擬穴青蟹精氨酸激酶的重組表達(dá)及致敏性分析

楊 陽，何欣蓉，何少貴，陳錦莉，劉 萌，費(fèi)丹霞，毛海燕，劉光明,*

（1.廈門華廈學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建 廈門 361024；2.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；3.翔安創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361104；4.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361102）

在過去幾十年里，過敏性疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)顯著且迅速地升高[1]。食物過敏是人體對(duì)食品中抗原物質(zhì)產(chǎn)生的由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的不良反應(yīng)，屬于免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的I型（速發(fā)型）超敏反應(yīng)，其臨床癥狀多種多樣，最常見的是消化道癥狀、皮膚黏膜癥狀和呼吸道癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生過敏性休克甚至危及生命[2-3]。根據(jù)2021年聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，引發(fā)過敏性疾病的八大類主要致敏食物為谷物、甲殼類水產(chǎn)品、雞蛋、魚類、牛乳、花生、芝麻和堅(jiān)果[4]。

甲殼類水產(chǎn)品是亞洲最常見的致敏食物，近年來食品加工業(yè)的不斷發(fā)展使得水產(chǎn)品來源的食品原材料被廣泛添加于各類食品中，在客觀上擴(kuò)大了水產(chǎn)品過敏原的分布范圍，導(dǎo)致我國水產(chǎn)食物過敏發(fā)生率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，過敏癥狀也更加復(fù)雜化和嚴(yán)重化[5-6]。甲殼類水產(chǎn)食物過敏主要由蝦、蟹、章魚等引起，精氨酸激酶（arginine kinase，AK）被認(rèn)為是其水溶性蛋白中的主要過敏原[7]。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，是我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的蟹類[8]，但其產(chǎn)量和消費(fèi)量逐年升高的同時(shí)也伴隨著越來越多的蟹類食物過敏問題。前期研究表明，擬穴青蟹AK是一種分子質(zhì)量為40 kDa的糖蛋白，其空間結(jié)構(gòu)包含1 個(gè)N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的α-β結(jié)構(gòu)域，N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)域由位于氨基酸（amino acids，AA）1～92位的5 個(gè)α-螺旋組成；C端的α-β結(jié)構(gòu)域由位于AA 93～356位的7 個(gè)α-螺旋和8 個(gè)β-折疊組成；AK分子內(nèi)含2 對(duì)二硫鍵，其中201位和271位半胱氨酸形成的二硫鍵對(duì)于維持AK分子規(guī)則折疊的高級(jí)結(jié)構(gòu)和致敏性具有重要作用[9-10]。

對(duì)于AK的研究，擬穴青蟹肌肉中提取的天然AK（native AK，nAK）最能體現(xiàn)其原本致敏性，但是天然蛋白也有其不可避免的缺點(diǎn)。分離純化過程中步驟繁瑣、過敏原組分含量和生物活性存在差異，以及處理過程中過敏原的降解等問題，都使提取天然過敏原難以標(biāo)準(zhǔn)化、程序化和量產(chǎn)化。因此，通過分子生物學(xué)方法制備的重組食物過敏原成為替代天然過敏原應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、過敏性疾病診斷和治療的重要工具[11]。前期Mao Haiyan等[12]利用大腸桿菌（Escherichia coli）原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了擬穴青蟹重組AK（recombinant AK，rAK），并證實(shí)rAK與nAK具有相似的IgE結(jié)合活性。但費(fèi)丹霞[13]對(duì)rAK和nAK的性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)rAK分子中游離巰基含量和疏水性高于nAK，即蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)折疊松散。AK分子內(nèi)二硫鍵是維持其空間結(jié)構(gòu)和致敏性的重要因素，rAK與nAK空間結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致二者穩(wěn)定性和致敏性的差異[10,12]，因此rAK是否能夠替代nAK需進(jìn)一步通過致敏性評(píng)估進(jìn)行驗(yàn)證。此外，目前已報(bào)道的甲殼類水產(chǎn)品AK的線性表位主要分布于AA 29～53、AA 101～110、AA 113～155、AA 204～225和AA 308～330[10,12,14-16]。從結(jié)構(gòu)上看，AA 29～53位于AK N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，其余線性表位區(qū)域則位于其C端的α-β結(jié)構(gòu)域[9-10,12,14-16]，但在機(jī)體中這些抗原表位所發(fā)揮的作用也需進(jìn)一步評(píng)估。

