雞血藤指紋圖譜的建立及抗腫瘤譜效關(guān)系研究

聶鈺湘，郭占京，閤雪晴，韋敏珍，余遠(yuǎn)智，何麗霞，黃宏妙

廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn 的干燥藤莖，具有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止疼，活絡(luò)筋脈的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明雞血藤粗提物或者總黃酮類物質(zhì)也具有顯著的抗腫瘤作用[2-6]，如雞血藤醇提物可抗鼠肝癌S180活性[4]，總黃酮類物質(zhì)可不同程度地抑制肝癌細(xì)胞凋亡[6]，但是其具體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并未明確。為了尋找雞血藤抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)，王宏等[7]和富琦等[8]在發(fā)現(xiàn)雞血藤黃酮類組分具有顯著抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，建立了富含黃酮類化合物的有效組分雞血藤黃酮類抗腫瘤活性部位的HPLC 指紋圖譜，王妮佳[9]也基于UPLC 色譜法建立了8 個(gè)產(chǎn)地的雞血藤鞣質(zhì)類成分（抗腫瘤活性組分）的指紋圖譜。但是這些研究只是采用指紋圖譜闡明了雞血藤抗腫瘤活性部位或某物質(zhì)大類的化學(xué)成分組成，并未與其藥效聯(lián)系起來(lái)，未能直接闡明雞血藤抗腫瘤活性具體的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有一定局限性。

中藥譜效關(guān)系則可以將中藥指紋圖譜與中藥藥效通過各種數(shù)據(jù)處理進(jìn)行分析，篩選出與藥效密切相關(guān)的中藥成分[10]。因此，本研究通過建立雞血藤HPLC 指紋圖譜，采用灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘回歸分析等數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，將雞血藤指紋圖譜信息與雞血藤體外抗人肝癌HepG2 細(xì)胞藥效進(jìn)行綜合分析，期望篩選出雞血藤主要抗腫瘤活性成分（群），初步揭示雞血藤體外抗腫瘤活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

雞血藤藥材購(gòu)買于不同市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬雯芳教授鑒定為豆科植物密花豆S.suberectusDunn 的干燥藤莖。樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 雞血藤樣品信息Table 1 Sample information of Spatholobi Caulis

1.2 試劑

對(duì)照品原兒茶酸（批號(hào)RP190605）成都麥德生科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.99%；對(duì)照品兒茶素（批號(hào) DST220929-047）、葛根素（批號(hào)DSTDG000202 ）、大 豆 苷 元 （ 批 號(hào)DSTDD002001）、染料木素（批號(hào)DSTDR000202）均購(gòu)于樂美天醫(yī)藥德思特生物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；對(duì)照品芒柄花素（批號(hào)PS000674）成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；紫杉醇（批號(hào)RL211020），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，西安瑞林生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)于浙江天杭生物科技股份有限公司；四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）購(gòu)于阿拉?。?HepG2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.3 儀器

Waters 2998 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；CKX41SF 倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；HR1200-IIB2 生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；SQP電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，生命技術(shù)控股有限公司；HVA-110 全自動(dòng)立式高壓滅菌，日本Hirayama 公司。

2 方法

2.1 雞血藤HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱取原兒茶酸、兒茶素、葛根素、大豆苷元、芒柄花素、染料木素適量，用乙醇溶解，并置于容量瓶中定容，配制成一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。再分別吸取上述對(duì)照品溶液，稀釋為原兒茶酸0.063 0 mg/mL、兒茶素0.166 5 mg/mL、葛根素0.163 5 mg/mL、大豆苷元0.157 5 mg/mL、芒柄花素0.153 0 mg/mL、染料木素0.151 5 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液配制 取雞血藤藥材約50 g，以1∶50 加入70%乙醇，超聲提取30 min（40 Hz、240 W），重復(fù)提取3 次，濾過，合并提取液，濃縮，干燥，得提取物粉末。取各批次雞血藤提取物粉末，以70%乙醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 供試品溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶備用。

2.1.3 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，10% A；10～140 min，10%～23% A；140～160 min，23%～27% A；160～200 min，27%～33% A；200～210 min，33%～37% A；體積流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)制備雞血藤（S14）供試品溶液，以“2.1.3”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以1 號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤2.43%，相對(duì)峰面積RSD≤2.75%

