基于PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路研究逍遙散拆方藥隊(duì)揮發(fā)油部位對(duì)脂多糖致抑郁樣模型小鼠的作用及機(jī)制

謝志強(qiáng) ，胡靖文 ，曾九僧 ，陳 力, ，謝紅瀟 ，方 洋 ，曾 南 *

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥劑科，四川 成都 610500

抑郁癥作為一種精神疾病，因其較高的疾病負(fù)擔(dān)受到廣泛關(guān)注。抑郁癥患者會(huì)出現(xiàn)睡眠減少、食欲不振、興趣降低表現(xiàn)，甚至情緒、思維和認(rèn)知過(guò)程出現(xiàn)異常，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。抑郁癥的病理機(jī)制研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激與抑郁癥關(guān)系密切，氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)促氧化與抗氧化能力之間失衡，造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2]。大腦消耗氧氣較其他器官更多，并富含可氧化脂質(zhì)，其中ROS 生成也會(huì)更多，當(dāng)ROS 和抗氧化劑之間失衡造成腦內(nèi)氧化應(yīng)激，可導(dǎo)致神經(jīng)元DNA 的損傷[3-4]。氧化應(yīng)激參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信號(hào)通路[5]，還會(huì)激活炎癥信號(hào)通路如核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的釋放[6-7]。此外，蛋白質(zhì)氧化會(huì)導(dǎo)致過(guò)氧化物還原蛋白2（peroxiredoxin 2，PRDX2）增加致使腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生[8]。神經(jīng)炎癥同樣與抑郁癥密切相關(guān)，小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中獨(dú)特的免疫細(xì)胞，可為神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，維持神經(jīng)細(xì)胞的平衡[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后其M1 型釋放大量炎癥因子引發(fā)神經(jīng)炎癥，并引起神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平降低，破壞神經(jīng)可塑性，誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[10-11]。

逍遙散記載于宋代《太平惠民和劑局方》，為疏肝解郁名方，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散的拆方藥隊(duì)柴胡、當(dāng)歸、薄荷（CDB）具有與全方相當(dāng)?shù)目挂钟糇饔?，其作用機(jī)制可能與影響5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平有關(guān)[12-14]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CDB 揮發(fā)油部位能通過(guò)激活核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）路徑調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激改善嗅球摘除（olfactory bulbectomy，OB）模型大鼠抑郁樣行為，被認(rèn)為是CDB 抗抑郁作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[15]。此外，已有報(bào)道CDB 揮發(fā)油中的主要成分藁本內(nèi)酯能改善慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為[16]；L-薄荷酮也可有效抑制CUMS 小鼠海馬NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NODlike receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinasparate protease-1，Caspase-1）蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)炎癥來(lái)改善動(dòng)物抑郁樣行為[17]；L-薄荷醇可增加強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）小鼠腦組織5-HT、多巴胺（dopamine，DA）、γ-羥基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）水平[18]。由此，可認(rèn)為CDB 揮發(fā)油能通過(guò)減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)干預(yù)抑郁樣行為的發(fā)生，故本研究通過(guò)建立脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣模型，探究CDB 揮發(fā)油能否通過(guò)PI3K/蛋白激酶（protein kinase B，Akt）/Nrf2 通路改善氧化應(yīng)激從而干預(yù)神經(jīng)炎癥來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用，以期進(jìn)一步豐富、完善CDB 揮發(fā)油的抗抑郁作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證SCXK（京）2019-0010。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察室，許可證號(hào)SYXK（川）2020-124，溫度（23±2）℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，24 h 明暗交替飼養(yǎng)，晝夜各12 h（8: 00～20: 00）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20200312）。

1.2 藥材

柴胡（批號(hào)200801）購(gòu)自河北一仁藥業(yè)有限公司，當(dāng)歸（批號(hào)201022）購(gòu)自四川省中藥飲片有限公司，薄荷（批號(hào)190702）購(gòu)自四川利民中藥飲片有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室嚴(yán)鑄云教授分別鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.干燥根、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels.干燥根、唇形科植物薄荷MenthacanadensisLinnaeus.干燥地上部分，均符合《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