對(duì)于過敏原致敏性的評(píng)估主要包括體內(nèi)和體外2 種方式。目前應(yīng)用最多的過敏原致敏性體內(nèi)評(píng)估方式是動(dòng)物模型，即利用鼠、兔等動(dòng)物模擬人體食物過敏反應(yīng)，檢測(cè)其血清中的抗體水平及免疫細(xì)胞的變化情況，從而達(dá)到對(duì)過敏原致敏性評(píng)估的目的，這種方法在高度模擬過敏原在體內(nèi)作用方式的同時(shí)，也避免了過敏原對(duì)人體造成的威脅[17]。根據(jù)過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，機(jī)體中效應(yīng)細(xì)胞表面的特異性IgE和入侵機(jī)體的過敏原是觸發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此過敏原致敏性的體外評(píng)估除血清學(xué)分析外，還包括細(xì)胞模型[18]。過敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)效應(yīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生介質(zhì)釋放、脫顆粒等變化，因此過敏原激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)的能力也可作為評(píng)估其致敏性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，目前大鼠嗜堿性白血?。╮at basophilic leukemia，RBL）-2H3細(xì)胞脫顆粒模型是一種較為常用的過敏原致敏體外評(píng)估模型[19]。RBL-2H3細(xì)胞表面高表達(dá)IgE高親和力受體，且細(xì)胞內(nèi)存在預(yù)先合成的β-己糖苷酶，經(jīng)IgE敏化的RBL-2H3細(xì)胞可被抗原激發(fā)而發(fā)生脫顆粒、釋放β-己糖苷酶，細(xì)胞脫顆粒時(shí)釋放的β-己糖苷酶與過敏相關(guān)活性物質(zhì)的釋放呈正相關(guān)[20]。因此，在過敏原的致敏性體外評(píng)估中常用致敏小鼠血清特異性IgE敏化的RBL-2H3細(xì)胞建立模型，以β-己糖苷酶的釋放作為脫顆粒的一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)過敏原的致敏性[10,21-22]。

獲得高純度、標(biāo)準(zhǔn)化的過敏原對(duì)后續(xù)致敏機(jī)理的相關(guān)研究、過敏原檢測(cè)、過敏性疾病的診斷和治療等都具有重要意義，重組蛋白具有易標(biāo)準(zhǔn)化、量產(chǎn)化等優(yōu)勢(shì)，與天然過敏原具有相似理化特性和免疫學(xué)特性的重組過敏原具有重要的應(yīng)用潛力。此外，探究過敏原分子中主要的表位分布區(qū)域在機(jī)體過敏時(shí)所發(fā)揮的作用，可為過敏原檢測(cè)、過敏性疾病的治療提供依據(jù)。因此，本研究針對(duì)擬穴青蟹AK，根據(jù)其已報(bào)道的空間結(jié)構(gòu)和抗原表位對(duì)該分子進(jìn)行分段并利用E.coli原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)分段的基因進(jìn)行重組表達(dá)；進(jìn)一步通過BALB/c小鼠致敏模型和RBL-2H3細(xì)胞模型對(duì)nAK、rAK及AK分段表達(dá)產(chǎn)物致敏性進(jìn)行評(píng)估，比較分析nAK和rAK的致敏性，并鑒定AK分子中致敏的主要表位區(qū)域，以期為AK檢測(cè)及過敏性疾病診斷、治療提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹購自廈門市集美區(qū)集美菜市場。

6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，無特定病原體級(jí)別，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（閩）2016-0006。

