā)酵香腸最終pH值，推測接種釀酒酵母Y-8可以有效消耗由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、乳酸等有機酸，祛除發(fā)酵香腸因乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸味。

圖2 不同發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中pH值變化Fig.2 Changes in pH of different fermented sausages during fermentation

2.3 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸色度的影響

肉制品外觀是影響消費者購買的主要因素，優(yōu)良的外觀比產(chǎn)品口感更重要[16]。在產(chǎn)品色澤判定中，C代表飽和度，C越大表明樣品飽和度越高、顏色越純[11]。由表2可知，4 組發(fā)酵香腸C無顯著差異，其中，A組的C（12.42±0.71）最大。接種釀酒酵母Y-8發(fā)酵香腸的a*與b*與CK組無顯著差異，但A組與B組的L*顯著低于CK組（P＜0.05），說明植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8以20∶1和10∶1比例接種可以降低發(fā)酵香腸亮度。

表2 不同發(fā)酵香腸色度測定結果Table 2 Color parameters of different fermented sausages

2.4 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸質構的影響

肉制品的質地被認為是影響消費者接受程度的最重要質量決定因素[17]。由表3可知，A組與CK組發(fā)酵香腸彈性、膠著性與咀嚼性無顯著差異，但A組發(fā)酵香腸的硬度顯著高于CK組（P＜0.05）；B、C組發(fā)酵香腸彈性與其余2 組無顯著差異，但硬度、膠著性顯著低于CK組和A組（P＜0.05）。植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8比例為20∶1的發(fā)酵劑有利于改善發(fā)酵香腸的質構。B、C組發(fā)酵香腸的硬度顯著低于CK組（P＜0.05），且釀酒酵母Y-8接種量越大，發(fā)酵香腸硬度越低，這與蘭沁潔[18]的研究結果一致，認為是因為乳酸菌和酵母菌的協(xié)同作用，加速蛋白質消耗，使得硬度降低。

表3 不同發(fā)酵香腸質構測定結果Table 3 Texture characteristics of different fermented sausages

2.5 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸腸桿菌數(shù)的影響

由圖3可知，在發(fā)酵過程中，各組發(fā)酵香腸的腸桿菌數(shù)均呈下降趨勢。發(fā)酵2 d時，CK組發(fā)酵香腸的腸桿菌數(shù)為3.15（lg（CFU/g）），而接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組腸桿菌數(shù)降為0。由此可看出，釀酒酵母Y-8與植物乳植桿菌Z43復配發(fā)酵能增強抑菌能力，抑制或殺死腸桿菌，加快腸桿菌數(shù)的下降。García-Béjar等[19]證實了酵母菌對豬肉發(fā)酵香腸存在抑菌作用。添加釀酒酵母Y-8可以增強發(fā)酵香腸的抗菌能力，有效抑制腸桿菌生長，提高發(fā)酵香腸的安全性。

圖3 不同發(fā)酵香腸發(fā)酵過程中腸桿菌數(shù)變化Fig.3 Changes of Enterobacter count in different fermented sausages during fermentation

2.6 不同組別發(fā)酵香腸總體揮發(fā)性風味物質差異分析

2.6.1 不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質分析

由圖4可知，4 組發(fā)酵香腸的揮發(fā)性化合物通過GC-IMS被很好地分離，具有明顯差異。共檢測并識別出49 種化合物，其中醛類6 種、醇類12 種、酯類11 種、酮類10 種、酸類2 種、烯烴類2 種、吡嗪類3 種、其他類3 種。

圖4 不同發(fā)酵香腸GC-IMS二維譜圖Fig.4 Two dimensional GC-IMS maps of different fermented sausages

各揮發(fā)性風味物質峰體積具體數(shù)值見表4。利用GC-IMS所得不同組別的同一揮發(fā)性風味物質的峰體積大小在一定程度上代表物質含量多少。

表4 不同發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質定性分析結果Table 4 Qualitative analysis results of volatile compounds in different fermented sausages

為進一步直觀對比不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性物質的差異，選取3 次平行的所有峰進行指紋圖譜對比（圖5）。在指紋圖譜中，圖中各點顏色的深淺代表揮發(fā)性化合物含量差異。由表4與圖5可知，接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發(fā)酵香腸中乙酸二聚體含量低于CK組，且A組發(fā)酵香腸顯著低于CK組（P＜0.05），可有效降低發(fā)酵香腸酸味。

圖5 不同發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質指紋圖譜Fig.5 Gallery fingerprint of volatile flavor compounds in different fermented sausages

