柴胡不同極性部位對(duì)肝癌SMMC-7721 細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

王威宇 ，陳一笑 ，白帥東 ，馮建有 ，秦雪梅 ，高曉霞 *

1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

2.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

3.地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，為前5 種最致命癌癥中唯一一種發(fā)病率每年增加的癌癥[1]。具有前期不易診斷、晚期致死率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅到患者的生命。而長(zhǎng)時(shí)間使用腫瘤消融技術(shù)和化療治療不僅隨著時(shí)間增加會(huì)產(chǎn)生耐藥性，而且給患者增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而中醫(yī)藥在治療肝癌方面的功效日漸突出，其針對(duì)肝癌伴發(fā)病狀的改善、癌痛的減輕或減緩、癌癥患者生存期的延長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重大作用[2-4]。

柴胡是傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有疏散退熱、疏肝解郁的功效[5]。柴胡對(duì)肝纖維化，肝癌等肝臟性疾病療效顯著，以柴胡為君藥的柴胡類方防治肝癌成為臨床報(bào)道及研究的焦點(diǎn)[6]。張?chǎng)┑萚7]將小柴胡湯聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞治療原發(fā)性肝癌療效顯著，顯著提高了患者生活質(zhì)量；王克窮運(yùn)用大柴胡湯于治療原發(fā)性肝癌[8]，取得了滿意的療效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡注射液對(duì)人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞有阻滯及促凋亡的作用[9]；小柴胡湯含藥血清誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡和自噬[10]。柴胡有效成分柴胡皂苷能夠發(fā)揮抗肝癌作用，柴胡皂苷b2能夠通過(guò)調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4（serine/threonine-protein kinase 4，STK4）/白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路抑制原發(fā)性肝癌[11]；柴胡皂苷D 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖和裸鼠肝癌形成具有抑制作用[12]。但柴胡其他有效成分如柴胡多炔、揮發(fā)油類等抗肝癌作用尚未研究。柴胡不同極性部位的化學(xué)成分不同，如課題組前期發(fā)現(xiàn)柴胡低極性部位含有多種多炔類成分[13]，因此探究柴胡不同極性部位的抗肝癌藥效和作用機(jī)制的研究尤為重要。

本研究以SMMC-7721 細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞LO-2 為對(duì)象，明確柴胡不同極性部位抗肝癌藥效強(qiáng)弱，采用分子生物學(xué)與代謝組學(xué)的方法探究柴胡不同極性部位的抗肝癌作用與機(jī)制，從而在分子層面及代謝方面對(duì)柴胡抗肝癌機(jī)制有更深入的認(rèn)識(shí)，為臨床肝癌治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

SMMC-7721 和LO-2 細(xì)胞均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

北柴胡（批號(hào)1805215131）購(gòu)自安國(guó)市吉騰達(dá)藥材有限公司，經(jīng)山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定為傘形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)E709FA0003）購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；0.25%胰酶（批號(hào)13F09A67）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（批號(hào)20170621）購(gòu)自天杭生物科技股份有限公司；MTT、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；分析級(jí)石油醚、醋酸乙酯購(gòu)自北京化工試劑；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）購(gòu)自北京北大藥業(yè)有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)PAB180007）購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；SYBR Green PCR 試劑盒（批號(hào)KM4101）購(gòu)自美國(guó)Kapa Biosystem 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)639505）購(gòu)自日本Takara公司；兔抗人神經(jīng)元PAS 結(jié)構(gòu)域蛋白2（neuronal pas domain protein 2，NPAS2）抗體（批號(hào)H00004862-D01）、細(xì)胞分裂周期蛋白25A（cell division cycle 25A，CDC25A）抗體（批號(hào)PAB0425）購(gòu)自Abnova公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）抗體（批號(hào)HPA001238）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號(hào)AB112）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號(hào)AG1208）購(gòu)自Beyotime 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號(hào)ab49822）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；組織金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）抗體（批號(hào)orb1248799）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）抗體（批號(hào)orb804756）購(gòu)自英國(guó)Biorbyt 公司；無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇（批號(hào)分別為10009218、10006818、80109218）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司；乙腈、甲酸（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；β-actin 抗體（批號(hào)AC038）購(gòu)自武漢愛博泰克公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)A1054）購(gòu)自美國(guó)Boster 公司。