E.coliTop10/BL21感受態(tài)、質(zhì)粒pEASY-T1、T4連接酶北京全式金生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeI、SalI、DNA Marker（DL2000）日本Takara公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒 天根生化（中國）有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體、HRP-羊抗兔IgG抗體 美國Abcam公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液 中國達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；小鼠白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-13、干擾素γ（interferon γ，INF-γ）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒美國Peprotech公司；明礬佐劑、Ni2+-次氨基三乙酸（nitrilotriacetic acid，NTA）瓊脂糖凝膠柱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；大鼠嗜堿性粒細(xì)胞（RBL-2H3）上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；rAK表達(dá)菌株（E.coli）由本實(shí)驗(yàn)室Mao Haiyan等[12]前期構(gòu)建。其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PTC-1198聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、DNA水平電泳槽、蛋白垂直電泳槽、Biologic LP蛋白層析系統(tǒng)、Bench mark 96酶標(biāo)儀美國Bio-Rad公司；Bio-Profile凝膠成像儀 法國Vibler Lourmant公司；AvantiTM JA-25高速冷凍離心機(jī)（大型）美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 擬穴青蟹AK的分段和引物設(shè)計(jì)

根據(jù)對(duì)AK序列的分段信息，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)4 對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的分段擴(kuò)增引物，為使限制性內(nèi)切酶能夠有效識(shí)別酶切位點(diǎn)，分別在AK-E1上游引物和下游引物的5′端加入CCG和CGC保護(hù)性堿基，實(shí)驗(yàn)所用引物由廈門瑞辰鉑生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 AK基因分段引物序列、內(nèi)切酶及酶切位點(diǎn)Table 1 Primer sequences,endonucleases,and cleavage sites used for amplification of gene fragments of AK

1.3.2 AK片段的基因擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的rAK表達(dá)菌株質(zhì)粒（pET-28a載體）pET-AK作為PCR反應(yīng)的模板[12]，對(duì)AK的4 個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，30 s，根據(jù)表1的引物退火溫度退火，45 s；72 ℃延伸，60 s；變性、退火、延伸過程共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，切膠回收目的條帶。將擴(kuò)增得到的AK片段基因與pEASY-T1載體連接，構(gòu)建AK的分段克隆載體，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進(jìn)行高溫裂解作為菌落PCR模板，采用與4 個(gè)AK片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)相同的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，選取PCR產(chǎn)物分子質(zhì)量與設(shè)計(jì)的片段大小相符、擴(kuò)增條帶單一的克隆子測(cè)序。將測(cè)序正確的分段克隆載體及表達(dá)載體pET-28a分別采用表1所列的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶將目的基因片段與載體酶切產(chǎn)物于16 ℃連接18 h，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建rAK分段表達(dá)載體pET-28a-AK-E1、pET-28a-AK-E2、pET-28a-AK-E3和pET-28a-AK-E4。將轉(zhuǎn)化了連接產(chǎn)物的大腸桿菌BL21涂布于含卡那霉素的LB平板，篩選能夠在含卡那霉素抗性固體培養(yǎng)平板上生長的菌株，委托廈門瑞辰鉑生物技術(shù)有限公司對(duì)菌株所攜帶的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 重組蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)載體在BL21中的表達(dá)及檢測(cè)參照He Xinrong等[23]的方法，選取上述測(cè)序正確的表達(dá)宿主菌種接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至600 nm波長處的光密度（optical density，OD）（OD600nm）為0.6左右，加入異丙基硫代半乳糖苷至濃度為0.5 mmol/L，37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心（4 ℃、10 000×g、1 min）回收菌體，用含0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）重懸后超聲破碎。收集全菌液，離心（4 ℃、12 000×g、2 min）得到上清液及沉淀，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.3.4 nAK、rAK和AK分段表達(dá)產(chǎn)物的純化及鑒定

nAK的純化參照Yang Yang等[9]的方法，新鮮擬穴青蟹肌肉經(jīng)組織搗碎、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose陰離子交換柱層析后，收集目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。rAK和AK分段表達(dá)產(chǎn)物的純化參照Huang Yuhao等[24]的方法，將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組質(zhì)粒菌液進(jìn)行超聲破碎后離心（4 ℃、12 000×g、20 min），可溶表達(dá)的重組蛋白取上清；包涵體蛋白棄上清后沉淀用4 mol/L脲復(fù)溶，于2 mol/L脲和不含脲的緩沖液中分步透析復(fù)性；選擇Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱純化目的蛋白，收集目的蛋白，采用SDS-PAGE檢測(cè)純化結(jié)果。純化的蛋白采用Yang Yang等[10]制備的兔抗擬穴青蟹AK IgG多克隆抗體為一抗，通過Western blot對(duì)純化的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3.5 BALB/c小鼠致敏模型構(gòu)建