LPS（批號(hào)0000135947）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；鹽酸氟西?。ㄅ?hào)9833A，20 mg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)J20170022）購(gòu)自Patheon France 公司；小鼠TNF-α試劑盒（批號(hào)22B139）購(gòu)自伊科賽生物科技（太倉(cāng)）有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號(hào)E77S8BSLTM）購(gòu)自Elabscience公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)020821210429、020821210603、092721220627 ）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)032821210405、050222220714）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)120720210429）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210602、20220719）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Nrf2、Akt、PI3K、p-p65 兔多克隆抗體（批號(hào)分別為TA0639、TU421951、TU410470、TA8229）均購(gòu)自Abmart 公司；HO-1、p-Akt、p-PI3K、p65、BDNF、鈣結(jié)合銜接分子-1（ionized calcium-binding adapter molecule-1，Iba-1）兔多克隆抗體（批號(hào)分別為82206、4060、4228、8242、47808、17198）均購(gòu)自美國(guó)CST 公司；IL-1β兔多克隆抗體（批號(hào)AF4006）購(gòu)自Affinity 公司；β-actin 兔多克隆抗體（批號(hào)GB11001）、GAPDH 兔多克隆抗體（批號(hào)GB11002）、HRP 羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)GB23303）、HRP 羊抗鼠IgG 二抗（批號(hào)GB23301）均購(gòu)自Servicebio 公司；SOD1 小鼠單克隆抗體（批號(hào) sc-271014）購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.4 儀器

SYNS00000 型純水儀（Minipore 公司）；JCS 型電子天平秤（英衡電器有限公司）；Varioskan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、Revos 脫水機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；63024 型懸尾測(cè)試箱、63022型強(qiáng)迫游泳筒、63036 型燈箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；JB-P5 型包埋機(jī)、JB-L5 型凍臺(tái)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016 型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P 型組織攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；Pannoramic SCAN Ⅱ型病理切片掃描儀（3DHISTECH Kft 公司）；DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；ChemiDoc 免染型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 CDB 揮發(fā)油的制備

柴胡、當(dāng)歸、薄荷按配比稱取適量裝入燒瓶中[19]，加入8 倍量的水后，采用揮發(fā)油輕油提取器蒸餾6 h，提取過(guò)程中以錫箔紙遮住提取器刻度區(qū)避光，收集上層揮發(fā)油，無(wú)水硫酸鈉除水，得到黃色油狀液體，稱定質(zhì)量，計(jì)算得率為0.3%，保存于棕色瓶中，置?20 ℃冰箱備用。經(jīng)GC-MS 測(cè)定，CDB 揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯、薄荷腦、香芹酮、丁烯基苯酞質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45.89%、8.03%、4.60%、4.52%[15]。

2.2 分組、造模及給藥

雄性C57BL/6J 小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、鹽酸氟西?。?0 mg/kg）組和CDB揮發(fā)油高、低劑量（73.6、36.8 mg/kg）組，揮發(fā)油劑量設(shè)置按前期大鼠實(shí)驗(yàn)劑量換算而得[15]。CDB 揮發(fā)油用3%聚山梨酯80 與生理鹽水配制。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開(kāi)始ig 給藥（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig 等體積3%聚山梨酯80 與生理鹽水，連續(xù)給藥16 d。于給藥第13～15 天，除對(duì)照組外其余各組小鼠每日ip 1 mg/kg LPS（20 mL/kg）造模。造模后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，然后麻醉小鼠，眼眶取血分離血清，并在冰臺(tái)上剖取小鼠全腦及海馬組織。

2.3 行為學(xué)測(cè)試

2.3.1 糖水偏好測(cè)試（sucrose preference test，SPT）將小鼠單籠放置并禁食禁水24 h，準(zhǔn)備1%糖水瓶和純凈水瓶并稱定質(zhì)量，每個(gè)籠子上放置1 個(gè)純凈水瓶和1 個(gè)糖水瓶，2 h 交換2 個(gè)水瓶的位置，以小鼠4 h 內(nèi)糖水偏好率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