1.4 儀器

Infinite M200 Pro 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；Neofuge 1600R/1600 型低溫離心機(jī)（力康集團(tuán)）；D180 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（瑞沃德生命科技有限公司）；NovoCyte 型流式細(xì)胞分析儀（ACEA 公司）；EPS300r 型電泳儀、5200 型化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）；Q Exactive UPLC-MS 型超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 柴胡不同極性部位及給藥溶液的制備

2.1.1 柴胡不同極性部位的制備 柴胡不同極性部位的制備詳見課題組前期報(bào)道[14]，以95%乙醇提取柴胡（1 kg），后采用石油醚萃取得到低極性部位（LPB）；石油醚萃取后剩余部位加入醋酸乙酯超聲萃取，得中極性部位（MPB）；醋酸乙酯萃取后，剩余部位與藥渣2 次水提物合并，得到高極性部位（HPB）。濃縮減壓干燥（60 ℃），分別得到LPB 64 g、MPB 33 g、HPB 168 g。LPB 含柴胡多炔RB2、RB4等代表性活性成分；MPB 含蘆丁、腺苷等成分；HPB含柴胡皂苷A、柴胡皂苷元G 等20 種皂苷成分。

2.1.2 給藥溶液的制備

（1）LPB 的制備：稱取約15 mg LPB 置于1.5 mL EP 管，加入150 μL DMSO，渦旋、超聲、離心，得到150 μL 質(zhì)量濃度為0.1 mg/μL 的儲(chǔ)備液；取10 μL 儲(chǔ)備液加入到10 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基中制得100 μg/mL 的工作液，依次稀釋工作液得到質(zhì)量濃度分別為5、15、25、35、45、65 μg/mL（折合成生藥量分別為0.078、0.234、0.390、0.546、0.703、1.015 mg/mL）的給藥溶液。

（2）MPB 的制備：同LPB 的制備方法，得到質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、14、16 μg/mL（折合成生藥量分別為0.061、0.121、0.181、0.242、0.424、0.485 mg/mL）的溶液。

（3）HPB 的制備：配制得到質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL（折合成生藥量為5.952 mg/mL）的給藥溶液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721 和LO-2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/L 青霉素、100 μg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 MTT 法檢測(cè)SMMC-7221 和LO-2 細(xì)胞增殖

SMMC-7221 和LO-2 細(xì)胞分別以1×105個(gè)/mL接種于96 孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對(duì)照組，LPB 組（生藥量0.078、0.234、0.390、0.546、0.703、1.015 mg/mL），MPB 組（生藥量0.061、0.121、0.181、0.242、0.424、0.485 mg/mL）和HPB 組（生藥量5.952 mg/mL），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。每孔加入100 μL 含10% MTT的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩搖勻，采用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率[9]。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞周期及凋亡

SMMC-7221 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，設(shè)置對(duì)照組，LPB（生藥量0.234、0.390、0.546 mg/mL）組和MPB（生藥量0.121、0.181、0.242 mg/mL）組，檢測(cè)細(xì)胞周期；設(shè)置對(duì)照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）組和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，檢測(cè)細(xì)胞凋亡。對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照文獻(xiàn)方法處理[15-16]，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMMC-7721 細(xì)胞遷移

SMMC-7221 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，培養(yǎng)12 h 后，于孔中央用200 μL 槍頭垂直“一”字劃痕，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌以清除細(xì)胞碎片。設(shè)置對(duì)照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）組和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，分別于0、12、24、36 h觀察劃痕傷口愈合情況并拍照，用Photoshop CS4 軟件“多邊形套索工具”計(jì)算劃痕面積[9]。

2.6 qRT-PCR 和Western blotting 檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)