醇類揮發(fā)性風味物質主要是由酵母菌的生理活動以及脂質氧化、氨基酸代謝和微生物繁殖產(chǎn)生的必需風味成分[27]。接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發(fā)酵香腸中6 種醇類化合物（1-戊醇二聚體、異戊醇單體、異戊醇二聚體、順-3-壬烯醇、異丁醇二聚體、1-己醇單體）含量明顯高于CK組，賦予發(fā)酵香腸強烈的醇香。1-戊醇二聚體和異戊醇二聚體等醇類物質增強了發(fā)酵香腸的燒烤味和奶酪味。異戊醇二聚體、異丁醇二聚體的含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增大顯著增加，賦予發(fā)酵香腸醇香和奶酪香。

Liu Yingli等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵香腸中接種酵母菌可以促進乙酸乙酯等酯類的生成，與乳酸菌相比，酵母菌在風味形成中的貢獻更大。接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組發(fā)酵香腸中乙酸戊酯、丙酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、醋酸異丙酯、順乙酸-3-己烯酯5 種酯類化合物含量明顯高于CK組。乙酸戊酯、丙酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、醋酸異丙酯增強了發(fā)酵香腸的甜香與水果香，賦予發(fā)酵香腸濃烈的酯香。乙酸異戊酯二聚體、乙酸異戊酯單體、丙酸乙酯二聚體和乙酸戊酯的含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加而增大，賦予發(fā)酵香腸甜香與果香。

A、B、C組發(fā)酵香腸2,6-二甲基吡嗪單體與2,6-二甲基吡嗪二聚體的含量明顯高于CK組，賦予發(fā)酵香腸巧克力香氣。A組發(fā)酵香腸3-羥基-2-丁酮的含量明顯高于其余3 組，增強了發(fā)酵香腸的黃油味。

添加釀酒酵母Y-8具有香氣改良作用，但隨著釀酒酵母Y-8添加量的增加，B、C組的己醛單體、己醛二聚體、1-己醇二聚體含量逐漸增多，產(chǎn)生較多蔬菜、青草等植物香氣。

2.6.2 不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質PCA

PCA是一種無監(jiān)督的降維分析方法，一定程度反映了數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)[29]。PCA圖可以直觀地顯示不同樣品之間的差異，由圖6A可知，揮發(fā)性風味物質的PC1貢獻率為56.1%，PC2貢獻率為22.5%，總貢獻率為78.6%，說明結果可接受。同一組別發(fā)酵香腸的重復性較好，不同組別發(fā)酵香腸之間距離較遠，表明添加釀酒酵母Y-8復配發(fā)酵香腸與單獨的植物乳植桿菌Z43發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味化合物存在明顯差異。載荷圖（圖6B）可以直觀反映不同揮發(fā)性風味物質在PCA圖中的貢獻，如乙酸二聚體對CK組貢獻較大，異戊醇單體對A組貢獻較大，1-己醇單體對B、C組貢獻較大。載荷圖與PCA圖可以更好地反映不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質的差異。

圖6 不同發(fā)酵香腸揮發(fā)性化合物PCA圖（A）和載荷圖（B）Fig.6 PCA score (A) and loading plots (B) of volatile compounds in different fermented sausages

2.6.3 OPLS-DA模型分析

OPLS-DA評價模型中，為X矩陣的解釋率，為Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力[25]。此次實驗模型中＝0.962、＝0.981、Q2＝0.948，表明OPLS-DA模型的預測能力較好。由圖7A可知，4 組發(fā)酵香腸的樣品在OPLS-DA得分散點圖中可以被很好地區(qū)分，證明OPLS-DA模型能夠較好地獲取組間差異信息，可以將不同組別發(fā)酵香腸的揮發(fā)性風味物質進行區(qū)分。為防止過擬合發(fā)生，進行200 次交叉驗證。如圖7B所示，Q2的回歸線與縱軸相交點小于0，說明此模型無過擬合現(xiàn)象，模型驗證有效[30]。因此認為此結果可以用于不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質的區(qū)分。

圖7 不同發(fā)酵香腸揮發(fā)性成分OPLS-DA得分圖（A）和模型置換檢驗圖（B)Fig.7 OPLS-DA score (A) and permutation test plots (B) for volatile components in different fermented sausages

