羅非魚抗氧化肽的制備及其抗疲勞功效研究進展

李國祥 安琪

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.016

引文格式：李國祥，安琪.羅非魚抗氧化肽的制備及其抗疲勞功效研究進展[J].中國調(diào)味品，2024，49（3）：96-100.

LI G X， AN Q.Research progress on preparation of antioxidant peptides from tilapia and their anti-fatigue effects[J].China Condiment，2024，49（3）：96-100.

摘要：羅非魚是一種營養(yǎng)豐富的淡水魚，富含蛋白質(zhì)，深受消費者喜愛。生物活性肽在食物蛋白中沒有生物活性，需要從食物蛋白中釋放出來才具有生物活性功效。酶解法是一種高效、安全、反應溫和且不會影響蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的常見生物活性肽制備工藝?；诖?，該研究采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化羅非魚的酶解工藝條件，研究結果表明，不同影響因素對低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率的影響不同；低聚肽含量和抗氧化活性之間無明顯關聯(lián)，最后獲得的最佳羅非魚酶解工藝為酶解溫度45 ℃、pH值5、酶解時間4 h和料液比例1∶2，該加工工藝條件下，低聚肽含量為96.8%，DPPH自由基清除率為67.56%，·OH清除率為50.21%，為羅非魚深加工相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎。

關鍵詞：低聚肽；酶解法；抗氧化活性；抗疲勞

中圖分類號：TS254.1????? 文獻標志碼：A????? 文章編號：1000-9973（2024）03-0096-05

Research Progress on Preparation of Antioxidant Peptides from

Tilapia and Their Anti-Fatigue Effects

LI Guo-xiang， AN Qi

（Zhengzhou Sias University， Xinzheng 451150， China）

Abstract： Tilapia is a nutritious freshwater fish with high protein content， and it is very popular with consumers. Bioactive peptides have no biological activity in food proteins and need to be released from food proteins in order to have bioactive effects. Enzymatic hydrolysis is a common bioactive peptide preparation process that is efficient， safe， mild in reaction， and does not affect the nutritional value of proteins. Based on this， single factor test and orthogonal test are used to optimize the enzymatic hydrolysis process conditions of tilapia in this study. The research results show that different influencing factors have different effects on the oligopeptide content， DPPH free radical scavenging rate and ·OH scavenging rate. There's no obvious correlation between oligopeptide content and antioxidant activity. Finally， the optimal enzymatic hydrolysis process is obtained as follows： enzymatic hydrolysis temperature is 45 ℃， pH value is 5， enzymatic hydrolysis time is 4 h and solid-liquid ratio is 1∶2. Under such processing technology conditions， the oligopeptide content is 96.8%， DPPH free radical scavenging rate is 67.56%， and ·OH scavenging rate is 50.21%， which has laid a foundation for the development of tilapia deep processing related industries.

Key words： oligopeptide; enzymatic hydrolysis method; antioxidant activity; anti-fatigue

收稿日期：2023-08-21

基金項目：2022年河南省軟科學研究計劃項目（212400410387）

作者簡介：李國祥（1989—），男，講師，碩士，研究方向：運動營養(yǎng)學。

我國羅非魚的主要產(chǎn)地分布在南方地區(qū)，包括江蘇、浙江、福建、廣東、廣西、海南、云南等地[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，羅非魚的產(chǎn)量逐年增加[3]。截至2021年，我國羅非魚的年產(chǎn)量已經(jīng)超過400萬噸，我國是羅非魚養(yǎng)殖大國，也是全球羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的龍頭[4-5]。廣東、福建和江蘇等省份的羅非魚產(chǎn)量居全國前列[6]。

我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受益于其高產(chǎn)、易養(yǎng)殖、抗病能力強等特點，以及政府的支持和投資[7]。近年來，中國羅非魚的出口量不斷增加，遠銷歐美、東南亞、非洲等地，為我國的漁業(yè)經(jīng)濟作出了重要貢獻[8]。

羅非魚是一種營養(yǎng)豐富、高蛋白、低脂肪的淡水魚類，其肉質(zhì)細嫩、口感好、營養(yǎng)價值高，每100 g羅非魚肉中蛋白質(zhì)含量可達18 g。羅非魚含有豐富的不飽和脂肪酸，尤其富含ω-3脂肪酸[9-10]，對人體有益，具有降血脂、預防心血管疾病等功能。羅非魚還含有豐富的礦物質(zhì)和維生素，如鈣、磷、鐵、鋅、維生素A、維生素B等，能夠提高人體免疫力，促進骨骼生長發(fā)育[11]。羅非魚還被認為具有清熱解毒、涼血止血等功效，被用于治療中暑、熱病、出血等癥狀，具有重要的保健作用[12]。

