基于指紋圖譜和含量測定評價地黃不同入藥形式制千金黃連丸質(zhì)量

張春亞，張 威，李瑩瑩，雷敬衛(wèi)*，楊顏溶，田瀚舉，張 娟，趙新梅，段浩瀚，龔海燕，楊春靜，王笑笑

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

2.鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450122

3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450046

千金黃連丸（Qianjin Huanglian Pills，QHP）出自藥王孫思邈《備急千金要方》，又名黃連丸，方中黃連為君，地黃為臣，相須配伍，具有養(yǎng)陰清熱、生津止渴的功效。臨床上主要用于治療陰虛熱盛型消渴病。書中寫到“黃連一斤，生地黃一斤（張文仲云十斤）。右二味，絞地黃汁，浸黃連，出曝之燥，復(fù)納之，令汁盡干之，搗末”[1]。此處“生地黃”即現(xiàn)代意義上的鮮地黃，由此可知原方是鮮地黃絞汁入藥，然而因地黃汁的制備及存放問題，臨床多使用生地黃與黃連配伍。臨床上對于古方QHP 的使用出現(xiàn)變化，而對于其古今不同制法的成分分析研究較少，因此，需要進(jìn)一步展開研究，闡明中醫(yī)遣方用藥的科學(xué)內(nèi)涵。目前，道地產(chǎn)區(qū)將鮮地黃快速烘干，得另一種鮮地黃形式鮮干地黃片，保留了鮮地黃中的大量化學(xué)成分且便于儲存，基于此本研究創(chuàng)新性地將鮮干地黃片用于制備QHP。

地黃主要含有糖類、環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類成分[2-4]，以梓醇為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分具有抗氧化、保肝降糖等多種藥理作用[5-7]，以水蘇糖為代表的地黃寡糖也是地黃活性組分[8-9]，具有降低糖尿病大鼠血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群功能[10]。黃連主要含有異喹啉類生物堿、木脂素、香豆素、黃酮等化學(xué)成分，具有降血糖、抗菌、抗氧化等藥理作用[11-12]。地黃中的寡糖類、苷類成分[13-14]，黃連中的生物堿類成分[15-16]，可能是發(fā)揮用于治療糖尿病藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

因此，本實(shí)驗分別使用鮮地黃汁、鮮干地黃片、生地黃制備QHP，得鮮地黃連丸（Xiandi Huanglian Pills，XD）、鮮干黃連丸（Xiangan Huanglian Pills，XG）、生地黃連丸（Shengdi Huanglian Pills，SD），在此基礎(chǔ)上建立QHP 的HPLC 指紋圖譜和環(huán)烯醚萜苷類、黃連堿類、糖類成分的含量測定方法，并利用化學(xué)計量學(xué)分析比較地黃不同入藥形式制QHP 中化學(xué)成分的差異，為完善QHP 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Waters 2695-2998 型高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Alltech 2000ES 型蒸發(fā)光檢測器，美國奧泰科技（中國）有限公司；Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，天津博納艾杰爾科技有限公司；Agilent Zorbax NH2色譜柱，安捷倫科技（中國）有限公司；101-3AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；四號藥典篩，浙江上虞市五四儀器篩具廠；BSA224S-CW 型萬分之一天平、CPA225D 型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；FW-100 型高速多功能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 試藥

對照品益母草苷（批號MUST-21121010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.69%）、桃葉珊瑚苷（批號MUST-21100811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.10%）、梓醇（批號MUST-21041120，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.56%）、地黃苷 D（批號 MUST-20101311，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.15%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；對照品地黃苷 A（批號wkq20032402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、毛蕊花糖苷（批號wkq17042401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品D-無水葡萄糖（批號Y19F11J108781，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、水蘇糖（批號J04D10R104841，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品果糖（批號AF21021653，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、蔗糖（批號AF20110803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、棉子糖（批號AF21081854，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購自成都埃法生物科技有限公司；甲醇，色譜純，美國Tedia 公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇均為分析純；娃哈哈水。

1.3 藥材

本研究所用黃連飲片購自安徽德昌藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地為四川彭州；地黃樣品于2022 年12月采自河南省焦作市；經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定，黃連為毛莨科黃連屬植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖，地黃為玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 XD、XG、SD 的制備