小鼠實(shí)驗(yàn)全程在集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0006）進(jìn)行。將42 只BALB/c小鼠分為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）對(duì)照組、nAK致敏組、rAK致敏組、AK-E1～AK-E4致敏組，每組各6 只）。純化的抗原根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定質(zhì)量濃度并調(diào)整質(zhì)量濃度至1 mg/mL后，與明礬佐劑以3∶1（V/V）混勻，對(duì)照組小鼠注射采用等體積的PBS代替抗原。致敏方式為在第0、14天以腹腔注射的方式敏化小鼠，每只小鼠注射200 μg抗原。第2次腹腔注射后1 d，眼球取血并分離血清用于特異性抗體水平檢測(cè)[25]。將小鼠宰殺，取出脾臟，分離淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整為2×105個(gè)/mL，加入100 μg/mL抗原，對(duì)照組細(xì)胞加入等體積培養(yǎng)基，放置于37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)72 h。將刺激培養(yǎng)后的細(xì)胞離心（25 ℃、4 000×g、10 min），回收上清液用于脾臟淋巴細(xì)胞因子釋放水平檢測(cè)[26]。

1.3.6 BALB/c小鼠血清特異性抗體及脾臟淋巴細(xì)胞因子釋放水平測(cè)定

參照史云鳳等[27]的方法，采用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清中AK-特異性IgE（specific IgE，sIgE）、AK-sIgG1和AK-sIgG2a抗體水平。以10 μg純化的nAK包被96 孔板，4 ℃孵育過夜；用TPBS（含0.05%吐溫-20的20 mmol/L PBS）洗滌3 次后，用5 g/100 mL脫脂乳于37 ℃封閉2 h；洗滌3 次后加入以1 g/100 mL脫脂乳稀釋5 倍的小鼠血清樣品，37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入二抗（HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體），37 ℃孵育2 h；洗滌5 次后加入3,3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺底物，37 ℃避光反應(yīng)20 min后用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長處檢測(cè)各孔的OD450nm。同時(shí)，以小鼠血清（1∶5稀釋）為一抗，HRP-羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體為二抗，采用Western blot對(duì)小鼠血清中AK特異性抗體水平進(jìn)行檢測(cè)[25]。

小鼠脾臟淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)后上清液細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的檢測(cè)均按照細(xì)胞因子（IL-4、IL-13、INF-γ）檢測(cè)試劑盒說明書采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效率測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的RBL-2H3細(xì)胞調(diào)整至濃度為1×106個(gè)/mL，在48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL，并添加1.3.5節(jié)以nAK免疫小鼠后獲得的鼠抗擬穴青蟹nAK抗血清（10 μL/孔），放置于37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用PBS洗滌細(xì)胞3 次，將各抗原按照濃度梯度溶于200 μL Tyrode’s緩沖液，分別加入培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔加入等體積PBS，繼續(xù)培養(yǎng)6 h?；厥占?xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入200 μL含0.1% Triton X-100的Tyrode’s緩沖液冰浴5 min，使培養(yǎng)板底部的細(xì)胞完全裂解后回收。取25 μL上清/細(xì)胞裂解液，加入100 μLβ-氨基己糖苷酶的底物1.2 mmol/L 4-甲基傘形酮基-N-乙?；?b-D-氨基葡萄糖苷，于37 ℃反應(yīng)30 min，當(dāng)體系中含有β-氨基己糖苷酶時(shí)，可將該底物分解，釋放熒光分子，在360 nm激發(fā)波長、450 nm發(fā)射波長下可測(cè)定熒光強(qiáng)度，該熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞的β-氨基己糖苷酶水平[28]。抗原刺激細(xì)胞脫顆粒的能力以脫顆粒效率表示，按下式計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用GraphPad軟件分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Tukey多重檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白的表達(dá)

