黃芪提取物對(duì)帕金森病小鼠黑質(zhì)區(qū)白介素-17通路的影響

關(guān)勇宇,張廣潤(rùn),李海龍,邵菲菲

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,臨床主要表現(xiàn)為姿勢(shì)平衡障礙、肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫、動(dòng)作遲緩等,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)65歲以上人群PD患病率達(dá)1.7%[3-4]。黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性或壞死是PD發(fā)生的主要病理機(jī)制,故臨床主要通過(guò)服用多巴胺類或多巴胺受體激動(dòng)劑類藥物治療PD,雖能一定程度上改善患者癥狀,但該療法無(wú)法阻斷神經(jīng)元丟失[5]?，F(xiàn)代研究證實(shí),神經(jīng)炎癥損傷在PD退行性病變過(guò)程中具有主導(dǎo)作用[6],其中輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)合成分泌的促炎介質(zhì)白介素(IL)-17信號(hào)通路異常在神經(jīng)退行性病變PD發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[7]。

中醫(yī)將PD劃為“顫證”范疇,多與肝、脾、腎等臟腑功能有關(guān),肝氣橫逆克伐脾土,脾胃受損會(huì)導(dǎo)致中州運(yùn)行不暢,腸腑功能不通[8]。中醫(yī)學(xué)在PD治療方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),多種中草藥可通過(guò)多個(gè)通路或靶點(diǎn)治療PD等神經(jīng)退行性疾病。黃芪作為一種補(bǔ)氣良藥,具有補(bǔ)腎健脾之功效,同時(shí)其活性成分黃芪黃酮、黃芪皂苷、黃芪多糖等均具有良好的抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等功效[9-11],在保護(hù)PD神經(jīng)元方面具有潛在價(jià)值[12],但關(guān)于黃芪治療PD的具體作用機(jī)制和路徑目前尚未完全闡明。本研究以1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)構(gòu)建的PD小鼠模型為對(duì)象,觀察黃芪提取物對(duì)模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能和IL-17信號(hào)通路中抗腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)等蛋白表達(dá)水平的影響,以探究黃芪提取物治療PD的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買(mǎi)30只8周齡雄性C57BL/6小鼠[許可證:SCXK(湘)2021-0012]為研究對(duì)象。小鼠于光照黑暗交替各12 h環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)相對(duì)濕度控制在50%～60%,溫度24 ℃左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:黃芪飲片(批號(hào)202306005,云南好醫(yī)生云福中藥飲片有限公司);葡萄糖(批號(hào)23B1601,天津鼎盛鑫);黃芪皂苷Ⅳ(批號(hào)84687-43-4,天津士蘭科有限公司);蘆丁(批號(hào)207671-50-9,上海一基生物);MPTP(批號(hào)28289-54-5,百靈威);丙磺舒(批號(hào)57-55-9,武漢合中);RIPA裂解液(批號(hào)R0010,Solarbio);BCA試劑盒(批號(hào)PC0020,北京索萊寶);兔抗IL-17(批號(hào)600-401-BU8,武漢艾美捷);兔抗TRAF-6(批號(hào):P4044Rb-h,上海麗臣商貿(mào)有限公司);兔抗NF-κB(批號(hào)YT746,北京百奧萊博);兔抗IL-1β(批號(hào)103-P11,德國(guó)Relia Tech);兔抗IL-6[批號(hào)Rab(P)17162,上海圻明生物];兔抗TNF-α(批號(hào)103-P35,德國(guó)Relia Tech);兔抗COX-2(批號(hào)AF-0010,北京鼎國(guó)昌盛);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)A21020,武漢艾美捷)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)RE-52,北京歐萊德);真空恒溫干燥箱(型號(hào)HE-WD-300,東莞豪恩);紫外分光光度計(jì)(型號(hào)721,上海赫爾普);轉(zhuǎn)棒疲勞儀(型號(hào)ZL-200C,安徽耀坤)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃芪提取物制備:取200 g黃芪飲片,加入1000 ml蒸餾水浸泡30 min,開(kāi)大火煮沸轉(zhuǎn)中火煎煮30 min,紗布過(guò)濾;殘余藥渣再次加500 ml蒸餾水煎煮30 min后過(guò)濾;取2次濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,于60 ℃條件下水浴濃縮,恒溫干燥箱干燥成粉。以葡萄糖、黃芪皂苷Ⅳ和蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品,紫外分光光度法測(cè)得黃芪提取物中總黃芪多糖、黃芪皂苷及黃芪黃酮含量分別為64.33%、0.74%和10.35%。提取黃芪干燥物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與建模:將小鼠隨機(jī)均分為五組,每組6只。模型組和各濃度黃芪組均腹腔注射MPTP誘導(dǎo)構(gòu)建PD模型。每日晨起8:30按照30 mg/kg的劑量腹腔注射MPTP試劑,60 min后按照250 mg/kg的劑量注射丙磺舒,1次/d,連續(xù)注射5 d;對(duì)照組相同時(shí)間內(nèi)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。從第6天開(kāi)始,低、中、高濃度黃芪組分別在相同時(shí)間以50、100、200 mg/kg的黃芪提取物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃,1 d/次,連續(xù)灌胃14 d;模型組和對(duì)照組則以相同方式以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。末次給藥后次日對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn)和爬桿實(shí)驗(yàn),斷頭取腦,去掉小鼠頭皮與顱骨,迅速分離出各組小鼠大腦黑質(zhì)組織,-80 ℃保存待用。