SMMC-7721 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，設(shè)置對(duì)照組、LPB（生藥量0.390 mg/mL）和MPB（生藥量0.181 mg/mL）組，對(duì)照組加入培養(yǎng)基，給藥組加入藥物，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRTPCR 分析，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

收集細(xì)胞，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，4 ℃充分裂解細(xì)胞，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min 離心5 min，收集上清。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫孵育1 h，用ECL 顯影，掃描條帶[9]。

2.7 代謝組學(xué)研究

2.7.1 分組及給藥處理 取8 mL SMMC-7221 細(xì)胞培養(yǎng)液置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，分別加入8 mL LPB（生藥量0.390 mg/mL）和MPB（生藥量0.181 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不加入藥物的SMMC-7221 細(xì)胞作為模型組，不加入藥物的LO-2 作為正常組，每組平行6 個(gè)樣本。刮取細(xì)胞，加入預(yù)冷PBS 離心清洗2 遍，超聲破碎細(xì)胞，乙腈沉淀蛋白，低溫13 000 r/min 離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移到干凈EP 管，于真空冷凍離心干燥機(jī)干燥。以200 μL 初始流動(dòng)相（0.1%甲酸水溶液-乙腈9 1∶）復(fù)溶，低溫13 000 r/min 離心15 min，上清液進(jìn)UPLC-MS 分析[17]。另各取正常組、模型組、LPB 組、MPB 組細(xì)胞樣本液20 μL 混合，作為質(zhì)控樣本。

2.7.2 液相條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，2% B；4～5 min，2%～3% B；5～8 min，3%～15%B；8～13 min，15%～35% B；13～17 min，35%～55% B；17～23 min，55%～70% B；23～26 min，70%～80% B；26～28 min，80%～85% B；28～36 min，85%～95% B；36～38 min，95% B；38～40 min，95%～2% B；40～41 min，2% B；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.7.3 質(zhì)譜條件 采用ESI 離子化方式，噴霧電壓為正極3.5 kV，負(fù)極?2.5 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；加熱器溫度300 ℃；鞘氣體積流量35 arb；輔助氣體積流量10 arb；掃描模式為Full Scan/dd-MS2，采集范圍m/z100～1 500，正、負(fù)離子切換采集模式。分辨率采用MS Full Scan 35 000 FWHM，MS/MS 17 500 FWHM，碰撞能量為12.5、25、37.5 eV[18]。

2.7.4 數(shù)據(jù)處理 原始LC-MS/MS 數(shù)據(jù)raw 文件導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0 軟件，使用SIMCA 14.1進(jìn)行分析，結(jié)合變量投影重要性（variable importance in the project，VIP）＞1 和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＜0.05篩選共線性最大的差異變量。差異代謝物鑒定指認(rèn)主要通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、HMDB 及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)；接著將已鑒定的差異代謝物借助京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）在線數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道富集到相關(guān)代謝通路。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS statistics 16.0、Graphpad Prism 7.0、Excel 2016 等軟件處理，結(jié)果以±s表示。兩組數(shù)據(jù)間差異性比較采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 柴胡不同極性部位對(duì)SMMC-7221 和LO-2 細(xì)胞增殖的影響

如圖1 所示，LPB 的質(zhì)量濃度為0.078～1.015 mg/mL 時(shí)，顯著抑制SMMC-7721 和LO-2 細(xì)胞存活率（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，其中對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)；MPB 的質(zhì)量濃度為0.060～0.484 mg/mL 時(shí)，顯著抑制SMMC-7721 和LO-2 細(xì)胞存活率（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，其中對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)。HPB 的質(zhì)量濃度為5.592 mg/mL 時(shí)，干預(yù)肝癌細(xì)胞24 h 后，肝癌細(xì)胞的存活率仍大于75%，藥效相較于LPB 和MPB 弱，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)未對(duì)該部位進(jìn)行機(jī)制研究。

圖1 柴胡不同極性部位對(duì)SMMC-7221 和LO-2 細(xì)胞增殖的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Effect of different polarity fractions of Bupleuri Radix on proliferation of SMMC-7221 and LO-2 cells(±s, n = 3)

