白屈菜-元胡藥對(duì)逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥藥效物質(zhì)研究

鄒 翔，張雪瑞，于佳慧，孫雨恒，張宇航，舒 淇，曲中原*

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076

2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076

據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)最新統(tǒng)計(jì)，乳腺癌在女性癌癥發(fā)生率中居于首位[1]。臨床上，乳腺癌的治療常以手術(shù)為主，同時(shí)結(jié)合新輔助化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療[2]。蒽環(huán)類藥物如阿霉素通常與環(huán)磷酰胺和氟尿嘧啶等藥物聯(lián)合應(yīng)用于新輔助化療方案，該方案對(duì)于III 期乳腺癌患者是一個(gè)有潛力的治療方案[3]。然而，部分腫瘤患者會(huì)對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性，極大地制約了癌癥治療效果，而其耐藥的主要機(jī)制包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）等跨膜蛋白介導(dǎo)的耐藥、藥物代謝酶的異常表達(dá)、DNA 損傷修復(fù)機(jī)制以及發(fā)生上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等[4]。因此，新型耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選與研發(fā)仍是解決乳腺癌新輔助化療耐藥的主要問(wèn)題。

白屈菜-元胡藥對(duì)（ChelidoniiHerba-Corydalis Rhizomadrug pair，CMCR）是中醫(yī)臨床用于治療腫瘤的藥對(duì)之一[5-6]。白屈菜是罌粟科植物白屈菜ChelidoniummajusL.的干燥全草，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳平喘的功效[7]。元胡又稱延胡索，為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，主要有活血化瘀、行氣止痛之功效[8]。近年來(lái)研究表明，白屈菜生物堿對(duì)多種癌細(xì)胞（如人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞、人結(jié)腸癌HCT116、SW480 細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7 細(xì)胞）表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用[9]，并能通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路來(lái)促使人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞（MCF-7/ADR）恢復(fù)對(duì)阿霉素的敏感性[10]。而元胡中生物堿可抑制人肝癌HepG2 細(xì)胞、HCT116 細(xì)胞、A549 細(xì)胞和人白血病HL60 細(xì)胞體外增殖[11]，并具有抑制乳腺癌細(xì)胞中P-gp 活性的能力，逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)阿霉素的抗性[12]。此外，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，CMCR 可通過(guò)下調(diào)雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表達(dá)水平和雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）mRNA 的表達(dá)水平，有效抑制ER 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的增殖[5]。提示CMCR 具有良好的抗腫瘤作用和潛在的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用，但其逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的藥效尚需研究驗(yàn)證，相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也尚未系統(tǒng)開展。因此，本研究采用體外耐藥細(xì)胞模型對(duì)CMCR 各提取部位逆轉(zhuǎn)耐藥的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)分析不同配伍比例和不同提取部位下CMCR 的共有成分，篩選CMCR逆轉(zhuǎn)耐藥作用的藥效物質(zhì)，進(jìn)一步對(duì)CMCR 主要藥效物質(zhì)組逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥的機(jī)制進(jìn)行探究，為其在腫瘤化療耐藥方面的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)，同時(shí)也為相關(guān)化療耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

MCF-7/ADR 細(xì)胞由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 藥材

白屈菜、元胡（醋）飲片均購(gòu)自哈爾濱市匯仁藥材站，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院曲中原教授分別鑒定為罌粟科植物白屈菜C.majusL.的干燥全草和罌粟科植物延胡索C.yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖。

1.3 藥品與試劑

對(duì)照品白屈菜堿、延胡索乙素、二氫血根堿、白屈菜紅堿（批號(hào)分別為 DST220428-079、DSTDY010101、DST220726-042、DST201109-040，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；阿霉素（批號(hào)N1111B，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；羅丹明123（批號(hào)052621221101）、BCA 試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)K101828133EF5E）購(gòu)自美國(guó)APExBIO 公司；兔抗乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistant protein，BCRP）、肺耐藥蛋白（lung resistance protein，LRP）、P-gp 多克隆抗體（批號(hào)分別為 M05253192、G07143520、M05262395）均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)BJ08079044）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（批號(hào)3507442021）購(gòu)自武漢ABclonal 生物公司；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA eraser 試劑盒（批號(hào)RR047A）、TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒（批號(hào)RR420A）均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；甲醇、乙腈、甲酸等其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.4 儀器