羅非魚抗氧化肽是指從羅非魚魚肉、魚鱗、魚皮等部位提取的具有抗氧化作用的多肽分子[13-14]。近年來，羅非魚抗氧化肽的研究逐漸受到重視。研究表明，羅非魚抗氧化肽具有較強的自由基清除能力，能抑制氧化反應，減輕細胞氧化應激，預防多種疾病的發(fā)生[15]?？偟膩碚f，羅非魚抗氧化肽具有廣泛的應用前景，未來還需要進一步研究和開發(fā)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料與試劑

將新鮮羅非魚去除魚鱗、頭、尾、骨和內(nèi)臟，清洗干凈，制成肉糜，將魚肉糜用聚乙烯袋分裝，于-18 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

木瓜蛋白酶、DPPH自由基、·OH、三氟乙酸、甘氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽、桿菌肽和細胞色素。

1.2? 試驗儀器

電子天平、pH計、酶標儀、恒溫振蕩器、離心機、紫外分光光度計和高效液相色譜儀。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 酶解產(chǎn)物的制備

將羅非魚魚肉糜解凍后，加入一定比例的水攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值，將其放在恒溫水浴鍋中進行酶解，在水浴鍋中水浴15 min對酶進行滅活，冷卻，離心后取上清液，獲得羅非魚蛋白水解物。

1.3.2? 單因素試驗

以低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率為指標，研究酶解溫度、料液比例、酶解時間和pH值對羅非魚自溶的影響。在酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h、料液比例1∶2、pH值5的條件下，研究不同酶解溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）、pH值（4，4.5，5，5.5，6）、料液比例（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、酶解時間（2，3，4，5，6 h）對羅非魚自溶的影響。

1.3.3? 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對羅非魚自溶條件進行，包括酶解溫度（A）、酶解時間（B）和pH值（C），以低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率為指標，進行正交試驗，因素水平表見表1。

1.3.4? DPPH自由基和·OH清除率測定

DPPH自由基清除率和·OH清除率均根據(jù)試劑盒說明進行。

1.3.5? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 11進行方差分析，所有指標均測定3次，取平均值。

2? 結果和討論

2.1? 低聚肽（TPHs）的分子量分布

6種標準品按照色譜柱的分離條件進行分離，洗脫色譜圖見圖1。

根據(jù)標準品的相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對色譜保留時間作圖，獲得相對分子質(zhì)量的校正曲線，見圖2。

由圖2可知，線性回歸方程為y=－4.231 32x+30.231，相關系數(shù)R2=0.921 3，表明蛋白質(zhì)標準品的相對分子質(zhì)量和保留時間的相關性較高。

由圖3可知，羅非魚經(jīng)過酶法水解后，大多數(shù)大分子蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化成小分子肽。分子量小于180 Da的小分子肽被稱為游離氨基酸，TPHs中分子量小于1 000 Da的寡肽占比為70.23%，表明該肽段對TPHs的營養(yǎng)價值和生物活性起著主導作用。

2.2? 羅非魚自溶條件篩選

2.2.1? 溫度對羅非魚自溶效果的影響

溫度是影響酶促反應最重要的因素之一，在合適的溫度范圍內(nèi)酶促反應的效果才能達到最大。溫度對羅非魚自溶效果的影響見圖4。

由圖4可知，溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，低聚肽含量不斷升高，說明該溫度范圍內(nèi)羅非魚蛋白酶活性不斷增強。當溫度大于60 ℃時，低聚肽含量降低。低聚肽的變化曲線并未與羅非魚酶解產(chǎn)物的抗氧化活性呈正比，說明抗氧化活性不僅與分子量的大小有關，還與分子的結構相關。當溫度為55 ℃時，羅非魚酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和·OH清除率都相對較高，所以選擇50～60 ℃進行后續(xù)正交試驗。

2.2.2? pH值對羅非魚自溶效果的影響

pH值是酶促反應的重要條件，酶的催化作用只有在一定pH值條件下才會表現(xiàn)出來，過酸或過堿的環(huán)境均會導致酶蛋白空間結構受到破壞，從而使酶失去活性，造成酶活力下降。pH值對羅非魚自溶效果的影響見圖5。

由圖5可知，當pH值為4～5時，隨著pH值的不斷升高，低聚肽含量不斷升高，當pH值為5時，低聚肽含量達到最大值，為55%。之后隨著pH值的不斷升高，低聚肽含量不斷降低，這是由于pH值過高不適合酶活性的呈現(xiàn)，使得酶解效果降低，所以選擇pH值4.5～5.5進行后續(xù)正交試驗。