分別以鮮地黃汁、鮮干地黃湯劑、生地黃湯劑與黃連粗粉混勻制備XD、XG、SD。QHP 樣品制備方法如下，樣品信息見表1。

2.1.1 XD 取鮮地黃500 g，經(jīng)原汁機(jī)榨汁、濾網(wǎng)濾過得鮮地黃汁250 mL；取黃連粗粉50 g 至托盤中，少量多次加入全部鮮地黃汁，混勻后50 ℃低溫烘干，打粉，過4 號藥典篩，干粉保存于干燥器中[17]。

2.1.2 XG 取鮮地黃500 g（含水量80%），洗凈，切片，置70 ℃烘箱，干燥24 h，得100 g 鮮干地黃片。取100 g 鮮干地黃片，一煎加7 倍量水，浸泡30 min，從沸騰開始計時文火（300 W）煎煮30 min；二煎加6 倍量水，從沸騰后開始計時，轉(zhuǎn)文火（300 W）煎煮20 min[18]。合并2 次煎煮液，調(diào)整體積至500 mL，得鮮干地黃湯劑。取鮮干地黃湯劑500 mL，50 ℃水浴調(diào)整體積至250 mL，取黃連粗粉50 g 至托盤中，少量多次加入鮮干地黃湯劑，混勻后50 ℃低溫烘干[17]，過4 號藥典篩，干粉保存于干燥器中。

2.1.3 SD 參照《中國藥典》2020 年版“地黃”項下“生地黃”要求，將500 g 鮮地黃置烘箱50 ℃烘48 h，后升溫至70 ℃繼續(xù)烘至無硬心，再將溫度降至40 ℃烘至地黃表面發(fā)硬，取出，用麻袋蓋嚴(yán)發(fā)汗，使內(nèi)部水分往外滲出至表里干濕一致，后40 ℃干燥至地黃全身發(fā)軟，手握表面發(fā)硬，取出，放涼[19]，得生地黃藥材，得率為20%。切厚片，得生地黃飲片。取100 g 生地黃片，一煎加7 倍量水，浸泡30 min，從沸騰開始計時文火（300 W）煎煮30 min；二煎加6 倍量水，從沸騰后開始計時，轉(zhuǎn)文火（300 W）煎煮20 min[18]。合并2 次煎煮液，調(diào)整體積至500 mL 得生地黃湯劑。取生地黃湯劑500 mL，50 ℃水浴調(diào)整體積至250 mL，取黃連粗粉50 g 至托盤中，少量多次加入生地黃湯劑，混勻后50 ℃低溫烘干[17]，過4 號藥典篩，干粉保存于干燥器中。

2.2 XD、XG、SD 的指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Venusil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液，梯度洗脫：0～8 min，5%～10%甲醇；8～30 min，10%～24%甲醇；30～50 min，24%～32%甲醇；50～60 min，32%甲醇；60～70 min，32%～34%甲醇；70～80min，34%～38%甲醇；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；PDA 檢測器檢測波長：0～25 min，203 nm；25～80 min，280 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取梓醇、益母草苷、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬丁對照品適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為3.020、0.520、0.535、0.570、0.510、4.500、1.030 mg/mL 的混合對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各黃連丸樣品約0.5 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（700 W、40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取2 mL，經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，備用。

2.2.4 精密度試驗 取同一供試品溶液（XD1 樣品），按照“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以小檗堿為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 為0～1.72%，相對峰面積的RSD 為0～2.08%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（XD1 樣品），分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以小檗堿為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 為0～1.32%，相對峰面積的RSD 為0～2.11%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取XD1 樣品6 份，按“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以小檗堿為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間的RSD 為0～1.56%，相對峰面積的RSD 為0～2.34%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.7 相似度評價 按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，采集混合對照品溶液、XD、XG 及SD 樣品的HPLC圖，結(jié)果見圖1、2。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2012A 版）軟件進(jìn)行評價，以XD1樣品圖譜為參照圖譜，時間窗為0.1 min，采用中位數(shù)法進(jìn)行相似度評價，相似度評價結(jié)果見表2。