超高效液相色譜-G6500 系列四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；CO-150 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)NBS 公司）；iMark 型酶標(biāo)儀［伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］；DYCZ-24DN 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ImageQuant LAS500 型分子生物成像儀（GE 通用電器醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部）；Easy Cycler 96 型PCR 儀（德國(guó)Biometra 公司）；QuantStudioTM1 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］。

2 方法

2.1 CMCR 各提取部位化學(xué)成分表征

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白屈菜堿、延胡索乙素、二氫血根堿、白屈菜紅堿對(duì)照品各1.0 mg，分別加入甲醇進(jìn)行超聲溶解，定容至5 mL 量瓶中，制成質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 按1∶1 比例稱取白屈菜、元胡粉末6、6 g，按2∶1 比例稱取白屈菜、元胡粉末8、4 g，分別加10 倍量95%、80%、70%、60%、50%乙醇超聲提取2 次，每次1 h；合并濾液，濃縮，得浸膏。加甲醇復(fù)溶，制成質(zhì)量濃度為0.08 g/mL（以浸膏量計(jì)）的供試品溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.1.3 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，20%B；4～17 min，20%～22% B；17～19 min，22%～100% B；19～24 min，100%～15% B；體積流量為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為0.2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為269 nm[13]。

2.1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正離子模式下的離子源電壓為4 500 V，離子源溫度為550 ℃。正離子模式下的碰撞能量為35 eV；霧化氣（gas1）壓力為379.225 kPa，輔助氣（gas2）壓力為34.475 kPa，氣簾氣（curtain gas）壓力為241.325 kPa。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為m/z80～1 500；對(duì)信息依賴響應(yīng)值超過(guò)100 cps的8 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為m/z50～1 500[14]。

2.1.5 樣品檢測(cè)與數(shù)據(jù)處理 收集中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、PubMed 和ChemSpider 等數(shù)據(jù)庫(kù)中白屈菜和元胡的化學(xué)成分信息，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。運(yùn)用Agilent MassHunter Workstation 工作站軟件，以峰強(qiáng)度、保留時(shí)間（tR）和質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)各色譜峰進(jìn)行識(shí)別，計(jì)算測(cè)定化合物相對(duì)分子質(zhì)量與理論值之間的誤差，篩選誤差小于1×10?5的化合物。根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特征分析化合物裂解規(guī)律，與二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)照，確定各化合物結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵化合物采用對(duì)照品或?qū)φ掌纷V圖對(duì)比進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 CMCR 逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 的耐藥作用

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞以3.5×104個(gè)/mL 接種至96 孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)箱中過(guò)夜。設(shè)置對(duì)照組，不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）阿霉素組，不同質(zhì)量濃度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 mg/mL）的CMCR 組，阿霉素（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）聯(lián)合CMCR 各提取部位組[各提取部位的20%抑制濃度（20% inhibitory concentration，IC20）]，每孔加入100 μL 藥液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，另設(shè)置不接種細(xì)胞的空白孔，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。給藥72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，微量振蕩器上混勻3～5 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

細(xì)胞增殖抑制率＝(A對(duì)照－A給藥)/(A對(duì)照－A空白)

耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝藥物IC50（不含逆轉(zhuǎn)劑）/藥物IC50（含逆轉(zhuǎn)劑）

2.3 共有成分峰面積與藥效指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3.1 Pearson 相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC） 將均值化后的藥效物質(zhì)的峰面積和藥效實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)設(shè)為“變量”，采用SPSS 21.0 軟件中的雙變量相關(guān)分析法，計(jì)算PCC，各變量之間的系數(shù)絕對(duì)值越大，表明其線性相關(guān)性越強(qiáng)。據(jù)此，尋找與逆轉(zhuǎn)耐藥作用相關(guān)性較大的藥效物質(zhì)。

2.3.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析 （grey relational analysis，GRA） 以共有峰（峰面積）為子序列，以藥效實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為母序列，原始數(shù)據(jù)采用均值化法處理，利用DPS 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，將子序列與相同母序列的關(guān)聯(lián)度，按從大小排序作為關(guān)聯(lián)序，可直接反映各子序列對(duì)母序列的“貢獻(xiàn)”程度，從而尋找與逆轉(zhuǎn)耐藥作用聯(lián)系較大的藥效物質(zhì)。