3.2 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞周期和凋亡的影響

如圖2-A 所示，與對(duì)照組比較，LPB（0.546 mg/mL）組G1期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），LPB（0.390、0.546 mg/mL）組S 期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），G2期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），表明LPB 阻滯SMMC-7721 細(xì)胞于G1期和G2期；如圖2-B 所示，與對(duì)照組比較，MPB（0.181 mg/mL）組G1期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），S期和G2期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05）；MPB（0.242 mg/mL）組S 期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），G2期細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05）。根據(jù)半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值選擇LPB（0.390 mg/mL）組和MPB（0.181 mg/mL）組進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)。

圖2 LPB (A) 和MPB (B) 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞周期的影響 (±s, n = 3)Fig.2 Effects of LPB (A) and MPB (B) on cell cycle of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

如圖3 所示，LPB（0.390 mg/mL）組和MPB（0.181 mg/mL）組作用于SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.001）。

圖3 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞凋亡的影響 (±s, n = 3)Fig.3 Effects of LPB and MPB on apoptosis of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.3 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞遷移的影響

如圖4 所示，與對(duì)照組比較，LPB 顯著抑制SMMC-7721 細(xì)胞遷移（P＜0.05、0.01），表明LPB具有抑制肝癌細(xì)胞遷移的作用。

圖4 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7221 細(xì)胞遷移的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effects of LPB and MPB on migration of SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.4 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞周期、凋亡和遷移相關(guān)基因和表蛋白達(dá)的影響

3.4.1 細(xì)胞周期相關(guān)基因與蛋白表達(dá) 如圖5-A、B 所示，與對(duì)照組比較，LPB 組NPAS2、CDK1、CDK2、CyclinB1、CyclinEmRNA 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），CDC25A、CDC25BmRNA 呈下降趨勢(shì)；MPB 組CDC25B、CDK1、CyclinB1mRNA表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。為了探究LPB 組誘導(dǎo)阻滯與生物鐘NAPS2基因的關(guān)系，采用Western blotting 檢測(cè)NAPS2、CDC25A 蛋白表達(dá)（圖5-C），結(jié)果顯示，LPB 組NAPS2、CDC25A 蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01）。

圖5 LPB 和MPB 對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞周期 (A～C)、凋亡 (D) 和遷移 (E) 相關(guān)蛋白及基因表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.5 Effects of LPB and MPB on cell cycle (A—C), apoptosis (D) and migration (E) related protein and gene expressions in SMMC-7721 cells (±s, n = 3)

3.4.2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 如圖5-D 所示，與對(duì)照組比較，LPB 和MPB 組Bax、Bax/Bcl-2、Cyt-C、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.01、0.001）。

3.4.3 遷移相關(guān)蛋白表達(dá) 如圖5-E 所示，與對(duì)照組比較，LPB 和MPB 組MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01、0.001），MMP-9/TIMP-1值顯著降低（P＜0.01）。

3.5 代謝組學(xué)分析

3.5.1 代謝輪廓數(shù)據(jù)采集 采用課題組前期建立的UPLC-MS 方法[9]對(duì)正常組、模型組、LPB 組和MPB組樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，分別采集正、負(fù)離子2 種模式來(lái)提高代謝物的覆蓋度。由總離子流色譜圖（圖6）可知，各組之間代謝成分具有差異。

圖6 正 (A)、負(fù) (B) 離子模式下各組樣本總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatograms of samples in each group in positive (A) and negative (B) ion modes

3.5.2 差異代謝物分析與鑒定 偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）得分圖（圖7）可看出，正常組和模型組明顯分離，表明肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞內(nèi)源性代謝產(chǎn)生差異；給藥組與模型組明顯分離。為了驗(yàn)證模型可靠性，對(duì)上述模型數(shù)據(jù)進(jìn)行排列實(shí)驗(yàn)（permutation test，n＝200）；評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考本課題組前期報(bào)道[18]；相關(guān)驗(yàn)證結(jié)果表明模型可靠。借助HMDB 及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)正常肝細(xì)胞組和肝癌組的顯著性差異物進(jìn)行鑒定，共鑒定出20 個(gè)與肝癌相關(guān)的差異代謝物（表2）。