糖水偏好率＝糖水消耗量/總液體消耗量

2.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（ forced swimming test，F(xiàn)ST）實(shí)驗(yàn)前24 h 進(jìn)行強(qiáng)迫游泳訓(xùn)練，保持水溫（24±2）℃。將小鼠放入透明圓筒內(nèi)開(kāi)始計(jì)時(shí)6 min，前2 min 為小鼠適應(yīng)時(shí)間，記錄后4 min 小鼠累積不動(dòng)時(shí)間。采用SMART 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.3.3 懸尾實(shí)驗(yàn)（tail suspension test，TST） 將小鼠尾部3 分之1 處固定在懸尾箱中，倒置懸掛，從懸掛開(kāi)始計(jì)時(shí)6 min，前2 min 為小鼠適應(yīng)時(shí)間段，記錄小鼠后4 min 內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。以小鼠四肢懸空不動(dòng)、放棄掙扎為標(biāo)準(zhǔn)。采用SMART 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.4 小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6 水平檢測(cè)

小鼠全血室溫靜置1 h 后，3 500 r/min 離心15 min，分離血清。根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)小鼠血清IL-1β 和IL-6 水平。

2.5 小鼠海馬氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

小鼠取血后立即在冰臺(tái)上剖取海馬組織，置?80 ℃冰箱保存。稱取20 mg 海馬組織加入相應(yīng)試劑，將海馬組織研磨勻漿，12 000×g離心15 min，分離上清液。用BCA 法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)組織上清液SOD 活性及MDA、GSH 水平。

2.6 免疫熒光檢測(cè)小鼠海馬CA3 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活

將小鼠全腦于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)包埋后切片。切片脫蠟至水后用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后PBS 溶液（pH 7.4）洗滌。組化筆畫圈后加入自發(fā)熒光淬滅劑，沖洗后血清封閉30 min，然后滴加Iba-1 兔源抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 洗滌后加入熒光二抗避光孵育50 min，PBS 洗滌后滴加DAPI 避光孵育10 min，再次用PBS 洗滌加入抗熒光淬滅封片劑封片。將切片置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，DAPI 染出的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)為紅色。采用Image J 軟件進(jìn)行分析，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片上陽(yáng)性的累積熒光強(qiáng)度（integrated optical density，IOD）以及像素面積（AREA），并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度（average optical，AO）。

AO＝IOD/AREA

2.7 尼氏染色檢測(cè)小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷

取小鼠全腦于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)包埋、切片后脫蠟至水，放入預(yù)熱50 ℃的1%甲苯胺藍(lán)水溶液中染色45 min，水洗終止染色。顯微鏡下控制分化程度，水洗后烤干，二甲苯透明后加入中性樹(shù)膠封片。對(duì)小鼠海馬CA3 區(qū)進(jìn)行圖像采集，腦組織尼氏體呈深藍(lán)色，背景淡藍(lán)色。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的藍(lán)色作為判斷所有切片圖像陽(yáng)性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，方法同“2.6”項(xiàng)，計(jì)算AO 值。

2.8 Western blotting 檢測(cè)海馬BDNF、PI3K/Akt/Nrf2 以及NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取小鼠海馬組織20 mg，加入200 μL RIPA 裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑＝98∶1∶1）。低溫勻漿后冰上裂解1 h，12 000×g離心15 min，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液制備海馬組織樣本。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，4 ℃孵育對(duì)應(yīng)的一抗過(guò)夜，第2 天洗膜后孵育二抗，洗膜后在凝膠成像系統(tǒng)中成像，并通過(guò)Image Lab 軟件分析p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Nrf2、HO-1、SOD1、BDNF、p-p65、p65、IL-1β、Iba-1 蛋白表達(dá)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠行為學(xué)的影響

如表1 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠糖水偏好率明顯降低（P＜0.001），F(xiàn)ST、TST 的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.001），表明ip LPS 可導(dǎo)致小鼠快感缺失和獎(jiǎng)賞機(jī)制缺乏，絕望行為明顯增加，使動(dòng)物出現(xiàn)抑郁樣行為表現(xiàn)。與模型組比較，各給藥組小鼠糖水偏好率明顯升高（P＜0.01），TST 不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P＜0.05、0.01），CDB 揮發(fā)油高劑量組FST 不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P＜0.01），表明CDB揮發(fā)油能改善動(dòng)物抑郁樣行為。

表1 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為的影響 (±s, n = 12)Table 1 Effect of CDB volatile oil on LPS-induced depressive-like behavior in mice (±s, n = 12)

表1 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為的影響 (±s, n = 12)Table 1 Effect of CDB volatile oil on LPS-induced depressive-like behavior in mice (±s, n = 12)

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下表同。#P < 0.05 ##P < 0.01 ###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group, same as below tables.