2.1.1 AK片段表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序

根據(jù)擬穴青蟹AK的AA序列（GI：375298903）和已解析的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：5ZHQ），以及已鑒定的抗原表位[9-10,12,14]，AK的N端α-螺旋結(jié)構(gòu)域中包含1 個(gè)位于AA 29～53的線性表位區(qū)域，因此首先確定AK-E1為AA 1～92。在AK分子C端的α-β結(jié)構(gòu)域中，主要有3 個(gè)線性表位的分布區(qū)域：AA 101～110和AA 113～155、AA 204～225、AA 308～330。根據(jù)線性表位在C端結(jié)構(gòu)域的分布，并確保各分段表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量較一致且分段表達(dá)產(chǎn)物中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)不受破壞，從無規(guī)卷曲區(qū)域選擇AK的分段位點(diǎn)，確定AK的C端的α-β結(jié)構(gòu)域分為AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）3 段（圖1）。以rAK表達(dá)質(zhì)粒pET-AK為PCR擴(kuò)增模板，分別采用4 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增后，由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）可知，擴(kuò)增的4 個(gè)基因大小與設(shè)計(jì)的目的基因片段大小基本相符。將產(chǎn)物回收，構(gòu)建分段克隆載體，轉(zhuǎn)入Top 10克隆宿主大量擴(kuò)增后，回收質(zhì)粒，將目的條帶與pET-28a載體雙酶切后連接，構(gòu)建分段表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)宿主。選取菌落PCR陽性克隆子進(jìn)行測(cè)序。

圖1 AK的分段表達(dá)示意圖Fig.1 Schematic diagram of partial expression of AK

圖2 AK片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherograms of PCR amplification products of AK fragments

2.1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及nAK、rAK、分段表達(dá)產(chǎn)物的純化

將測(cè)序結(jié)果正確的宿主表達(dá)菌在37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)后，提取超聲處理的上清液和沉淀，用SDS-PAGE分析各重組蛋白的表達(dá)情況，并采用Western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。由圖3可知，AK-E1為可溶表達(dá)，AK-E2、AK-E3和AK-E4則以包涵體形式表達(dá)，各分段表達(dá)產(chǎn)物大小約為14 kDa，與理論值相符，并且目的蛋白均能被兔抗擬穴青蟹AK IgG多克隆抗體特異性識(shí)別，表明獲得的表達(dá)產(chǎn)物為AK的片段。AK-E1為可溶表達(dá)蛋白，直接上樣于Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱，用Ni2+吸附純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白；AK-E2、AK-E3包涵體蛋白溶解于4 mol/L脲，透析復(fù)性后上樣于Ni2+-NTA瓊脂糖凝膠柱，用Ni2+吸附純化帶有His標(biāo)簽的重組蛋白；AK-E4包涵體蛋白溶解于4 mol/L脲，透析復(fù)性后離心收集上清液中的重組蛋白。分別參照Mao Haiyan[12]、Yang Yang[9]等的方法純化rAK和nAK。通過SDS-PAGE檢測(cè)經(jīng)柱層析分離的樣品（圖4）并分別對(duì)各泳道的目的蛋白純度進(jìn)行分析，結(jié)果表明，純化后目的蛋白純度均達(dá)到90%以上。

圖3 AK分段表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of AK fragments

圖4 nAK、rAK及AK分段表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of nAK,rAK,and AK fragments

2.2 重組蛋白的致敏性分析

2.2.1 重組蛋白和nAK致敏BALB/c小鼠的血清學(xué)分析

由圖5A可知，nAK敏化組小鼠的血清特異性IgE升高最為明顯，ELISA檢測(cè)結(jié)果OD450nm為1.098±0.008，顯著高于rAK和AK分段表達(dá)產(chǎn)物敏化組小鼠（P＜0.05）。重組蛋白中，rAK、AK-E1、AK-E2、AK-E3都能刺激小鼠產(chǎn)生AK-sIgE，其中rAK敏化組小鼠OD450nm升高至0.472±0.002，顯著高于對(duì)照組和AK分段表達(dá)產(chǎn)物敏化組，而AK的4 個(gè)片段中，AK-E2可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的AK-sIgE。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，nAK和rAK敏化組小鼠血清中的IgE能夠特異性識(shí)別結(jié)合AK，但AK分段表達(dá)產(chǎn)物敏化組小鼠血清中的IgE水平較低，未出現(xiàn)免疫印跡。