圖1 30 批QHP 樣品的HPLC 圖及其對照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC fingerprint of 30 batches of QHP and its reference fingerprint (R)

表2 30 批QHP 相似度評價Table 2 Similarity evaluation of 30 batches of QHP

結(jié)果表明，樣品間具有較高相似度。經(jīng)多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配后生成對照指紋圖譜，共標(biāo)定19個共有峰，通過與對照品對比，分別為梓醇（2 號峰）、益母草苷（7 號峰）、黃連堿（14 號峰）、表小檗堿（15 號峰）、藥根堿（17 號峰）、小檗堿（18 號峰）、巴馬?。?9 號峰）。其中，已指認(rèn)的2 個環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇和益母草苷來自地黃，黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬丁來自黃連。

對HPLC 圖進(jìn)行差異分析，如圖2 所示，可知不同入藥形式制QHP 的HPLC 色譜圖峰數(shù)目無明顯區(qū)別，而XD 及XG 中峰1、峰2（梓醇）峰高明顯高于SD。

圖2 混合對照品和QHP 樣品的HPLC 圖Fig.2 HPLC of mixed reference substances and QHP sample

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

為了進(jìn)一步明確XD、XG、SD 化學(xué)成分的差異，采用系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對XD、XG、SD 進(jìn)行分析。

2.3.1 HCA 以QHP 樣品的19 個共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA，采用Ward 法，以平方歐氏（Euclidean）距離為分類依據(jù)，得聚類樹狀圖見圖3。當(dāng)距離為4 時，QHP樣品可分為3 類，XD1～XD10、XG1～XG10、SD1～SD10 分別聚為一類，表明以不同入藥形式制備的QHP 內(nèi)在質(zhì)量存在差別；當(dāng)距離為10 時，QHP 樣品被分為2 類，XD1～XD10 和XG1～XG10 聚為一類，SD1～SD10 聚為一類，表明2 個樣品組之間存在更大差異。

圖3 30 批QHP 樣品HCA 樹狀圖Fig.3 Dendrogram of HCA for 30 batches of QHP

2.3.2 PCA 將QHP 樣品19 個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件中，采用非監(jiān)督模式識別方法PCA 來觀察樣品的自然聚集。模型擬合的3 個主成分對原始資料的解釋率分別為64.769%、13.389%、6.616%，3 者累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.773%＞60%，表明模型預(yù)測良好。PCA 得分圖見圖4?？梢钥闯?，XD（XD1～XD10）、XG（XG1～XG10）、SD（SD1～SD10）分別聚為3 組，分類結(jié)果與地黃不同入藥形式密切相關(guān)，說明地黃不同入藥形式制QHP 在成分上的差異可以通過指紋圖譜的差異來體現(xiàn)。

圖4 30 批QHP 樣品的PCA 得分圖Fig.4 PCA score plot for 30 batches of QHP

2.3.3 OPLS-DA 為了進(jìn)一步研究造成XD、XG、SD 差異的主要化學(xué)成分，采用SIMCA-14.1 軟件對樣品進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA，建立的模型穩(wěn)定可靠，散點(diǎn)得分圖見圖5。圖中XD、XG、SD 明顯聚為3 類，該結(jié)果驗證了HCA 和PCA 結(jié)果。變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值見圖6，以VIP＞1 為標(biāo)準(zhǔn)，得到8 個差異化學(xué)成分，分別為色譜峰1、6、15（表小檗堿）、3、4、2（梓醇）、16、9，提示這些成分對區(qū)分XD、XG、SD的貢獻(xiàn)較大。

圖5 30 批QHP 樣品OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA score plot for 30 batches of QHP

圖6 QHP HPLC 指紋圖譜中19 個共有峰的VIP 得分圖Fig.6 VIP score plot of 19 common peaks in HPLC fingerprints of QHP