2.3.3 偏最小二乘回歸（partial least squares，PLS）分析 將CMCR 不同提取部位共有成分峰面積和逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件，將峰面積設(shè)為X變量，藥效指標(biāo)設(shè)為Y變量，進(jìn)行PLS 分析。

2.4 熒光顯微鏡檢測(cè)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置對(duì)照組、阿霉素（6 μmol/L）組、低劑量白屈菜堿（3 μmol/L）-延胡索乙素（5 μmol/L）組、高劑量白屈菜堿（6 μmol/L）-延胡索乙素（10μmol/L）組、低劑量白屈菜堿（3 μmol/L）-延胡索乙素（5 μmol/L）聯(lián)合阿霉素（6 μmol/L）組和高劑量白屈菜堿（6 μmol/L）-延胡索乙素（10 μmol/L）聯(lián)合阿霉素（6 μmol/L）組，給予相應(yīng)藥物后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去上清液，PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入5 μg/mL 羅丹明123，室溫避光孵育30 min。棄去上清液，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 含量（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm）。使用Image J 軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

2.5 CCK-8 法確定白屈菜堿和延胡索乙素配伍比例及二者聯(lián)合用藥分析

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞以3.5×104個(gè)/mL 接種至96 孔板，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。白屈菜堿給藥組濃度為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，延胡索乙素給藥組濃度為2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)。將白屈菜堿和延胡索乙素的各組細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)輸入Synergy Finder 網(wǎng)站進(jìn)行聯(lián)合用藥分析，利用ZIP（零相互作用效力模型）系統(tǒng)地評(píng)估2 藥聯(lián)合應(yīng)用引發(fā)的平均過(guò)量反應(yīng)，預(yù)測(cè)可能出現(xiàn)的各種形式，ZIP 評(píng)分若＞10，說(shuō)明2 藥聯(lián)合發(fā)生的反應(yīng)超出了單藥作用時(shí)預(yù)期反應(yīng)的10%，表明2 種藥物可能存在協(xié)同相互作用；ZIP 評(píng)分若為?10～10，表明2 種藥物的反應(yīng)是加和相互作用；ZIP 評(píng)分若＜?10，表明2 種藥物可能存在拮抗相互作用[15]。

2.6 分子對(duì)接技術(shù)

從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載白屈菜堿和延胡索乙素的2D 結(jié)構(gòu)，利用Chemdraw 3D 轉(zhuǎn)為.mol2 格式。從RCSB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲得靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，使用AutoDockTools 1.5.6 將配體和受體文件轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，并通過(guò)去水及加氫處理來(lái)改進(jìn)其結(jié)構(gòu)。最后，在Discovery Studio 軟件（4.5.0 版本）中進(jìn)行分子對(duì)接模擬。

2.7 Western blotting 測(cè)定MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解緩沖液冰浴裂解，離心后收集蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，蛋白高溫變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，分別加入BCRP、LRP、P-gp、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；1%TBST 洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例為1 ∶1 500），室溫孵育2 h。利用ECL發(fā)光液顯色，采用凝膠成像儀曝光成像，應(yīng)用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.8 qRT-PCR 檢測(cè)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR 細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，2 mL/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度及純度后按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用 2?ΔΔCt法計(jì)算多藥耐藥蛋白 1（multidrug resistance 1，MDR1）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistant protein，ABCG2）、LRPmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：MDR1上游引物 5’-TTGCTGCTTACATTCAGGTTTCA-3’，下游引物5’-AGCCTATCTCCTGTCGCATTA-3’；ABCG2上游引物5’-ACGAACGGATTAACAGGGTCA-3’，下游引物5’-CTCCAGACACACCACGGAT-3’；LRP上游引物5’-AGCCAGCTATGCACCAACAC-3’，下游引物5’-CCTTGCAGGAGCGGTTATC-3’；GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CMCR 不同提取部位化學(xué)成分鑒定結(jié)果

對(duì)CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位（95%、80%、70%、60%、50%乙醇）化學(xué)成分進(jìn)行解析鑒定，共獲得30 個(gè)共有成分（表1），包括異喹啉類生物堿、其他類生物堿、有機(jī)胺類等。

表1 UPLC-Q-TOF-MS 正離子模式下CMCR 不同配伍比例及提取部位的共有成分Table 1 Common components of CMCR in different compatibility ratio and extraction parts under positive ion mode of UPLC-Q-TOF-MS