1.2.3 小鼠行為表現(xiàn):①轉(zhuǎn)棍實(shí)驗(yàn)。建模前3 d開(kāi)始,將小鼠置于直徑3 cm轉(zhuǎn)棒儀棍棒上,設(shè)置啟動(dòng)速度為5 r/min,從起始轉(zhuǎn)速增加至15 r/min,訓(xùn)練小鼠使之能在最大轉(zhuǎn)速時(shí)停留于轉(zhuǎn)棒時(shí)間達(dá)到120 s。末次灌胃后次日測(cè)試三組小鼠在轉(zhuǎn)速為15 r/min時(shí)于棍棒上保持時(shí)間,記為掉落潛伏期,每只小鼠做3次,取平均值;最后采用梯形算法計(jì)算三組小鼠總體棍棒評(píng)分。②爬桿實(shí)驗(yàn)。選擇直徑1 cm、高度50 cm、頂端帶有直徑3 cm圓球的爬桿,爬桿具有防滑處理。于建模前1 d將小鼠置于圓球上,觀察小鼠頭向下時(shí)間(T1),若其在圓球上停留時(shí)間超過(guò)30 s,則引導(dǎo)小鼠沿桿向下爬行,記錄小鼠由桿頂爬至桿底所用時(shí)間(T-LA),重復(fù)3次。末次灌胃后次日再次測(cè)試三組小鼠T1和T-LA。

1.2.4 免疫組化測(cè)定酪氨酸羥化酶:分離腦黑質(zhì)致密區(qū)(Substantia nigra pars compact,SNpc)組織,常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、酒精梯度水化,室溫封閉20 min,滴加濃度為1∶100的酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH),4 ℃孵育過(guò)夜,添加二抗,室溫孵育90 min,添加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下觀察,以棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá),計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.5 Th17細(xì)胞數(shù)目測(cè)定:分離SNpc組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、酒精梯度水化、非免疫血清37 ℃封閉20 min后,采用CD4+、RORrt熒光抗體,4 ℃孵育過(guò)夜;加入二抗37 ℃條件下孵育90 min,添加DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色,封片。倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況,400倍鏡下觀察切片Th17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,取連續(xù)10個(gè)視野計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量:取分離得到小鼠紋狀體腦組織,加入RIPA裂解液,置于冰上做勻漿處理;4 ℃,15000 r/min離心15 min,分離上清液至EP管中。取1 μl上清液,采用BCA試劑盒測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)濃度;其余部分按照1∶4加入5×加載緩沖液,95 ℃變性5 min,冰上冷卻后電泳,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,10%脫脂奶粉搖床上封閉處理1 h。分別加入IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2一抗和β-actin(內(nèi)參),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST緩沖液沖洗3次,5 min/次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,TBST沖洗3次,5 min/次,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。Image-Lab 6.1凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計(jì)算各組小鼠SNpc區(qū)組織中IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,行單因素方差分析后采用LSD檢驗(yàn);P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為表現(xiàn)情況比較 見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯縮短,爬桿實(shí)驗(yàn)的T1和T-LA明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯延長(zhǎng),爬桿實(shí)驗(yàn)的T1和T-LA明顯縮短(均P<0.05),且黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表1 各組小鼠行為表現(xiàn)情況比較(s)

2.2 各組小鼠SNpc區(qū)TH表達(dá)和Th17細(xì)胞數(shù)目比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠SNpc區(qū)TH表達(dá)水平下降,Th17細(xì)胞數(shù)目增多(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠SNpc區(qū)TH表達(dá)水平升高,Th17細(xì)胞數(shù)目減少(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表2 各組小鼠SNpc區(qū)TH表達(dá)和Th17細(xì)胞數(shù)目比較