2.4 環(huán)烯醚萜苷類、黃連堿類成分含量測定

2.4.1 色譜條件 同“2.2.1”項。

2.4.2 對照品溶液的制備 同“2.2.2”項。

2.4.3 供試品溶液的制備 同“2.2.3”項。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下方法制備的混合對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以梓醇、益母草苷、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍分別為梓醇Y＝7 049 243.43X－17 669.73，r＝0.999 6，線性范圍60.0～906.0 μg/mL；益母草苷Y＝2 410 724.04X＋8 887.17，r＝0.999 1，線性范圍10.0～156.0μg/mL；黃連堿Y＝40 608 328.57X－105 142.43，r＝0.999 9，線性范圍11.0～160.0 μg/mL；表小檗堿Y＝57 505 210.05X－121 178.90，r＝0.999 8，線性范圍11.0～171.0 μg/mL；藥根堿Y＝44 025 436.50X－17 613.58，r＝0.999 5，線性范圍10.0～153.0μg/mL；小檗堿Y＝47 708 886.24X＋262 093.47，r＝0.999 6，線性范圍91.0～1 368.0 μg/mL；巴馬丁Y＝2 410 724.04X＋8 887.17，r＝0.999 1，線性范圍21.0～309.0 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗 取XD1 樣品制備的供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算各待測成分峰面積的RSD，考察儀器的精密度。結(jié)果顯示，7 個待測成分峰面積的RSD 均小于2.02%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取XD1 樣品制備的供試品溶液，于4 ℃條件下保存，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各待測成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，7 個待測成分峰面積的RSD 均小于1.80%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗 取XD1 樣品6 份，按“2.2.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣測定，計算各待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。結(jié)果顯示，7 個待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 均小于2.12%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已測定各指標(biāo)成分含量的XD1 樣品9 份，每份約0.25 g，精密稱定，分3組，分別按QHP 樣品中梓醇、益母草苷、黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150%加入相應(yīng)對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算QHP 樣品中7 種指標(biāo)成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果7 種指標(biāo)成分的平均加樣回收率為97.64%～99.71%，RSD 為0.74%～1.83%，均小于3%。

2.4.9 樣品測定 取表1 中的30 批QHP 樣品，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各樣品中7 種指標(biāo)成分的含量?；旌蠈φ掌啡芤汉蚎HP 供試品溶液的色譜圖見圖2，含量測定結(jié)果見表3、4。

表3 30 批QHP 樣品中2 種環(huán)烯醚萜苷類成分、5 種生物堿類成分和5 種糖類成分含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components in 30 batches of QHP

由表3 可知，QHP 中環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇和益母草苷總含量順序為XG＞XD＞SD；5 種黃連堿類成分總含量順序為SD＞XD＞XG。由表4 可知，10 批XD 中梓醇的均值為5.743 mg/g，益母草苷的均值為3.511 mg/g，黃連堿的均值為9.256 mg/g；表小檗堿的均值為1.135 mg/g，藥根堿的均值為1.471 mg/g；小檗堿的均值為26.092 mg/g，巴馬丁的均值為5.176 mg/g；10 批XG 中梓醇的均值為7.178 mg/g，益母草苷的均值為5.122 mg/g，黃連堿的均值為8.951 mg/g；表小檗堿的均值為1.043 mg/g，藥根堿的均值為1.391 mg/g；小檗堿的均值為24.496 mg/g，巴馬丁的均值為5.201 mg/g；10 批SD 中梓醇的均值為3.154 mg/g，益母草苷的均值為1.330 mg/g，黃連堿的均值為10.705 mg/g；表小檗堿的均值為1.446 mg/g，藥根堿的均值為1.638 mg/g；小檗堿的均值為28.794 mg/g，巴馬丁的均值為5.795 mg/g。

表4 2 種環(huán)烯醚萜苷類成分、5 種生物堿類成分和5 種糖類成分含量差異性分析 (±s, n = 10)Table 4 Analysis of differences of content in two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components (±s, n = 10)

表4 2 種環(huán)烯醚萜苷類成分、5 種生物堿類成分和5 種糖類成分含量差異性分析 (±s, n = 10)Table 4 Analysis of differences of content in two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components (±s, n = 10)

縱向比較具有相同字母的兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。there was no statistically significant difference between the two groups with the same letters in the longitudinal comparison (P < 0.05).