3.2 CMCR 對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞耐藥性的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50為（23.58±1.03）μmol/L。如圖1 所示，CMCR 不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位作用于MCF/ADR 細(xì)胞72 h 后，抑制率最大的為CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位組，其IC50為（450.57±24.18）μg/mL。如圖2 和表2 所示，CMCR不同配伍比例（1∶1、2∶1）的不同提取部位聯(lián)合阿霉素給藥后，阿霉素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的IC50均有明顯下降，其中逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)最大的為阿霉素聯(lián)合CMCR（1∶1）95%乙醇提取部位組，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為11.08。結(jié)果表明，CMCR 能有效逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，CMCR 的質(zhì)量濃度與逆轉(zhuǎn)效果呈正相關(guān)。

圖1 CMCR 對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.1 Inhibitory effect of CMCR on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

圖2 CMCR 聯(lián)合阿霉素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.2 Inhibitory effect of CMCR combined with adriamycin on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

表2 CMCR 逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)阿霉素耐藥的作用Table 2 Reversing effect of CMCR on MCF-7/ADR cells to adriamycin

3.3 CMCR 化學(xué)成分與逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥作用的相關(guān)性分析

CMCR 共有峰與逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)的PCC 見圖3-A，共有6 種有效成分的|PCC|＞0.80，影響值由大到小排序?yàn)镚1＞G2＞G3＞G4＞G5＞G6。CMCR共有峰與逆轉(zhuǎn)耐藥藥效的GRA 結(jié)果如圖3-B 所示，有12 種有效成分灰色關(guān)聯(lián)度系數(shù)＞0.80，影響值由大到小排序?yàn)镚1＞G2＞G6＞G3＞G12＞G8＞G7＞G10＞G15＞G9＞G16＞G13。對(duì)2 種分析方法的結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知，同時(shí)滿足|PCC|＞0.80 以及灰色關(guān)聯(lián)度系數(shù)＞0.80 的有效成分有5 種，分別為白屈菜堿（G1）、延胡索乙素（G2）、小檗堿（G3）、二氫血根堿（G6）、白屈菜紅堿（G10），初步確定該5 種化合物為CMCR 發(fā)揮逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 細(xì)胞耐藥作用的潛在藥效物質(zhì)。又由于白屈菜堿和延胡索乙素2種成分在GRA中關(guān)聯(lián)度最大，分別為0.900和0.897；同時(shí)，二者在Pearson 相關(guān)分析中也獲得了最大的相關(guān)系數(shù)，分別為0.910 和0.903，說(shuō)明白屈菜堿和延胡索乙素與CMCR 逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)性最大。采用PLS 分析方法進(jìn)行了再次驗(yàn)證，得到了變量投影重要性（variable important projection，VIP）值，見圖4。一般認(rèn)為|VIP|＞1 的X變量對(duì)于Y變量有顯著的影響，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，白屈菜堿和延胡索乙素的VIP 值排在前2 位，它們?cè)谀孓D(zhuǎn)耐藥藥效方面發(fā)揮了較大的貢獻(xiàn)。這個(gè)結(jié)論與前2 種相關(guān)性分析結(jié)果相印證。因此，進(jìn)一步選擇白屈菜堿和延胡索乙素聯(lián)合配比應(yīng)用，進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究。

圖3 CMCR 不同提取部位共有成分峰面積與逆轉(zhuǎn)耐藥作用相關(guān)性分析結(jié)果Fig.3 Correlation analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

圖4 CMCR 不同提取部位共有成分峰面積與逆轉(zhuǎn)耐藥作用PLS 分析的VIP 圖Fig.4 VIP map of PLS analysis between common component peak areas and resistance reversal efficacy of different extraction parts of CMCR

3.4 白屈菜堿和延胡索乙素配伍比例的確定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證潛在藥效物質(zhì)，采用CCK-8 法測(cè)定白屈菜堿和延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的增殖抑制作用，以確定二者最佳配伍比例。如圖5所示，白屈菜堿和延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的IC20分別為（6.10±0.82）、（6.80±0.43）μmol/L，IC50分別為（17.80±0.86）、（38.95±1.38）μmol/L，表明白屈菜堿和延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。由圖6 可知，白屈菜堿-延胡索乙素的ZIP 評(píng)分為5.158，表明2 種藥物的反應(yīng)是加和相互作用。Synergy Finder 分析2 種藥物有效濃度范圍均在5～10 μmol/L，故延胡索乙素的低、高劑量設(shè)定為5、10 μmol/L?？紤]到課題組前期的白屈菜堿對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞耐藥藥效學(xué)研究結(jié)果[10]，選用3、6 μmol/L 作為白屈菜堿的低、高劑量。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用白屈菜堿和延胡索乙素2 種成分繼續(xù)探究CMCR 逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)機(jī)制。