圖7 各組肝細(xì)胞樣品PLS-DA 評(píng)分圖 (A、C) 及其模型驗(yàn)證圖 (B、D)Fig.7 PLS-DA score chart (A, C) of hepatocyte samples in each group and its model validation chart (B, D)

表2 各組樣本差異代謝物Table 2 Differential metabolites of samples in each group

3.5.3 LPB 和MPB 對(duì)差異代謝物的影響 如圖8 所示，與模型組比較，LPB 能夠回調(diào)的肝癌細(xì)胞差異代謝物有7 種，MPB 組能夠回調(diào)的肝癌細(xì)胞差異代謝物有12 種。LPB 和MPB 能夠共同干預(yù)3-磷酸甘油酸、乙酰肉堿、谷氨酰胺和尿苷等差異代謝物；LPB能夠干預(yù)谷氨酸、次黃嘌呤和黃嘌呤等差異代謝物；MPB 能夠干預(yù)神經(jīng)酰胺（d18∶1/16∶0），溶血卵磷脂（14∶0/0∶0）、肉桂酸、2-羥基己酸、甘膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、L-正亮氨酸和5′-磷酸腺苷等代謝物。

圖8 各組差異代謝物相對(duì)含量變化Fig.8 Changes in relative content of differential metabolites in each group

3.5.4 差異代謝物的代謝通路分析 為更好地分析各差異代謝物在各組間的內(nèi)在聯(lián)系，借助在線KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行整合代謝通路分析（圖9）。7 種LPB 和12 種MPB 回調(diào)的差異代謝物涉及甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和核苷酸代謝途徑等。

圖9 差異代謝物的代謝通路分析Fig.9 Metabolic pathway analysis of differential metabolites

4 討論

已有研究表明，使用中醫(yī)藥作為術(shù)后輔助治療可以取得更好療效，如調(diào)補(bǔ)氣血、疏肝理氣和恢復(fù)體質(zhì)[19]。此外，中醫(yī)藥可以緩解患者的腫瘤癥狀，控制腫瘤的大小，從而提高患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間[20]，因此探究中藥在癌癥治療的作用機(jī)制至關(guān)重要。柴胡歸肝、膽經(jīng)，具有疏肝解郁等功效，臨床上以柴胡為君藥的柴胡類方用于治療肝癌?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，柴胡有效成分如柴胡皂苷D 能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）信號(hào)通路誘發(fā)肝癌細(xì)胞自噬[21-22]。因此柴胡不同極性部位抑制肝癌細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的作用機(jī)制需要深入探究。