2.3 各組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表3 各組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平下降(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表4 各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活和黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失是PD主要病理改變,然而,關(guān)于多巴胺能神經(jīng)元變性壞死的病理機(jī)制目前尚未完全明確。目前認(rèn)為PD發(fā)生與年齡、細(xì)胞凋亡、興奮性神經(jīng)毒、氧化應(yīng)激、免疫炎癥異常等有關(guān)[13-14]。現(xiàn)代研究證實(shí),PD存在明顯的免疫炎癥失調(diào),紋狀體炎癥可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞,誘導(dǎo)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡[15]。傳統(tǒng)PD治療以補(bǔ)充多巴胺為主,但長(zhǎng)期服用藥物可能會(huì)引發(fā)藥物相關(guān)性運(yùn)動(dòng)波動(dòng)和運(yùn)動(dòng)障礙,而且對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用不明顯[16]。探究具有神經(jīng)保護(hù)作用的PD治療方法成為臨床工作者努力的方向。

黃芪是一種具有補(bǔ)氣固表、補(bǔ)血生肌、利尿排膿等功效的中草藥,其提取物中含有黃芪多糖、黃芪黃酮、黃芪皂苷等多種活性成分,可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,從而維持大腦組織中神經(jīng)細(xì)胞完整性,延緩或改善神經(jīng)元的退行性病變[17];同時(shí),可通過(guò)降低炎癥細(xì)胞激活,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥浸潤(rùn)和神經(jīng)元的炎癥損傷[18]?，F(xiàn)代研究闡明,黃芪提取物可通過(guò)多靶位點(diǎn)、多通路發(fā)揮PD治療作用[19-20]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦組織中固有免疫細(xì)胞,與T淋巴細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞、白細(xì)胞等共同參與神經(jīng)元損傷后免疫反應(yīng)[21]。研究證實(shí),在PD患者大腦SNpc區(qū)存在明顯CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,T淋巴細(xì)胞會(huì)損傷血腦屏障,引發(fā)局部特異性免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的免疫性損傷破壞[22]。Th17細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原提呈刺激后分化而來(lái)的T淋巴細(xì)胞,可分泌IL-17、TNF-α、IL-21等多種促炎介質(zhì),其中IL-17是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子,也是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子,可通過(guò)TRAF6/NF-κB、TRAF6/AP-1、TRAF6/MAPKs/AP-1等多種途徑,啟動(dòng)IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2等炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄,誘發(fā)局部炎癥性損傷[23]。有關(guān)研究表明,敲除IL-17基因可抑制MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其激活后形態(tài)與功能損傷[24]。

本研究通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯縮短,爬桿實(shí)驗(yàn)的T1和T-LA明顯延長(zhǎng),SNpc區(qū)TH表達(dá)水平明顯下降,Th17細(xì)胞數(shù)目和IL-17相對(duì)表達(dá)量明顯升高。說(shuō)明Th細(xì)胞激活和IL-17上調(diào)表達(dá)是促進(jìn)多巴胺神經(jīng)元丟失的重要機(jī)制。TRAF6和NF-κB是IL-17信號(hào)通路下游必不可少的銜接蛋白,其中TRAF6是ACT1的關(guān)鍵底物;NF-κB是與T淋巴細(xì)胞發(fā)育、免疫細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)等有關(guān)的炎癥轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB激酶抑制物相關(guān)激酶與ACT1相互作用,參與IL-17介導(dǎo)的NF-κB激活[25]。IL-17/NF-κB信號(hào)通路激活被證實(shí)是導(dǎo)致PD神經(jīng)元死亡的重要原因之一[26]。本研究對(duì)比顯示,與模型組相比,黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯延長(zhǎng),爬桿實(shí)驗(yàn)T1和T-LA明顯縮短,SNpc區(qū)TH表達(dá)水平升高,Th17細(xì)胞數(shù)目減少,紋狀體區(qū)IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯下降,提示黃芪提取物可通過(guò)抑制IL-17信號(hào)通路激活,保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的炎癥性凋亡,改善PD小鼠行為表現(xiàn)。此外,本研究結(jié)果顯示,黃芪提取物對(duì)PD小鼠的影響作用與黃芪提取物濃度顯著相關(guān),隨著黃芪提取物灌胃濃度增加,其對(duì)PD小鼠行為表現(xiàn)、SNpc區(qū)TH表達(dá)水平、Th17細(xì)胞數(shù)目、IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)水平的影響作用逐漸增強(qiáng)。

綜上所述,黃芪提取物能有效改善PD模型小鼠活動(dòng)能力,保護(hù)SNpc區(qū)TH陽(yáng)性神經(jīng)元,其機(jī)制可能與抑制IL-17/TRAF-6/NF-κB信號(hào)通路,減少多巴胺神經(jīng)元的炎癥性損傷凋亡有關(guān)。