樣品 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)梓醇 益母草苷 黃連堿 表小檗堿 藥根堿 小檗堿XD 5.743±0.159b 3.511±0.104b 9.256±0.145b 1.135±0.009b 1.471±0.036b 26.092±0.108b XG 7.178±0.545a 5.122±0.106a 8.951±0.301b 1.043±0.017c 1.391±0.008c 24.496±0.564c SD 3.154±0.262c 1.330±0.077c 10.705±0.538a 1.446±0.060a 1.638±0.024a 28.794±1.125a樣品 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1)巴馬丁 果糖 葡萄糖 蔗糖 棉子糖 水蘇糖XD 5.176±0.087b 7.158±0.582b 5.332±0.202b 36.528±0.911b 16.204±0.648a 120.974±1.280a XG 5.201±0.090b 4.982±0.264c 5.198±0.160b 38.845±0.558a 14.161±0.452b 116.240±1.439b SD 5.795±0.232a 8.319±0.538a 5.543±0.118a 32.660±0.920c 12.228±0.267c 100.980±1.447c

對XD、XG 和SD 中7 種成分含量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，SD 與XD、XG 相比7 種成分含量均有顯著性差異（P＜0.05）。

2.5 糖類成分含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈（32∶68）；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。ELSD 參數(shù)：氣體體積流量2.8 L/min，漂移管溫度85.0 ℃，增益1。

2.5.2 對照品溶液的制備 取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度分別為1.590、2.710、11.150、7.440、54.980 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取QHP 樣品0.2 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入60%色譜甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min（功率500 W、頻率40 kHz），取出放冷，稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液2 mL，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.2”項下混合對照品溶液0.10、0.50、1.00、1.25、2.50 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)（X），以對應(yīng)的峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及線性范圍分別為果糖Y＝0.767X＋2.740，r＝0.999 3，線性范圍16.0～238.0 μg/mL；葡萄糖Y＝0.854X＋2.895，r＝0.999 2，線性范圍27.0～406.0 μg/mL；蔗糖Y＝1.062X＋1.641，r＝0.999 5，線性范圍111.0～1 673.0 μg/mL；棉子糖Y＝1.101X＋1.278，r＝0.999 9，線性范圍74.0～1 116.0 μg/mL；水蘇糖Y＝3.078X－12.00，r＝0.999 2，線性范圍550.0～8 247.0 μg/mL。

2.5.5 精密度試驗 取XD1 樣品制備的供試品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算各待測成分峰面積的RSD，考察儀器的精密度。結(jié)果顯示，5 個待測成分峰面積的RSD 均小于2.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取XD1 樣品制備的供試品溶液，4 ℃條件下保存，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各待測成分峰面積的RSD。結(jié)果顯示，5 個待測成分峰面積的RSD 均小于1.86%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗 取XD1 樣品6 份，按“2.5.3”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣分析，計算各待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。結(jié)果顯示，5 個待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 均小于3.44%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5.8 加樣回收率試驗 取已測定各指標(biāo)成分含量的XD1 樣品9 份，每份約0.25 g，精密稱定，分3組，分別按QHP 樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50%、100%、150%加入對照品，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算QHP 樣品中5 種成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果5 種成分的平均加樣回收率為 98.57%～99.40%，RSD 為0.80%～1.56%，均小于3%。

2.5.9 樣品測定 取表1 中的30 批QHP 樣品，分別按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算樣品中5 種糖類成分的含量?；旌蠈φ掌啡芤汉凸┰嚻啡芤旱纳V圖見圖7，含量測定結(jié)果見表3。由表3 可知，5 種糖類成分含量總值順序為XD＞XG＞SD。由表4 可知，10 批XD 中果糖含量的均值為7.158 mg/g，葡萄糖的均值為5.332 mg/g，蔗糖的均值為36.528 mg/g，棉子糖的均值為16.204 mg/g，水蘇糖的均值為120.974 mg/g；10 批XG 中果糖含量的均值為4.982 mg/g，葡萄糖的均值為5.198 mg/g，蔗糖的均值為38.845 mg/g，棉子糖的均值為14.161 mg/g，水蘇糖的均值為116.240 mg/g；10 批SD 中果糖含量的均值為8.319 mg/g，葡萄糖的均值為5.543 mg/g，蔗糖的均值為32.660 mg/g，棉子糖的均值為12.228 mg/g，水蘇糖的均值為100.980 mg/g。其中，棉子糖和水蘇糖的含量均值順序為XD＞XG＞SD，與5種糖含量總值一致，而果糖、葡萄糖的含量均值順序為SD＞XD＞XG，蔗糖的含量均值順序為XG＞XD＞SD。對XD、XG 和SD 中5 種糖類成分含量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，SD 與XD、XG 相比5 種糖類成分含量均有顯著性差異（P＜0.05）。