研究表明，細(xì)胞周期由大量調(diào)節(jié)蛋白參與，主要受CDK-Cyclin 復(fù)合物的調(diào)控，是細(xì)胞周期的核心過(guò)程。相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)提示CDK-Cyclin 復(fù)合物在癌組織中表達(dá)增高，而癌旁組織表達(dá)相對(duì)較低，提示癌癥的大量增殖可能與CDK-Cyclin 復(fù)合物的表達(dá)密切相關(guān)[23-24]。同時(shí)細(xì)胞周期節(jié)律基因的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且已在乳腺癌等腫瘤中得到證實(shí)[25]。Npas2基因在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，且為哺乳動(dòng)物中最大的生物鐘基因，而CDC25A 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受到NPAS2基因的調(diào)控[26]，且可以調(diào)控Bcl-2 蛋白去磷酸化參與肝癌細(xì)胞凋亡。CDC25B 為G2/M 期過(guò)度的關(guān)鍵基因，通過(guò)調(diào)節(jié)下游CDK1-Cyclin B1 復(fù)合物去磷酸化參與G2/M 期的進(jìn)程[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPB 作用于細(xì)胞后，G1和G2期細(xì)胞比例增加，表明LPB 可通過(guò)阻滯肝癌細(xì)胞周期，從而影響肝癌細(xì)胞增殖。qRT-PCR 及Western blotting結(jié)果表明，LPB 可能通過(guò)下調(diào)NPAS2 表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CDK2-Cyclin E 復(fù)合物表達(dá)下調(diào)，肝癌細(xì)胞過(guò)度到S 期受阻，G1期細(xì)胞大量增多，同時(shí)通過(guò)下調(diào)CDC25B基因表達(dá)，引起CDK1-Cyclin B1 復(fù)合物表達(dá)下降，干預(yù)G2/M 肝癌周期進(jìn)程，發(fā)揮抑制肝癌增殖細(xì)胞的作用。LPB 可能會(huì)通過(guò)下調(diào)Npas2，進(jìn)而下調(diào)CDC25A 的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 蛋白去磷酸化，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；而MPB 作用于肝癌細(xì)胞后，主要表現(xiàn)為G2期細(xì)胞比例增加，表明MPB 可通過(guò)阻滯肝癌細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖。qRT-PCR結(jié)果表明，MPB 通過(guò)下調(diào)CDC25B基因，進(jìn)而引起CDK1-Cyclin B1 復(fù)合物表達(dá)下降，干預(yù)G2/M 肝癌周期進(jìn)程，發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。MPB 通過(guò)升高Bax/Bcl-2 比值，促使Cyt-C 從線粒體釋放，進(jìn)而激活下游Caspase-3 蛋白，從而引起肝癌細(xì)胞凋亡（圖10）。

圖10 柴胡不同部位抑制增殖及促進(jìn)凋亡機(jī)制通路圖Fig.10 Pathways of mechanism of inhibition of proliferation and promotion of apoptosis in different polarity fractions of Bupleuri Radix

采用代謝組學(xué)方法鑒定了20 個(gè)與肝癌相關(guān)的差異代謝物，其中LPB 能夠回調(diào)7 種差異代謝物，MPB 能回調(diào)12 種，并利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行整合通路分析。研究表明，鞘磷脂代謝改變和腫瘤增加密切相關(guān)[30]。神經(jīng)酰胺為鞘脂代謝的中心紐帶分子，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞惡性增殖及抑制腫瘤增殖發(fā)揮重要角色[31-32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPB 能調(diào)控C16 神經(jīng)酰胺合成，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而發(fā)揮促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。研究表明，癌細(xì)胞增殖所必需的葉酸代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡可能需要活性絲氨酸合成，3-磷酸甘油酸是合成絲氨酸的原料[33]。肝癌細(xì)胞中3-磷酸甘油酸含量大幅增加，LPB 和MPB 干預(yù)后，含量被回調(diào)接近至正常組發(fā)揮抗肝癌作用。谷氨酰胺的增加會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)[34]，可以調(diào)節(jié)程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）的表達(dá)通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑，因此可能是肝細(xì)胞癌的新治療靶點(diǎn)[35]。而LPB 和MPB 組可以顯著逆轉(zhuǎn)肝癌導(dǎo)致的谷氨酰胺含量，達(dá)到抗肝癌作用。

綜上，LPB 和MPB 能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖而且能夠使其凋亡，肝癌細(xì)胞阻滯于G1期主要與Npas2-CDC25A-CDK2-Cyclin E 通路有關(guān)，阻滯于G2期主要與CDC25B-CDK1-Cyclin B1 復(fù)合物有關(guān)，凋亡主要與Npas2-CDC25A 靶點(diǎn)以及激活線粒體凋亡途徑相關(guān)，代謝組學(xué)結(jié)果顯示肝癌的發(fā)生與甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝和核苷酸代謝7 種代謝通路的紊亂密切相關(guān)。LPB 主要通過(guò)干預(yù)脂肪酸代謝、糖酵解、氨基酸代謝和核苷酸代謝4 種途徑發(fā)揮抗肝癌作用，MPB 主要通過(guò)干預(yù)甘油磷脂代謝、鞘磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、糖酵解途徑、氨基酸代謝和核苷酸代謝7 種途徑發(fā)揮抗肝癌作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突