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)平行制備6 份雞血藤（S14）供試品溶液，以“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，以1 號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤2.78%，相對(duì)峰面積RSD≤2.50%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)制備雞血藤（S14）供試品溶液，在0、4、8、12、16、20、24 h，以方法“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，以1 號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD≤2.35%，相對(duì)峰面積RSD≤2.83%。

2.1.7 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 按“2.1.2”項(xiàng)制備27 批雞血藤藥材供試品溶液，以“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，將液相譜圖以cdf 格式導(dǎo)出，用“中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.1 版）”打開進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS 21.0 進(jìn)行聚類分析，采用SPSS 21.0和SIMCA 14.1 進(jìn)行主成分分析。

2.2 抗腫瘤活性測(cè)定

2.2.1 樣品溶液準(zhǔn)備 精密稱取雞血藤提取物粉末20.0 mg，DMEM 培養(yǎng)基溶解，0.22 μm 細(xì)胞專用濾膜濾過，用培養(yǎng)基稀釋為不同質(zhì)量濃度，冷藏備用。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

2.2.3 MTT 法測(cè)定各樣品的抗腫瘤活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞制成1×105個(gè)/mL 的單細(xì)胞混懸液，按照文獻(xiàn)[11]方法測(cè)定各雞血藤樣品的細(xì)胞抑制率。將雞血藤樣品質(zhì)量濃度及對(duì)應(yīng)測(cè)定的腫瘤細(xì)胞抑制率導(dǎo)入軟件SPSS 21.0 中，經(jīng)處理可得半數(shù)抑制濃度（IC50）[12]。

2.3 譜效關(guān)系分析

2.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 將27 批雞血藤提取物的抗HepG2 細(xì)胞IC50值的倒數(shù)與HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積以初值法進(jìn)行歸一化處理，并以IC50值的倒數(shù)為母序列（Yk），共有峰峰面積為子序（Xi），通過公式計(jì)算參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)度[13-14]。

Aik＝(Δikmin＋ρΔikmax)＋(Δikman＋ρΔikmax)

Δik＝∣Yk－Xi∣

k為樣品編號(hào)，i為共有峰編號(hào)，Aik為關(guān)聯(lián)系數(shù)，ρ為分辨系數(shù)取0.5

2.3.2 偏最小二乘回歸分析 以各批次雞血藤HPLC指紋圖譜共有峰峰面積為自變量（X），雞血藤提取物抗HepG2 細(xì)胞IC50值的倒數(shù)為因變量（Y），利用SIMCA14.0 軟件，進(jìn)行偏最小二乘回歸[15]分析，建立回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 雞血藤HPLC 指紋圖譜分析

3.1.1 方法學(xué)考察 雞血藤樣品在重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性考察中，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，說(shuō)明該方法具有良好的可行性，可用于建立雞血藤的指紋圖譜。

3.1.2 雞血藤指紋圖譜的建立及共有峰指認(rèn) 用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1 版” 27 批不同地區(qū)雞血藤的液相譜圖，以S1 為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正，生成雞血藤HPLC 色譜疊加圖（圖1），得到共有峰對(duì)照?qǐng)D譜（圖2-B），共標(biāo)定出14 個(gè)共有峰；將共有峰對(duì)照?qǐng)D與混合對(duì)照品（圖2-A）比對(duì)，確定1 號(hào)峰為原兒茶酸，2 號(hào)峰為兒茶素，3 號(hào)峰為葛根素，9 號(hào)峰為大豆苷元，13 號(hào)峰為染料木素，14 號(hào)峰為芒柄花素。

圖1 雞血藤HPLC 指紋圖譜疊加圖Fig.1 Superimposed HPLC fingerprint of Spatholobi Caulis

圖2 混合對(duì)照品HPLC 圖 (A) 與雞血藤HPLC 對(duì)照指紋圖譜 (B)Fig.2 HPLC fingerprint of mixed standard (A) and HPLC fingerprint of Spatholobi Caulis (B)

3.1.3 相似度評(píng)價(jià) 在“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1 版”中得到27 個(gè)不同地區(qū)雞血藤相似度結(jié)果見表2。其中來(lái)自中國(guó)廣西（S8～S12、S27）、越南（S6、S7、S13～S16、S23～S25）、中國(guó)廣東（S21）、老撾（S22）的藥材相似度大于0.9，說(shuō)明這些產(chǎn)區(qū)的藥材化學(xué)特征接近；而來(lái)自中國(guó)云南的部分藥材（S2～S4、S19、S20）的相似度小于0.9，說(shuō)明該產(chǎn)區(qū)藥材與中國(guó)廣西、越南、中國(guó)廣東、老撾等產(chǎn)區(qū)藥材的化學(xué)特征存在一定的差異性。