圖5 白屈菜堿和延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的增殖抑制作用 (±s, n = 6)Fig.5 Inhibitory effects of chelidonine and tetrahydropalmatine on proliferation of MCF-7/ADR cells (±s, n = 6)

圖6 Synergy Finder 分析結(jié)果Fig.6 Synergy Finder analysis results

3.5 白屈菜堿-延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 含量的影響

羅丹明123 作為P-gp 的底物，通過(guò)P-gp 轉(zhuǎn)運(yùn)而被排出細(xì)胞，易蓄積在P-gp 低表達(dá)的細(xì)胞中。熒光顯微鏡觀察白屈菜堿-延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 含量的影響，可反映白屈菜堿-延胡索乙素對(duì)P-gp 表達(dá)的影響。如圖7 所示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度最低；經(jīng)阿霉素或不同濃度的白屈菜堿-延胡索乙素處理后的耐藥細(xì)胞，羅丹明123 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蓄積程度不斷增強(qiáng)，呈劑量相關(guān)性。與阿霉素組比較，白屈菜堿-延胡索乙素組聯(lián)合ADR組的熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度的增加而顯著增強(qiáng)，表明白屈菜堿-延胡索乙素降低了P-gp對(duì)底物的外排，促進(jìn)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 的蓄積。

圖7 白屈菜堿-延胡索乙素聯(lián)合阿霉素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 蓄積的影響 (×400)Fig.7 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine combined with adriamycin on accumulation intensity of rhodamine 123(× 400)

3.6 白屈菜堿和延胡索乙素單體與BCRP、LRP、MDR1 蛋白分子對(duì)接結(jié)果分析

白屈菜堿與BCRP、LRP、MDR1 耐藥相關(guān)蛋白的對(duì)接得分分別為?35.56、?29.29、?30.96 kJ/mol，延胡索乙素與BCRP、LRP、MDR1 耐藥相關(guān)蛋白的對(duì)接得分分別為?29.71、?24.27、?25.52 kJ/mol，結(jié)果均小于?16.74 kJ/mol[29]，說(shuō)明其具有潛在的結(jié)合活性以及低結(jié)合能量的穩(wěn)定性。選取對(duì)接結(jié)合能量最低的構(gòu)象用于對(duì)接結(jié)合模式分析，并使用Discovery Studio 4.5.0 軟件繪制3D 和2D 圖像（圖8）。

圖8 耐藥相關(guān)蛋白與活性化合物分子對(duì)接作用方式Fig.8 Docking mode of drug resistance related proteins and active compounds

3.7 白屈菜堿-延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響

如圖9 所示，與對(duì)照組比較，不同濃度的白屈菜堿-延胡索乙素處理MCF-7/ADR 細(xì)胞后，P-gp、LRP、BCRP 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），MDR1、LRP和ABCG2mRNA 表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.001），且高劑量組聯(lián)合阿霉素的作用最佳。表明白屈菜堿-延胡索乙素逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥作用與下調(diào)P-gp、LRP、BCRP 蛋白及mRNA表達(dá)有關(guān)。

圖9 白屈菜堿-延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.9 Effect of chelidonine-tetrahydropalmatine on expressions of resistance-related proteins and genes in MCF-7/ADR cells (±s, n = 3)