2.2.3? 時間對羅非魚自溶效果的影響

蛋白質(zhì)水解度和水解時間雖然有著一定的關系，但是當?shù)孜锖谋M時，酶的效力將會受到影響。時間對羅非魚自溶效果的影響見圖6。

由圖6可知，當時間為2～4 h時，低聚肽含量先降低后升高，之后隨著酶解時間的不斷增加，低聚肽含量并沒有呈現(xiàn)上升的趨勢，反而逐漸下降，這主要是由于反應初期底物足夠多，與蛋白酶充分反應，被分解成小分子肽，隨著時間不斷增加，酶解程度不斷加深，前期生成的低聚肽被分解成更小的氨基酸，使得低聚肽含量呈現(xiàn)下降趨勢。當酶解時間為4 h時，DPPH自由基和·OH清除率均最高，所以選擇3～5 h進行后續(xù)正交試驗。

2.2.4? 料液比例對羅非魚自溶效果的影響

由圖7可知，隨著料液比例的增加，低聚肽含量不斷降低，酶和底物接觸的機會逐漸減少，從而影響酶解效果。陳憶鳳等[16]在研究鳀魚酶解工藝時也表明，隨著料液比例的增加，鳀魚的水解度不斷降低。當料液比例最?。?∶2）時，低聚肽含量最高，此時DPPH自由基和·OH清除率也最大。

2.3? 酶解工藝的優(yōu)化試驗

2.3.1? 正交試驗結果及分析

使用Design-Expert 12軟件進行試驗設計，試驗方案及結果見表2。擬合與優(yōu)化低聚肽含量（Y1）、DPPH自由基清除率（Y2）、·OH清除率（Y3）與酶解溫度（A）、酶解時間（B）和pH值（C）的二次多元回歸方程如下：

Y1=95.23－0.21A－0.20B－0.03C－0.08AB－0.33AC+0.003BC+0.55A2－0.26B2－0.02C2；

Y2=62.11－0.44A+0.51B+2.11C－0.31AB－1.44AC+1.57BC－1.11A2+3.21B2－1.31C2；

Y3=52.12－3.35A－1.13B－0.05C－2.13AB－0.68AC－0.02BC－5.53A2+2.47B2－2.31C2。

2.3.2? 回歸模型檢測

采用回歸方差分析對羅非魚水解產(chǎn)物的低聚肽含量和抗氧化活性的影響因素進行分析，回歸模型的各項方差分析結果見表3～表5。

由表3～表5可知，模型的F值分別為73.27，7.52和11.78，P值分別為<0.001，0.007 2和0.003 1，均小于0.05，表明這些影響因素對低聚肽含量和抗氧化活性具有顯著影響。失擬項的P值分別為0.117 4，0.532 1和0.265 3，說明二次多項式方程的擬合度較高。

綜上所述，回歸模型對試驗結果的預測和實際因素的擬合效果較好。羅非魚最佳酶解工藝為酶解溫度45 ℃、pH值5、酶解時間4 h和料液比例1∶2，該加工工藝條件下，低聚肽含量為96.8%，DPPH自由基清除率為67.56%，·OH清除率為50.21%。

2.4? 羅非魚小分子肽抗疲勞研究進展

羅非魚小分子肽是從羅非魚魚肉中提取出來的一種生物活性小分子肽，具有很好的抗疲勞作用。隨著近年來研究的深入，其抗疲勞作用機制已經(jīng)得到了一定的認識[17-18]。羅非魚小分子肽具有很強的抗氧化作用，可以抑制自由基的生成和脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，從而減少細胞的氧化損傷，延緩疲勞的發(fā)生；羅非魚小分子肽可以促進細胞內(nèi)的能量代謝，提高肌肉的能量供應，從而延緩肌肉疲勞；羅非魚小分子肽可以調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，降低身體的應激反應，減少疲勞的發(fā)生；羅非魚小分子肽可以促進肌肉生長，增加肌肉質(zhì)量和力量，從而提高身體的耐力和抗疲勞能力。

目前，羅非魚小分子肽的抗疲勞研究已經(jīng)取得了一定的進展。陳悅等[19]通過體外試驗和動物試驗的方法，發(fā)現(xiàn)羅非魚小分子肽可以顯著減輕運動后的疲勞程度，延長運動時間和距離，提高身體的耐力和抗疲勞能力。此外，一些臨床試驗也顯示，羅非魚小分子肽可以改善身體的疲勞感，提高生活質(zhì)量。

雖然羅非魚小分子肽的抗疲勞作用已經(jīng)得到了一定的證實，但其具體的作用機制和在臨床應用中的安全性和有效性仍需要進一步的研究和驗證。

3? 小結

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化羅非魚酶解工藝條件，研究結果表明不同影響因素對低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率的影響不同；低聚肽含量和抗氧化活性之間無明顯關聯(lián)。最后獲得的最佳酶解工藝為酶解溫度45 ℃、pH值5、酶解時間4 h和料液比例1∶2，該加工工藝條件下，低聚肽含量為96.8%，DPPH自由基清除率為67.56%，·OH清除率為50.21%，為羅非魚深加工相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了基礎。

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