基于Box-Behnken 設計-響應面法和電子眼的梔子姜炙工藝研究

范星晨，祁玉芳，張科衛(wèi)，汪思晨，戴桂鈺，陸兔林，毛春芹

南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023

梔子GardeniaeFructus為茜草科梔子屬植物梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實，是中國傳統(tǒng)的藥食同源品種之一[1-2]。其性寒，味苦，具有瀉火除煩、涼血解毒、消腫止痛、清熱利濕的功效?，F(xiàn)代研究表明，梔子中所含的梔子苷、西紅花苷等成分具有保肝利膽、抗炎、抗抑郁等作用[3-7]。

有關梔子的炮制最早見于東漢，稱為“擘”，即敲擊梔子使其裂開[8]。到了宋代，《產(chǎn)寶雜錄》首載“姜汁炒焦黃”[9]。姜梔子的炮制方法自此不斷改良和完善，姜汁炙法也一直沿用至今?！吨袊幍洹?020年版收載的越鞠保和丸、黃連上清顆粒、導赤丸等14 種成方制劑均以姜梔子組方配伍入藥，但歷版《中國藥典》梔子項下均未收錄姜梔子這一飲片。查閱國家及各省市的炮制規(guī)范發(fā)現(xiàn)，北京、天津、山西、河南、福建、山東、重慶等省市均收錄了姜梔子飲片及其炮制方法，但是不同地區(qū)姜梔子的炮制方法有所不同，且均缺少細化統(tǒng)一的炮制工藝參數(shù)。故有必要對姜梔子的炮制工藝參數(shù)進行細化，以使其質(zhì)量穩(wěn)定可控，從而保證臨床用藥安全有效。

本研究采用 Box-Behnken 設計-響應面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）考察姜梔子炮制工藝，以外觀性狀與內(nèi)在指標性成分的含量相結(jié)合，以此細化姜梔子炮制工藝參數(shù)，為中藥飲片炮制工藝的規(guī)范化研究提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；MS-105D 型1/10 萬電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多集團；CM-5 型分光測色儀，日本柯尼卡美能達有限公司；KQ-500E 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；H1650-W 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FA1104N 型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；美的C21-RT2170 型勻火電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司；JYL-C93T 型榨汁攪拌機，九陽股份有限公司；BO-400Y 型多功能粉碎機，中國永康鉑政五金廠；H1650-W 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Milli-Q Integral 3 型超純水器，南京漢隆實驗器材有限公司。

1.2 試劑與藥品

對照品梔子苷（批號21092708，質(zhì)量分數(shù)99.11%）、西紅花苷I（批號20022801，質(zhì)量分數(shù)98.29%）、京尼平龍膽雙糖苷（批號21090604，質(zhì)量分數(shù)99.20%）、西紅花苷II（批號19102303，質(zhì)量分數(shù)98.84%）均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純；實驗用水為經(jīng)Milli-Q Integral 3 型超純水器處理后所得的超純水。

16 批梔子藥材（編號Z01～Z16）購于8 個不同的省份，分別為浙江金華（Z01）、蒼南（Z02），四川成都（Z03），山西晉城（Z04），安徽亳州（Z05）、六安（Z06），江西井岡山（Z07）、九江（Z08）、上饒（Z09）、樟樹（Z10），湖北神農(nóng)架（Z11）、蘄春（Z12），福建三明（Z13）、福安（Z14），湖南岳陽（Z15）、湘潭（Z16）；分別取上述梔子藥材按照《中國藥典》2020 年版飲片項下制備成相對應的凈梔子飲片（ZP01～ZP16）；輔料生姜購于江蘇南京。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學陳建偉教授鑒定，分別為茜草科梔子屬植物梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實、姜科姜屬植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖。經(jīng)檢測均符合《中國藥典》2020 年版的質(zhì)量要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子姜炙制備方法

2.1.1 輔料姜汁的制備 取生姜100 g，洗凈，搗碎，加水適量榨汁，用4 層紗布濾過。姜渣再加水適量，重復壓榨2 次，合并汁液，最后得生姜汁100 mL（每1 mL 生姜汁相當于生姜1 g）。

2.1.2 姜梔子的制備 取100 g 凈梔子飲片，加入一定量的姜汁拌勻，潤透，置于已設定相應功率的炒制容器內(nèi)，翻炒至規(guī)定程度，取出，晾涼，即得。其中姜汁用量以凈梔子飲片質(zhì)量的百分比表示。如10%的姜汁用量即指100 g 凈梔子飲片所用姜汁量為10 g。