組別 劑量/(mg·kg?1) 糖水偏好率/% FST 不動(dòng)時(shí)間/s TST 不動(dòng)時(shí)間/s對(duì)照 — 84.14±6.69 123.65±31.75 92.89±43.64模型 — 53.36±6.00### 193.76±33.06### 162.45±35.73###CDB 揮發(fā)油 36.8 70.42±8.48** 200.55±30.24 123.30±30.90*73.6 72.30±11.75** 120.01±17.97** 114.89±47.23**鹽酸氟西汀 10 71.48±8.32** 191.55±39.60 116.96±47.75**

3.2 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠血清炎癥因子水平的影響

如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平顯著增加（P＜0.001）。與模型組比較，CDB 揮發(fā)油各劑量組小鼠血清中IL-1β、TNF-α 水平顯著降低（P＜0.01），鹽酸氟西汀組TNF-α 水平顯著降低（P＜0.01）。

表2 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平的影響 (±s, n = 6)Table 2 Effect of CDB volatile oil on IL-1β and TNF-α in serum of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

表2 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠血清IL-1β 和TNF-α 水平的影響 (±s, n = 6)Table 2 Effect of CDB volatile oil on IL-1β and TNF-α in serum of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) IL-1β/(pg·mL?1) TNF-α/(pg·mL?1)對(duì)照 — 12.24±2.50 29.48±7.02模型 — 32.48±2.60### 82.46±18.68###CDB 揮發(fā)油 36.8 23.49±3.78** 48.08±12.54**73.6 20.67±4.14** 40.06±6.60**鹽酸氟西汀 10 29.92±2.90 44.00±11.99**

3.3 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬組織氧化應(yīng)激水平的影響

如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬MDA 水平顯著增加（P＜0.01），GSH 水平及SOD活性顯著降低（P＜0.05、0.01），提示LPS 可誘導(dǎo)小鼠中樞呈現(xiàn)氧化應(yīng)激表現(xiàn)。與模型組比較，CDB揮發(fā)油高劑量組和鹽酸氟西汀組MDA 水平顯著降低（P＜0.05），GSH 水平及SOD 活性均顯著升高（P＜0.05），提示CDB 揮發(fā)油能抑制LPS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表3 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬組織MDA、GSH 水平及SOD 活性的影響 (±s, n = 6)Table 3 Effect of CDB volatile oil on MDA, GSH levels and SOD activity in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

表3 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬組織MDA、GSH 水平及SOD 活性的影響 (±s, n = 6)Table 3 Effect of CDB volatile oil on MDA, GSH levels and SOD activity in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) MDA/(nmol·g?1) GSH/(μmol·g?1) SOD/(U·mg?1)對(duì)照 — 9.44±2.33 17.05±4.16 13.45±2.08模型 — 13.39±1.49## 8.75±1.87# 9.14±1.83##CDB 揮發(fā)油 36.8 10.56±3.43 12.79±5.88 10.57±1.96 73.6 9.98±1.21* 18.62±2.71* 12.06±1.87*鹽酸氟西汀 10 9.77±1.25* 17.68±5.38* 12.27±1.39*

3.4 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物Iba-1 表達(dá)的影響

如圖1 和表4 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區(qū)Iba-1 表達(dá)顯著增加（P＜0.001），提示LPS 可刺激中樞小膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而引起中樞神經(jīng)炎癥，進(jìn)而致使小鼠的行為學(xué)異常。與模型組比較，CDB 揮發(fā)油高劑量組和鹽酸氟西汀組小鼠海馬CA3 區(qū)Iba-1 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05、0.01），表明CDB 揮發(fā)油能有效抑制LPS 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。