圖5 第2次腹腔注射后1 d小鼠血清中AK特異性抗體的Western blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Western blot and ELISA analysis of AK-specific antibodies in the serum of mice at 1 d after the second intraperitoneal injection

對(duì)AK-sIgG1的ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖5B）表明，與PBS組小鼠血清相比，nAK（OD450nm＝1.975±0.058）、rAK（OD450nm＝1.891±0.088）、AK-E2（OD450nm＝1.772±0.105）和AK-E3（OD450nm＝0.929±0.085）敏化組小鼠血清中的AK-s IgG 1 含量顯著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.082±0.003）和AK-E4（OD450nm＝0.126±0.004）敏化組小鼠注射抗原后未檢測(cè)到其血清中AK-sIgG1水平升高。通過Western blot檢測(cè)，nAK、rAK、AK-E2及AK-E3組小鼠血清中的AKsIgG1呈陽性，與ELISA檢測(cè)結(jié)果相符。小鼠血清中AKsIgG2a水平的ELISA測(cè)定結(jié)果（圖5C）表明，與PBS組相比，nAK（OD450nm＝0.965±0.042）、rAK（OD450nm＝0.694±0.010）、AK-E2（OD450nm＝0.468±0.018）、AK-E3（OD450nm＝0.481±0.001）和AK-E4（OD450nm＝0.456±0.001）敏化組小鼠血清中的AK-sIgG2a水平顯著升高（P＜0.05），AK-E1（OD450nm＝0.090±0.002）組小鼠注射抗原后未檢測(cè)到其血清中AK-sIgG2a水平的升高。各組血清中AK-sIgG2a水平的Western blot檢測(cè)結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果均相符。此外，在nAK、rAK、AKE1、AK-E2和AK-E3敏化小鼠中，sIgG1水平均明顯高于sIgG2a，即IgG1/IgG2a比值均大于1，表明在能夠產(chǎn)生特異性IgE的小鼠機(jī)體內(nèi)過敏反應(yīng)均為Th2型[29]。

2.2.2 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平

由圖6可知，與PBS組相比，nAK敏化組小鼠的淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)上清中，IL-4（（63.067±1.359）pg/mL）、IL-13（（20.767±0.040）pg/mL）和IFN-γ（（133.289±2.393）pg/mL）水平均顯著升高，且顯著高于重組蛋白組（P＜0.05）。rAK敏化組小鼠淋巴細(xì)胞的刺激培養(yǎng)上清中IL-4（（49.501±0.352）pg/mL）、IL-13（（14.851±1.073）pg/mL）和IFN-γ（（68.141±7.464）pg/mL）水平也有顯著升高（P＜0.05），而在分段表達(dá)產(chǎn)物中，AK-E2能夠刺激淋巴細(xì)胞釋放較高水平的IL-4（（50.668±0.759）pg/mL），且其釋放水平與rAK組無顯著差異。在I型超敏反應(yīng)中，Th0向Th2分化、Th1/Th2失衡、IgE含量增加是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而Th2分泌IL-4、IL-13等多種細(xì)胞因子，具有誘導(dǎo)B細(xì)胞的免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)化、導(dǎo)致IgE水平升高并協(xié)同IL-3共同刺激肥大細(xì)胞增殖等功能[30]。nAK、rAK和AK-E2敏化組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)上清中的Th2型細(xì)胞因子與其血清中特異性抗體水平一致，表明與nAK相比，rAK對(duì)機(jī)體的敏化能力較弱，而在AK分子中，AK-E2（AA 87～187）在致敏階段發(fā)揮較為重要的作用。對(duì)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平的檢測(cè)結(jié)果表明，nAK組IFN-γ水平同樣最高，但有研究表明這一細(xì)胞因子還參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[31]，表明AK敏化組小鼠機(jī)體中IFN-γ水平升高可能主要是因?yàn)閰⑴c機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