表2 雞血藤樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of similarity evaluation of Spatholobi Caulis samples

3.1.4 聚類分析 在SPSS 21.0 軟件中導(dǎo)入27 批雞血藤共有峰峰面積，采用組間聯(lián)系，以平方歐氏距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)歐式間距為13 時(shí)，可聚為4 類，第1 類：S1～S6、S8、S17～S21、S24、S26；第2 類：S7、S9、S10、S13、S23、S25、S27；第3 類：S11、S12；第4 類S15、S22、S14、S16，表明不同產(chǎn)地的雞血藤藥材中化學(xué)成分存在一定差異，相同產(chǎn)地雞血藤的化學(xué)成分類似，如當(dāng)歐式間距為6 時(shí)，中國(guó)云南產(chǎn)地雞血藤聚為一類。

圖3 雞血藤聚類分析樹狀圖Fig.3 Clustering analysis tree diagram of Spatholobi Caulis

3.1.5 主成分分析

（1）特征值與貢獻(xiàn)率：將27 批雞血藤中14 個(gè)共有峰峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件，經(jīng)描述統(tǒng)計(jì)及標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到各主成分相關(guān)特征值及貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表3。以主成分特征值＞1 為依據(jù)，得到3 個(gè)主成分，第1 主成分方差貢獻(xiàn)率為49.765%，第2 主成分方差貢獻(xiàn)率為14.653%，第3主成分方差貢獻(xiàn)率為10.865%，累積方差貢獻(xiàn)率為75.274，該3 個(gè)主成分可基本反映出雞血藤藥材成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表3 主成分分析特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic values and contribution rates of principal component analysis

（2）成分矩陣：通過SPSS 21.0 軟件分析得到特征值與貢獻(xiàn)率的同時(shí)，也得到雞血藤共有峰。由成分矩陣見表4。以因子載荷大于0.5[16]分析，主成分1 信息主要來(lái)源于峰1～3、5、8～14；主成分2信息主要來(lái)源于峰6、4、7；主成分3 信息主要來(lái)源于峰13、12，由此可知引起雞血藤質(zhì)量差異的原因可能是多因素導(dǎo)致的結(jié)果。

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Load matrix table of principal components

（3）主成分得分與綜合得分分析：通過SPSS 21.0 方差貢獻(xiàn)率及成分矩陣分析，將27 批雞血藤共有峰峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為分配系數(shù)，計(jì)算27 批雞血藤各主成分得分與綜合得分，并進(jìn)行排序，樣品得分越高，表明該樣品質(zhì)量越好[17]。

結(jié)果顯示見表5，主成分綜合得分依次排序?yàn)镾14＞S22＞S11＞S16＞S15＞S12＞S10＞S23＞S9＞S17＞S25＞S7＞S27＞S13＞S2＞S26＞S19＞S18＞S3＞S6＞S4＞S1＞S21＞S20＞S24＞S5＞S8，綜合排名靠前大部分為越南、老撾、中國(guó)廣西的雞血藤，與聚類分析結(jié)果相似，說(shuō)明雞血藤藥材中共有成分在含量積累上受原產(chǎn)地生長(zhǎng)環(huán)境的影響，存在組間差距。

表5 雞血藤主成分得分和綜合得分Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of Spatholobi Caulis

運(yùn)用 SIMCA 14.1 軟件對(duì)27 批雞血藤藥材進(jìn)行主成分分析，以HPLC 指紋圖譜中14 個(gè)共有峰峰面積為變量，以此構(gòu)建27×14 的原始數(shù)據(jù)矩陣，繪制27 批不同地區(qū)雞血藤藥材的PCA 得分圖。結(jié)果見圖4，可將其分為3 類，S14 單獨(dú)為一類；S9～S12、S15～S17、S22、S23 為第2 類，主要為中國(guó)廣西、越南、老撾；S1～S8、S13、S18～S21、S24～S27 為第3 類。與SPSS 主成分分析綜合得分排序基本一致，排名第1 為第1 類，排名第2～10 為第2 類，主要為中國(guó)廣西、越南、老撾，及個(gè)別中國(guó)云南地區(qū)（S17），排名第10 以后為第3 類。由于地理環(huán)境，不同地區(qū)雞血藤存在質(zhì)量差異，而同地區(qū)間可能由采摘時(shí)節(jié)不同也有所差異。