圖1 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)Iba-1 表達(dá)的影響 (×200)Fig.1 Effect of CDB volatile oil on Iba-1 expression in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (× 200)

表4 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)Iba-1 表達(dá)的影響 (±s, n = 4)Table 4 Effect of CDB volatile oil on Iba-1 expression in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 4)

表4 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)Iba-1 表達(dá)的影響 (±s, n = 4)Table 4 Effect of CDB volatile oil on Iba-1 expression in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(mg·kg?1) Iba-1 表達(dá)對(duì)照 — 7.15±0.29模型 — 35.22±3.32###CDB 揮發(fā)油 36.8 22.40±3.68 73.6 11.28±3.43**鹽酸氟西汀 10 13.50±4.08*

3.5 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體的影響

如圖2 和表5 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體AO 值顯著降低（P＜0.001），提示模型組小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元有損傷。與模型組比較，各給藥組海馬CA3 區(qū)尼氏小體AO值均顯著降低（P＜0.05、0.01），表明CDB 揮發(fā)油能夠有效改善神經(jīng)元損傷。

圖2 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體的影響 (×400)Fig.2 Effect of CDB volatile oil on Nissl bodies in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (× 400)

表5 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體的影響 (±s, n = 4)Table 5 Effect of CDB volatile oil on Nissl bodies in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice(±s, n = 4)

表5 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體的影響 (±s, n = 4)Table 5 Effect of CDB volatile oil on Nissl bodies in CA3 region of hippocampus of LPS-induced depressive-like mice(±s, n = 4)

組別 劑量/(mg·kg?1) AO/%對(duì)照 — 2.10±0.35模型 — 0.79±0.13###CDB 揮發(fā)油 36.8 1.45±0.48*73.6 1.75±0.35**鹽酸氟西汀 10 1.42±0.31*

3.6 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬BDNF、PI3K/Akt/Nrf2 與NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3 和表6、7 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬組織BDNF 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），提示LPS 誘導(dǎo)的小鼠抑郁癥模型成功[20]。模型組小鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1 和SOD1 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05、0.01、0.001），提示模型組小鼠PI3K/Akt/Nrf2 通路被抑制，與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。模型組小鼠海馬pp65/p65 有升高趨勢(shì)，IL-1β 和Iba-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），提示模型組小鼠出現(xiàn)神經(jīng)炎癥。與模型組比較，CDB 揮發(fā)油高劑量組BDNF 和PI3K/Akt/Nrf2 通路相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05、0.01），IL-1β 和Iba-1 蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.05、0.01），提示CDB 揮發(fā)油能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用并抑制神經(jīng)炎癥，從而達(dá)到抗抑郁樣行為目的。

圖3 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬BDNF、PI3K/Akt/Nrf2 與NF-κB 通路蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of CDB volatile oil on protein expressions of BDNF, PI3K/Akt/Nrf2 and NF-κB pathway in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice

表6 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬BDNF 以及PI3K/Akt/Nrf2 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of CDB volatile oil on BDNF and PI3K/Akt/Nrf2 protein expressions in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

表6 CDB 揮發(fā)油對(duì)LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬BDNF 以及PI3K/Akt/Nrf2 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Table 6 Effect of CDB volatile oil on BDNF and PI3K/Akt/Nrf2 protein expressions in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1)蛋白相對(duì)表達(dá)量BDNF/β-actin p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt Nrf2/β-actin HO-1/β-actin SOD1/GAPDH對(duì)照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 0.47±0.11## 0.72±0.12# 0.38±0.11## 0.41±0.11### 0.58±0.14## 0.73±0.15#鹽酸氟西汀 10 1.04±0.28** 1.18±0.22* 1.07±0.24** 1.11±0.25** 1.24±0.32* 1.58±0.47*CDB 揮發(fā)油 73.6 1.06±0.26** 1.13±0.20* 1.13±0.29** 0.95±0.25** 1.20±0.36* 1.70±0.54*