圖6 nAK、rAK及AK分段表達(dá)產(chǎn)物對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞因子釋放影響的ELISA檢測(cè)結(jié)果Fig.6 ELISA analysis of effects of nAK,rAK and AK fragments on cytokine levels in splenocyte culture

2.2.3 rAK及AK分段表達(dá)產(chǎn)物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的影響

用不同質(zhì)量濃度梯度的重組蛋白刺激經(jīng)AK-sIgE敏化過夜的細(xì)胞，以nAK為陽性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)各重組蛋白刺激RBL-2H3細(xì)胞的脫顆粒效率。由表2可知，與PBS組相比，當(dāng)nAK質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)就能夠使細(xì)胞產(chǎn)生明顯脫顆粒反應(yīng)，而rAK則在質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)能夠引起細(xì)胞產(chǎn)生明顯的脫顆粒。AK的4 個(gè)分段表達(dá)產(chǎn)物均能夠引起RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒，但其能夠引起細(xì)胞脫顆粒所需的質(zhì)量濃度比rAK高出10 倍以上，AK的分段表達(dá)產(chǎn)物刺激RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效率的程度為AK-E2＞AK-E4＞AK-E3＞AK-E1。

表2 nAK、rAK及AK分段表達(dá)產(chǎn)物對(duì)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒效率的影響Table 2 Effect of nAK,rAK and AK fragments on the degranulation efficiency of RBL-2H3 cells %

3 討論

水產(chǎn)品是人們?nèi)粘ｏ嬍车闹匾M成部分，是營養(yǎng)的重要來源，但同時(shí)也是引起食物過敏的重要因素，甲殼類水產(chǎn)品引起的過敏反應(yīng)可引起皮膚紅疹、面部及喉部水腫，甚至引發(fā)休克，在亞洲沿海地區(qū)這種現(xiàn)象尤為常見[32]，因此，甲殼類水產(chǎn)品過敏原的研究開始受到廣泛關(guān)注。重組過敏原可以作為天然過敏原的一種替代物，特別是用于過敏原標(biāo)準(zhǔn)物的制備，在過敏原研究中具有重要意義[33]。

重組表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)和無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)因其成本低、表達(dá)量高、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于重組過敏原的表達(dá)。史云鳳等[27]以大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功重組表達(dá)了花生過敏原Ara h 1，并通過體內(nèi)和體外致敏性評(píng)估方法證實(shí)重組Ara h 1與天然Ara h 1蛋白性質(zhì)、致敏性相似。此外，目前已有多種由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組過敏原被證實(shí)與天然過敏原具有相似的IgE結(jié)合性，并廣泛應(yīng)用于過敏原組分診斷和抗原特異性治療等領(lǐng)域[11]。但是大腸桿菌作為一種原核表達(dá)宿主，也存在缺乏翻譯后修飾作用、無法使蛋白質(zhì)形成正確折疊的空間結(jié)構(gòu)等問題，而大多數(shù)過敏原屬于糖蛋白，且多肽鏈經(jīng)過正確折疊形成的空間結(jié)構(gòu)對(duì)某些過敏原的致敏性也有重要影響，因此糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾過程是影響某些過敏原致敏性的關(guān)鍵因素[34]。Huang Yuhao等[24]以大腸桿菌表達(dá)宿主表達(dá)大菱鲆小清蛋白，對(duì)天然和重組小清蛋白等性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，重組小清蛋白鈣離子結(jié)合方式與天然蛋白有所差異，導(dǎo)致其IgG結(jié)合活性及消化穩(wěn)定性弱于天然過敏原。前期Mao Haiyan等[12]證實(shí)rAK與nAK具有相似的IgE結(jié)合活性，但本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者的免疫原性存在較大差異，rAK致敏BALB/c小鼠后，血清中特異性抗體水平顯著升高，但顯著低于nAK致敏組小鼠；Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-13）水平也顯著低于nAK致敏組小鼠。RBL-2H3細(xì)胞的β-己糖苷酶釋放率檢測(cè)結(jié)果表明，rAK刺激效應(yīng)細(xì)胞脫顆粒的能力較nAK弱，進(jìn)一步證實(shí)盡管rAK的IgE結(jié)合活性與nAK相似，但在機(jī)體內(nèi)，其免疫原性弱于天然過敏原。費(fèi)丹霞[13]對(duì)rAK和nAK的理化特性分析比較發(fā)現(xiàn)，rAK分子中二硫鍵含量較nAK少，且其熱穩(wěn)定性較天然蛋白差，在30 ℃時(shí)即產(chǎn)生多聚體。AK分子中的二硫鍵是其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵，由此可推測(cè)，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的rAK由于無法形成二硫鍵而導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)變化及理化特性改變，是其免疫原性弱于nAK的重要原因。因此，由原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rAK無法完全替代天然過敏原，通過更換表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)rAK分子的翻譯后修飾和空間結(jié)構(gòu)的正確形成是獲得高免疫原性rAK的重要措施。盡管如此，低免疫原性的重組蛋白被證實(shí)在應(yīng)用于過敏性疾病的臨床診斷和過敏原特異性治療過程中有較高的安全性[35-36]，因此，rAK這種高IgE結(jié)合活性、低免疫原性的特點(diǎn)可為甲殼類水產(chǎn)品過敏性疾病的診斷和治療提供參考。