圖4 雞血藤PCA 圖Fig.4 PCA of Spatholobi Caulis

3.2 雞血藤抗腫瘤活性考察

按照上述“2.2”項(xiàng)步驟對(duì)HepG2 細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，將雞血藤提取物對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制率導(dǎo)入SPSS 21.0 軟件中，用Probit 回歸分析計(jì)算IC50值。結(jié)果見表6，27 批雞血藤樣品對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制IC50值在1.319～2.769 mg/mL，其中S14對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其次為S23、S24，均為越南地區(qū)；而S1、S2、S26 對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制作用較弱，均來(lái)自于中國(guó)云南。初步說(shuō)明雞血藤對(duì)HepG2 細(xì)胞有抑制作用，不同產(chǎn)地雞血藤對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制作用強(qiáng)弱有所不同。

表6 雞血藤對(duì)HepG2 細(xì)胞的IC50 值Table 6 IC50 value of HepG2 cells induced by Spatholobi Caulis

3.3 雞血藤抗腫瘤譜效關(guān)系研究

3.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算結(jié)果見表7，其中特征峰1（原兒茶酸）、7、6、3（葛根素）、11、12、14（芒柄花素）、4、8、13（染料木素）關(guān)聯(lián)度大于0.9，即這些峰在雞血藤發(fā)揮抗腫瘤作用方面有主要貢獻(xiàn)；同時(shí)，雞血藤中14 個(gè)特征峰與抗腫瘤關(guān)系總體關(guān)聯(lián)度均大于0.7[18]，可表明雞血藤是通過其內(nèi)部的“有效組分群”共同發(fā)揮其抗腫瘤作用。

表7 灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果Table 7 Results of grey relational analysis

3.3.2 偏最小二乘回歸分析 偏最小二乘法回歸分析結(jié)果如下，圖5 為雞血藤抗HepG2 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)圖，即14 個(gè)特征峰抗HepG2 細(xì)胞活性標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：YHepG2＝?0.052X1＋0.190X2＋0.193X3－0.213X4＋0.078X5－0.252X6－0.224X7＋0.077X8＋0.122X9＋0.088X10＋0.073X11＋0.099X12＋0.036X13＋0.102X14；其中回歸方程系數(shù)的正、負(fù)代表各成分抗腫瘤活性的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，有10 個(gè)共有峰回歸系數(shù)為正數(shù)，即與抗腫瘤活性呈正相關(guān)，相關(guān)性大小依次為峰3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）、14（芒柄花素）、12、10、5、8、11、13（染料木素）；有4 個(gè)共有峰回歸系數(shù)為負(fù)值，即與抗腫瘤活性呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)性大小依次為峰6、7、4、1（原兒茶酸）。對(duì)各色譜峰VIP 進(jìn)行分析（圖6），VIP 值大于1 的特征峰有6 個(gè)，分別為峰6、2、3、4、7、9。綜合相關(guān)系數(shù)和VIP 值2 個(gè)指標(biāo)，即抗腫瘤活性呈正相關(guān)且VIP 值大于1的共有峰有3 個(gè)，分別為2（兒茶素）、3（葛根素）、9（大豆苷元）。綜合以上灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果可得出3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）是與雞血藤抗腫瘤作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 抗HepG2 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)圖Fig.5 Standard regression coefficient of anti-HepG2 cells

圖6 抗HepG2 細(xì)胞VIP 貢獻(xiàn)圖Fig.6 VIP contribution of anti-HepG2 cells

3.3.3 單體化合物抗腫瘤活性驗(yàn)證 通過灰色關(guān)聯(lián)度與偏最小二乘法分析結(jié)果，篩選出峰3（葛根素）、2（兒茶素）、9（大豆苷元）可能為雞血藤抗HepG2 細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)。為了驗(yàn)證譜效分析結(jié)果的可靠性，以紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)葛根素、兒茶素、大豆苷元進(jìn)行抗HepG2 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)。分別稱取化合物適量，配制為不同濃度含藥培養(yǎng)基，計(jì)算各單體化合物對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞抑制率，結(jié)果見圖7。各單體化合物均具有抑制HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)作用；陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇的IC50值為6.016 μg/mL，葛根素、兒茶素、大豆苷元IC50值分別為250.73、321.43、364.30 μg/mL，雖然各單體化合物細(xì)胞抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照藥紫杉醇，但是各單體化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率隨著濃度的升高而增強(qiáng)，存在劑量相關(guān)關(guān)系；且在相同質(zhì)量濃度下，各單體化合物對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率次依為葛根素＞兒茶素＞大豆苷元，體外驗(yàn)證結(jié)果與譜效相關(guān)性程度一致?？蛇M(jìn)一步驗(yàn)證葛根素、兒茶素、大豆苷元可能是雞血藤抗肝癌活性基礎(chǔ)物質(zhì)。