表7 CDB 揮發(fā)油對(duì)小鼠海馬NF-κB、Iba-1 以及IL-β 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Table 7 Effect of CDB volatile oil on NF-κB, Iba-1 and IL-1β protein expressions in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

表7 CDB 揮發(fā)油對(duì)小鼠海馬NF-κB、Iba-1 以及IL-β 蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 6)Table 7 Effect of CDB volatile oil on NF-κB, Iba-1 and IL-1β protein expressions in hippocampus of LPS-induced depressive-like mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg?1) 蛋白相對(duì)表達(dá)量p-p65/p65 IL-β/β-actin Iba-1/GAPDH對(duì)照 — 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型 — 1.85±0.61 1.63±0.14## 2.61±0.56##鹽酸氟西汀 10 1.36±0.49 1.02±0.26** 1.47±0.47*CDB 揮發(fā)油 73.6 1.19±0.38 0.98±0.32** 1.44±0.32*

4 討論

逍遙散的拆方藥隊(duì)CDB 是基于功能藥隊(duì)拆方研究模式獲得的與逍遙散抗抑郁作用相當(dāng)?shù)木?jiǎn)方，方中柴胡疏肝解郁，調(diào)節(jié)氣機(jī)；當(dāng)歸養(yǎng)血和肝，補(bǔ)其虧損；薄荷增強(qiáng)升發(fā)疏泄，疏肝理脾。前期研究已證實(shí)CDB 對(duì)CUMS 模型動(dòng)物有良好的抗抑郁作用，作用機(jī)制與升高5-HT、BDNF 水平及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸功能亢進(jìn)有關(guān)[12,21]。因方中柴胡、當(dāng)歸、薄荷3 味藥物的揮發(fā)油含量均較為豐富，而芳香療法也被認(rèn)為是緩解抑郁癥的有效療法，揮發(fā)油及其有效成分易于透過(guò)血腦屏障，能快速與中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體相互作用而改善患者的焦慮和抑郁狀態(tài)[22-23]。GC-MS 分析發(fā)現(xiàn)CDB 揮發(fā)油主要成分包括藁本內(nèi)酯、薄荷腦、異薄荷酮等，上述成分均有通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活、抑制炎癥因子的釋放、抑制神經(jīng)元凋亡等作用來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用的報(bào)道[16,24]，提示CDB 揮發(fā)油可能是CDB 抗抑郁作用發(fā)揮的主要有效部位之一。此外，課題組前期OB 大鼠模型實(shí)驗(yàn)已表明 CDB 揮發(fā)油抗抑郁作用的發(fā)揮與激活Nrf2/HO-1 路徑調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，兩者均被認(rèn)為參與到抑郁癥發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中。OB 模型是通過(guò)手術(shù)摘除動(dòng)物嗅球以模擬抑郁癥患者嗅球萎縮，誘導(dǎo)動(dòng)物出現(xiàn)激越性抑郁樣行為，動(dòng)物水平運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著增加[25]；而LPS誘導(dǎo)的抑郁樣行為對(duì)動(dòng)物的自主活動(dòng)影響不突出，但2 種動(dòng)物模型均會(huì)表現(xiàn)出氧化應(yīng)激的發(fā)生，其中LPS模型相對(duì)更適合觀察藥物抗抑郁作用與抑制炎癥反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。本研究主要采用LPS 誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠模型，進(jìn)一步探究CDB 揮發(fā)油的抗抑郁作用及其干預(yù)PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路從而影響炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，為CDB 揮發(fā)油的深入研究奠定一定基礎(chǔ)。