4 討論

新輔助化療是乳腺癌的主要術(shù)前治療方法。在乳腺癌主要分型中，Luminal A 亞型患者占總體乳腺癌患者的70%，該亞型患者具有較低的病理分級(jí)和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。然而，對(duì)于Luminal A 亞型患者進(jìn)行新輔助化療后，觀察到病理完全緩解率低至10%，即病理學(xué)上完全消除腫瘤的比例較低[30-31]。阿霉素是一種用于新輔助化療的蒽環(huán)類藥物，聯(lián)合曲妥珠單抗、紫杉醇等藥物能顯著改善病理完全緩解率，但長(zhǎng)期使用會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性和血液毒性[32]。近年來(lái)，中藥在乳腺癌治療方面得到廣泛應(yīng)用，其既可以抑制乳腺癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，還能緩解西醫(yī)療法帶來(lái)的耐藥性，是腫瘤化療輔助治療的重要手段[33]。白屈菜-元胡藥對(duì)是中醫(yī)臨床治療乳腺癌的常用藥對(duì)之一，白屈菜苦辛、微溫，入肝、肺、胃；延胡索辛苦而溫，入肝、脾、心，二者聯(lián)用既能治血瘀疼痛，又能治氣滯疼痛，故而中醫(yī)常將白屈菜和元胡合用于肝郁氣滯型乳腺癌的早期治療[6]。本課題組前期研究以及文獻(xiàn)報(bào)道表明，白屈菜和元胡中的有效成分可通過(guò)下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞中P-gp 等耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)阿霉素的抗性[5,34-35]，但是CMCR 逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥的作用及藥效物質(zhì)尚未得到系統(tǒng)闡明。

為此，本研究在采用UPLC-Q-TOF-MS 闡明CMCR 不同提取部位化學(xué)成分全貌及逆轉(zhuǎn)耐藥藥效的基礎(chǔ)上，運(yùn)用2 種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法考察30 個(gè)共有峰峰面積與CMCR 不同提取部位逆轉(zhuǎn)耐藥藥效的相關(guān)性，篩選確定白屈菜堿、延胡索乙素、小檗堿、二氫血根堿、白屈菜紅堿為CMCR 逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥作用的潛在藥效物質(zhì)。近些年文獻(xiàn)研究表明，白屈菜堿可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥，其機(jī)制為作用于表皮生長(zhǎng)因子受體，激活磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-dependent/activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路，進(jìn)而抑制線粒體的氧化磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[36]；延胡索乙素可以通過(guò)在ERα 上積累泛素鏈來(lái)促進(jìn)ERα 降解，增強(qiáng)ERα 乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的敏感性[37]；小檗堿可激活A(yù)MPK 并降低其下游蛋白缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的含量，進(jìn)而抑制P-gp 表達(dá)，增強(qiáng)阿霉素對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞的敏感性[38]；二氫血根堿通過(guò)下調(diào)mut-p53 蛋白誘導(dǎo)G0/G1期和G2/M 期阻滯，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制胰腺癌PANC-1 和SW1990細(xì)胞增殖作用[39]；白屈菜紅堿可有效抑制蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）的磷酸化，降低MDR1的轉(zhuǎn)錄水平，抑制P-gp 對(duì)化療藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)一步發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用[40]。以上研究結(jié)果提示CMCR 具有潛在逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥的作用，進(jìn)一步采用PLS 分析得出白屈菜堿和延胡索乙素對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥作用的影響值最大，且它們又分別歸屬于2 種中藥的有效成分之一，故而將白屈菜堿聯(lián)合延胡索乙素作為CMCR 發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用的配伍成分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)制探討。抑制膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)是中藥逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥的機(jī)制之一[41-42]。本研究采用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，白屈菜堿-延胡索乙素可顯著增加MCF-7/ADR 細(xì)胞中P-gp 底物羅丹明123 的蓄積量。而Western blotting 和qRT-PCR 結(jié)果也表明，白屈菜堿-延胡索乙素可降低P-gp 等耐藥蛋白的表達(dá)，說(shuō)明白屈菜堿-延胡索乙素組分可能是通過(guò)下調(diào)P-gp 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)而減少阿霉素的外排，增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度，最終發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用，但其分子機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

本研究基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，采用體外耐藥細(xì)胞模型闡明了CMCR 逆轉(zhuǎn)耐藥作用藥效物質(zhì)，且其藥效物質(zhì)組白屈菜堿-延胡索乙素能夠通過(guò)下調(diào)MCF-7/ADR 細(xì)胞P-gp、BCRP 和LRP 蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，抑制外排蛋白活性，增加細(xì)胞內(nèi)阿霉素含量蓄積，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為應(yīng)對(duì)乳腺癌患者對(duì)阿霉素產(chǎn)生的耐藥性問(wèn)題提供了新的研究思路和方法，并為進(jìn)一步研究和開發(fā)CMCR 奠定了基礎(chǔ)。但CMCR 逆轉(zhuǎn)乳腺癌阿霉素耐藥性的確切機(jī)制還需進(jìn)一步開展研究加以闡釋，是否存在其他通路參與逆轉(zhuǎn)耐藥也是下一步實(shí)驗(yàn)開展的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突