圖7 紫杉醇、葛根素、兒茶素、大豆苷元對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率Fig.7 Growth inhibition rates of paclitaxel, puerarin,catechin, and daidzein on HepG2 hepatoma cells

4 討論

4.1 HPLC 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)用Waters 2998 PDA 檢測(cè)器的液相型號(hào)，在210～400 nm 對(duì)雞血藤醇提液全波長(zhǎng)掃描，篩選出在260 nm 波長(zhǎng)下，色譜峰出峰較多，特征性強(qiáng)，因此，選擇波長(zhǎng)為260 nm。同時(shí)考察流動(dòng)相種類甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液，其中乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離效果較佳。進(jìn)一步探究乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）洗脫比例，洗脫程序?yàn)?～10 min，10%A；10～140 min，10%～23% A；140～160 min，23%～27% A；160～200 min，27%～33% A；200～210 min，33%～37% A 時(shí)，各色譜峰出峰時(shí)間適宜，峰型較好。

4.2 指紋圖譜

通過HPLC 法得到不同產(chǎn)區(qū)雞血藤指紋圖譜，比較相似度可發(fā)現(xiàn)相似度低于0.9 的批次均來(lái)自中國(guó)云南地區(qū)；而越南、中國(guó)廣西一帶中有效成分相似度高，均大于0.9；同時(shí)，雞血藤通過聚類分析可分為4 類，中國(guó)云南地區(qū)全部在第1 類中，第3 類與第4 類主要來(lái)自越南和中國(guó)廣西，與主成分分析分析相符。因此，相似度、聚類分析、主成分分析均說(shuō)明不同產(chǎn)地間藥材中有效成分組成受地理位置、生長(zhǎng)環(huán)境、采摘時(shí)節(jié)等影響較大，該分析可為種植雞血藤藥材在選址上提供參考價(jià)值。

4.3 譜效關(guān)系研究

中藥譜效關(guān)系主要是通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法分析指紋圖譜與藥效間的潛在關(guān)系，預(yù)測(cè)和篩選處中藥中的有效成分；其中，偏最小二乘回歸分析是以線性關(guān)系預(yù)測(cè)有效成分的作用強(qiáng)弱，具有一定的誤差性；灰色關(guān)聯(lián)度是根據(jù)開放數(shù)據(jù)的幾何曲線進(jìn)行評(píng)估，將2 種分析方法綜合比較，可以得到更全面的分析[18]?；谧V效關(guān)系中灰色關(guān)聯(lián)度與偏最小二乘回歸分析方法，將雞血藤HPLC 指紋圖譜共有峰與抗腫瘤活性數(shù)據(jù)通過數(shù)理統(tǒng)計(jì)手段進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明2 號(hào)峰兒茶素、3 號(hào)峰葛根素、9 號(hào)峰大豆苷元偏最小二乘標(biāo)準(zhǔn)方程回歸系數(shù)為正值，且VIP值＞1.0；通過對(duì)葛根素、兒茶素、大豆苷元抗HepG2肝癌細(xì)胞藥效驗(yàn)證研究發(fā)現(xiàn)，各單體成分均具有一定的抑制作用，其IC50值分別為250.73、321.43、364.30 μg/mL，在一定程度上驗(yàn)證了譜效關(guān)系研究結(jié)果。同時(shí)，有文獻(xiàn)表明兒茶素可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白、抗氧化抗炎等相關(guān)途徑，抑制腫瘤細(xì)胞活性[19-22]，葛根素與大豆苷元屬于異黃酮類物質(zhì)，可抑制腫瘤細(xì)胞周期、影響線粒體調(diào)控、基因蛋白的表達(dá)等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[23-25]。綜上所述，可認(rèn)為兒茶素、葛根素、大豆苷元是雞血藤抗HepG2 細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突