LPS 誘導(dǎo)的動(dòng)物抑郁樣模型已被廣泛報(bào)道，ip LPS 可引起動(dòng)物血腦屏障通透性改變，誘發(fā)動(dòng)物神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激，致使動(dòng)物出現(xiàn)抑郁樣狀態(tài)[26-28]。本研究結(jié)果表明，ip LPS 所建立的小鼠抑郁樣模型，小鼠出現(xiàn)糖水偏好率降低，F(xiàn)ST 和TST 的不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，提示造模成功。此外，模型小鼠海馬組織MDA 水平升高，GSH 水平和SOD 活性降低，呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)；模型小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平升高，海馬小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，呈現(xiàn)炎癥反應(yīng)；小鼠海馬CA3 區(qū)尼氏小體消失，出現(xiàn)邊界模糊的形態(tài)，且神經(jīng)元密度降低，神經(jīng)元出現(xiàn)損傷。表明該模型呈現(xiàn)氧化應(yīng)激表現(xiàn)及神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而引起海馬部位神經(jīng)元損傷，由此與抑郁樣行為的發(fā)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)CDB 揮發(fā)油的前處理，能明顯對(duì)抗模型小鼠上述各項(xiàng)指標(biāo)的異常，如降低海馬MDA 水平，提高GSH 水平及SOD 活性，抑制氧化應(yīng)激；降低血清TNF-α、IL-1β 水平，抑制海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，升高CA3 區(qū)尼氏小體AO 值，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。CDB 揮發(fā)油高、低劑量均能有效改善模型小鼠的抑郁樣行為，調(diào)節(jié)MDA、GSH、TNF-α、IL-1β 水平和SOD 活性，并增加海馬尼氏小體數(shù)量，抑制海馬Iba-1 表達(dá)。因此進(jìn)一步的機(jī)制研究中，選用藥效相對(duì)為優(yōu)的CDB 揮發(fā)油高劑量（73.6 mg/kg）組的樣本開(kāi)展其對(duì)PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路影響的工作。

Nrf2 是與氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)的蛋白，Nrf2 可識(shí)別DNA 損傷并發(fā)揮修復(fù)和清除作用，且Nrf2 能調(diào)節(jié)BDNF 與IL-10 發(fā)揮保護(hù)作用[29-30]。BDNF 作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族中調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)可塑性有關(guān)的蛋白，研究證實(shí)抑郁癥患者海馬和前額葉皮層BDNF 表達(dá)明顯降低[20]，可作為臨床診斷抑郁癥的輔助指標(biāo)之一。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致Nrf2 受到抑制，并與PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制相關(guān)，而PI3K/Akt-Nrf2 通路的抑制則使抗氧化作用減弱，又會(huì)誘導(dǎo)NF-κB 信號(hào)通路的激活[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導(dǎo)的模型小鼠海馬組織中 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Nrf2、HO-1、SOD1 和BDNF的蛋白表達(dá)量明顯降低。與模型組比較，CDB 揮發(fā)油組上述相關(guān)蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，并且有降低pp65/p65 表達(dá)的趨勢(shì)，顯著抑制海馬部位Iba-1、ILβ 的表達(dá)，提示CDB 揮發(fā)油可能通過(guò)激活PI3K/Akt/Nrf2 信號(hào)通路提高抗氧化作用，并抑制NF-κB 信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮抗抑郁作用。

此外，前期研究表明CDB 揮發(fā)油在46 mg/kg、23 mg/kg 劑量下灌胃給予OB 模型大鼠有良好抗抑郁作用，本研究中依據(jù)大鼠有效劑量等效換算為小鼠給藥劑量73.6、36.8 mg/kg，相當(dāng)于原生藥量24.5、12.3 g/kg。該劑量遠(yuǎn)低于前期研究所發(fā)現(xiàn)的CDB 石油醚部位（與揮發(fā)油成分基本一致）半數(shù)致死量（50% lethal dose，LD50）的劑量，此劑量為臨床日用劑量1 554 倍，生藥量為851.4 g/kg[32]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)小鼠的一般觀察也未見(jiàn)異常情況，可認(rèn)為本研究中采用的CDB 揮發(fā)油劑量安全性高。

綜上，CDB 揮發(fā)油能改善LPS 誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，增加海馬CA3 區(qū)尼氏小體的合成，表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，作用發(fā)揮與其調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，提高GSH 水平及SOD 活性，降低MDA 水平發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)；以及進(jìn)一步影響NF-κB 信號(hào)通路，抑制海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活來(lái)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。但本研究尚未使用相關(guān)抑制劑阻斷關(guān)鍵蛋白表達(dá)后進(jìn)行反向驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可從此角度開(kāi)展深入研究，以明確CDB揮發(fā)油對(duì)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥影響的分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突