過敏原分子中抗原表位是抗體分子和免疫細(xì)胞識(shí)別抗原的基本單位，因此，對(duì)于食物過敏的研究逐漸深入至抗原表位水平，關(guān)于甲殼類水產(chǎn)品AK抗原表位的研究也已較為深入[14-15]。為進(jìn)一步探究AK致敏的關(guān)鍵表位，本研究根據(jù)AK線性表位的分布情況及其結(jié)構(gòu)域?qū)K分為AK-E1（AA 1～92）、AK-E2（AA 87～187）、AK-E3（AA 172～265）和AK-E4（AA 276～357）4 個(gè)部分，進(jìn)行分段重組表達(dá)。以4 個(gè)分段表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AK-E2區(qū)域在機(jī)體內(nèi)的免疫原性最強(qiáng)，而AK-E4最弱；利用RBL-2H3細(xì)胞模型對(duì)4 個(gè)分段表達(dá)產(chǎn)物刺激效應(yīng)細(xì)胞的能力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，AK-E2和AK-E4能刺激細(xì)胞釋放較高水平的β-己糖苷酶。從AK分子的抗原表位分布情況看，AK-E1、AK-E3主要為構(gòu)象表位分布區(qū)域[10,14]，分段表達(dá)產(chǎn)物失去AK分子的空間結(jié)構(gòu)，無法形成原有的構(gòu)象表位，是該片段免疫原性較弱的重要原因；而AK-E2是AK分子中線性表位較為集中的區(qū)域[10,12,14-15]，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力較強(qiáng)，因此，針對(duì)該區(qū)域通過食品加工或分子生物學(xué)手段改造AK有望有效降低AK的致敏性。AK-E4也是AK分子中線性表位分布較多的區(qū)域[10,12,14-15]，但其刺激機(jī)體產(chǎn)生AK特異性抗體的能力較弱，這可能與該片段長度較小有關(guān)，盡管如此，該片段對(duì)效應(yīng)細(xì)胞具有較強(qiáng)的刺激作用，可能在機(jī)體過敏的效應(yīng)階段發(fā)揮較重要的作用，有望用于食品中過敏原的檢測(cè)及蟹類過敏性疾病的診斷。

4 結(jié)論

本研究成功重組表達(dá)了擬穴青蟹AK的4 個(gè)區(qū)域，且利用BALB/c小鼠模型和RBL-2H3細(xì)胞模型對(duì)nAK、rAK及AK的分段表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了致敏性分析，證實(shí)通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的rAK免疫原性較nAK弱，而AK分子中免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)锳A 87～187，免疫反應(yīng)性較強(qiáng)的區(qū)域?yàn)锳A 276～357。相關(guān)結(jié)果為利用重組蛋白進(jìn)行過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備以及食物過敏的診斷、治療提供了理論依據(jù)。