2.6.4 不同組別發(fā)酵香腸特征性揮發(fā)性風味物質分析

為進一步體現(xiàn)不同組別發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質差異，對OPLS-DA模型的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值進行計算，揮發(fā)性風味物質的VIP值越大，說明在不同處理下此揮發(fā)性風味物質的差異越顯著[31]。由圖8A可知，共篩選出17 種VIP＞1的揮發(fā)性風味物質，其中3-羥基-2-丁酮的VIP值最大，為2.5。3-羥基-2-丁酮為發(fā)酵香腸提供了黃油香氣，其通常在乳酸菌的作用下與檸檬酸鹽和乳糖代謝相關，并且也可以通過氨基酸分解代謝產(chǎn)生[32]。VIP＞1的揮發(fā)性風味物質有3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯二聚體、異丁醇二聚體、丙醛、異戊醇二聚體、甲酸乙酯、正丁醇二聚體、己醛二聚體、乙酸二聚體、丙酮、2,6-二甲基吡嗪二聚體、2,6-二甲基吡嗪單體、正丁醇單體、醋酸異丙酯、異戊醇單體、丙酸乙酯單體和異丁醇單體。

圖8 不同發(fā)酵香腸VIP值（A）及其OPLS-DA圖（B）Fig.8 VIP score map (A) and OPLS-DA plot (B) for differential volatile flavor compounds among different fermented sausages

對上述17 種揮發(fā)性風味物質進行PCA，由圖8B可知，累計貢獻率為84.4%，涵蓋大多數(shù)樣品特征，說明此17 種揮發(fā)性風味物質可以較好地區(qū)分不同組別發(fā)酵香腸。CK組的揮發(fā)性風味物質與接種釀酒酵母Y-8的A、B、C組存在較大差異。各揮發(fā)性風味物質碎片與各組的距離代表化合物含量，距離越近說明含量越高。距離A組較近的揮發(fā)性風味物質有異戊醇單體、3-羥基-2-丁酮、甲酸乙酯與異丁醇單體，說明這幾種風味成分在A組中含量最高，這與指紋圖譜結果一致。Mi Ruifang等[1]報道，釀酒酵母Y70在發(fā)酵香腸模型培養(yǎng)基中產(chǎn)生的特色風味成分為異戊醇。B、C組己醛含量較多，增加了發(fā)酵香腸青草植物香氣；CK組酯類物質含量較少；A組發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味物質最優(yōu)。

2.7 不同酵母添加量對發(fā)酵香腸脂肪酸組分的影響

采用GC-MS測定不同組別的脂肪酸含量，由表5可知，共檢測出9 種脂肪酸，4 組發(fā)酵香腸的脂肪酸組成基本相似。飽和脂肪酸中肉豆蔻酸的相對含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加呈下降趨勢，且C組肉豆蔻酸相對含量顯著低于CK組（P＜0.05）。單不飽和脂肪酸中，油酸相對含量隨釀酒酵母Y-8接種量的增加呈上升趨勢，且C組油酸相對含量顯著高于CK組（P＜0.05）。高油酸含量被證明可以降低膽固醇水平及動脈粥樣硬化風險[33]。多不飽和脂肪酸中亞油酸為n-6脂肪酸，有助于減少與人類心血管疾病相關的一些因素，同時是預防人類必需脂肪酸缺乏癥所必需的脂肪酸[34]，接種釀酒酵母Y-8對發(fā)酵香腸亞油酸相對含量無顯著影響。綜上所述，接種釀酒酵母Y-8可以有效降低肉豆蔻酸相對含量，提高發(fā)酵香腸中油酸的相對含量，具有更高的營養(yǎng)價值，更符合健康營養(yǎng)理念，故釀酒酵母Y-8可以調整脂肪酸組成，對發(fā)酵香腸的脂肪酸組成具有改良作用。

表5 不同發(fā)酵香腸脂肪酸相對含量Table 5 Relative fatty acid contents of different fermented sausages %

3 結論

接種釀酒酵母Y-8可以有效抑制腸桿菌生長，提高發(fā)酵香腸的安全性；增加酯類與醇類化合物，賦予發(fā)酵香腸酯香與醇香風味；降低乙酸二聚體含量；有效消除發(fā)酵香腸酸味。隨著釀酒酵母Y-8接種量升高，發(fā)酵香腸的硬度顯著降低、油酸相對含量顯著增加。

通過建立OPLS-DA預測模型，篩選出17 種特征風味物質，結合PCA可對不同組別發(fā)酵香腸進行區(qū)分。其中差異最顯著的揮發(fā)性風味物質為3-羥基-2-丁酮，為發(fā)酵香腸提供了黃油香氣。釀酒酵母Y-8與植物乳植桿菌Z43復配發(fā)酵香腸的品質優(yōu)于植物乳植桿菌Z43單菌發(fā)酵香腸，釀酒酵母Y-8可以改善發(fā)酵香腸的品質及風味，A組發(fā)酵香腸（植物乳植桿菌Z43與釀酒酵母Y-8接種比例20∶1）的品質較優(yōu)。本研究可為酵母菌在發(fā)酵香腸中的應用提供參考。