圖7 混合對照品 (A) 和XD1 樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.7 HPLC of mixed reference substances (A) and XD1 sample (B)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

考察了甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀、甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀、乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀6 個流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀為流動相，色譜峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)?？疾觳煌鶞兀?5、30、35 ℃）、不同波長（203、210、230、280、354 nm）條件下檢測、不同體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同進(jìn)樣量（5、10、20 μL），發(fā)現(xiàn)柱溫35 ℃、檢測波長（0～25 min，203 nm；25～80 min，280 nm）、體積流量0.8 mL/min、進(jìn)樣量5 μL 時，供試品溶液中各色譜峰均有較好的分離。

3.2 XD、XG、SD 的質(zhì)量分析

本研究采用HPLC 建立了地黃不同入藥形式制QHP 的HPLC 指紋圖譜，30 批樣品具有較高相似度。對HPLC 指紋圖譜進(jìn)行差異分析，可知XD、XG、SD 的HPLC 色譜圖峰數(shù)目無明顯區(qū)別，而XD 和XG 中峰1、2（梓醇）峰高明顯高于SD。采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，可以將黃連丸樣品分為XD、XG、SD 3 類，并確定1、6、15（表小檗堿）、3、4、2（梓醇）、16、9 色譜峰對區(qū)分地黃不同入藥形式制QHP 的貢獻(xiàn)較大。

含量測定研究中，通過測定QHP 中環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇、益母草苷，發(fā)現(xiàn)梓醇和益母草苷總含量順序為XG＞XD＞SD。測定生物堿類成分黃連堿、表小檗堿、藥根堿、小檗堿、巴馬丁的含量發(fā)現(xiàn)，5 種黃連堿類成分總含量順序為SD＞XD＞XG。測定5 種糖類成分發(fā)現(xiàn)，5 種糖類成分含量總值順序為XD＞XG＞SD，棉子糖和水蘇糖的含量均值順序為XD＞XG＞SD。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，SD 與XD、XG 相比2 種環(huán)烯醚萜苷類、5 種生物堿類、5種糖類成分含量均有顯著性差異。分析含量測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)XD、XG 中梓醇、益母草苷、棉子糖、水蘇糖含量較高，XD、XG 中生物堿類成分含量略低于SD。其中梓醇具有抗炎、降糖等藥理作用，棉子糖和水蘇糖是地黃低聚糖，主要具有補(bǔ)血、降血糖等藥理活性[14]。研究表明，黃連單獨(dú)使用治療2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠致死率較黃連丸高[17]，推測可能與黃連中的生物堿類成分有關(guān)，其可能原因是黃連配伍地黃后，地黃中梓醇等苷類成分及糖類成分的存在對生物堿類成分溶出存在抑制作用，因此，鮮地黃用于制備QHP質(zhì)量更好，考慮到鮮地黃汁不易儲存等問題，實(shí)際應(yīng)用中可以使用鮮干地黃片來制備黃連丸。下一步可設(shè)計臨床藥理實(shí)驗探究地黃不同入藥形式制QHP 的藥效差異并對梓醇和地黃寡糖配伍黃連治療糖尿病展開研究。

綜上所述，指紋圖譜作為一種中藥質(zhì)量控制模式，可以結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對中藥成分進(jìn)行有效的分析，并且與多成分含量測定相結(jié)合進(jìn)一步達(dá)到中藥質(zhì)量評價[20]。本研究采集鮮地黃，創(chuàng)新地將地黃不同入藥形式與黃連配伍制備黃連丸，研究結(jié)果揭示了XD、XG、SD 中有效成分含量差異，為鮮干地黃片用于制備QHP 提供科學(xué)的參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突