2.2 指標成分的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～15 min，96%～88%乙腈；15～30 min，88%～80%乙腈；30～35 min，80%～74%乙腈；35～45 min，74%～60%乙腈；45～60 min，60%～96%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm 和440 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。經(jīng)上述色譜條件進樣檢測，樣品中梔子苷和西紅花苷I 色譜峰的保留時間與對照品的保留時間相一致，均能達到很好的分離效果。對照品及樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 混合對照品 (254 nm, A; 440 nm, B) 和姜梔子樣品(254 nm, C; 440 nm, D) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (254 nm, A; 440 nm, B) and Gardeniae Fructus processed with ginger juice(254 nm, C; 440 nm, D)

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I 和西紅花苷II適量，配制成質(zhì)量濃度為1.904、1.816、1.991、1.211 mg/mL 的混合對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取按“2.1.2”項下制成的姜梔子飲片，打粉。精密稱取其粉末（過四號篩）0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min（功率250 W、頻率40 kHz），放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，高速（12 000 r/min）離心（離心半徑5 cm）10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品儲備液，按倍比稀釋原則制備成系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積平均值（Y）對質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，計算回歸方程分別為京尼平龍膽雙糖苷Y＝647.030X＋1.517 2，r＝0.999 9，線性范圍59.6～952.0 μg/mL；梔子苷Y＝2 843.000X＋2.697 1，r＝0.999 5，線性范圍56.8～908.0 μg/mL；西紅花苷IY＝2 460.700X－22.152，r＝0.999 4，線性范圍62.2～996.0 μg/mL；西紅花苷IIY＝1 012.800X－12.951，r＝0.999 6，線性范圍75.7～605.5 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄各色譜峰峰面積，根據(jù)目標化合物峰面積計算其RSD。結(jié)果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 峰面積的RSD 分別為0.66%、0.52%、0.47%、0.67%，結(jié)果表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取姜梔子樣品粉末6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線法計算出各目標化合物的含量，并計算得各目標化合物含量的RSD。結(jié)果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 的平均質(zhì)量分數(shù)分別為2.706 8%、8.052 3%、6.095 2%、1.213 8%，其RSD 分別為1.40%、0.22%、0.71%、0.68%，結(jié)果表明所建立的試驗方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取同一份樣品粉末，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據(jù)目標化合物峰面積計算其RSD。結(jié)果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 峰面積RSD 分別為0.80%、0.73%、0.63%、0.92%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫密閉條件下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取0.05 g 已知各指標成分含量的姜梔子粉末9 份，分成3 組，每組分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL 的混合對照品溶液（其中1.0 mL 混合對照品溶液中指標成分質(zhì)量濃度與樣品中指標成分質(zhì)量濃度總體相當），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各目標化合物的加樣回收率及其RSD。結(jié)果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 的平均加樣回收率分別為100.12%、100.09%、99.99%、100.21%，RSD 分別為1.20%、0.90%、0.80%、1.30%，結(jié)果表明該試驗所建立的含量測定方法準確度良好。

2.3 姜梔子炮制工藝考察

2.3.1 BBD-RSM 試驗設計 根據(jù)本課題組前期研究情況[10]，選擇炒制火力（X1）、炒制時間（X2）、姜汁用量（X3）3 個因素設計響應面試驗，Y為綜合評分。炮制工藝評價選擇梔子苷、西紅花苷I、醇溶性浸出物的含量及外觀性狀（顏色＋氣味）作為指標。BBD-RSM 試驗設計與結(jié)果見表1，外觀性狀評分標準見表2。

表1 BBD-RSM 試驗設計與結(jié)果Table 1 Design and results of BBD-RSM

表2 姜梔子外觀性狀評分Table 2 Evaluation of appearance of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

按照Box-Behnken 試驗設計原理進行試驗設計，根據(jù)各指標重要程度確定綜合評分的方法，具體計算方法見如下公式。

i表示組別編號，S1i、S2i、S3i分別對應各組別姜梔子飲片梔子苷含量、西紅花苷I 含量、醇溶性浸出物含量，S1max、S2max、S3max分別對應所有組別姜梔子飲片梔子苷含量、西紅花苷I含量、醇溶性浸出物含量的最大值，Pi為各組別姜梔子飲片性狀評分（顏色＋氣味）（分），Pmax為所有組別姜梔子飲片性狀評分最大值（分）

2.3.2 梔子姜炙外觀性狀研究

（1）色澤評價：根據(jù)響應面法設計的試驗分組進行測色試驗，按“2.1”項下方法制備姜梔子飲片并粉碎過三號篩，備用。測色儀測定光源D65，視角測量口徑φ3 mm，測定試場10°，測量波長360～740 nm，測量波長間隔10 nm，照明光源脈沖氙燈，SCE 模式（不包含鏡面反射光），30 mm。零校正（放置透明片、黑筒）與用戶校正（放置透明片、白板）。將4.0 g 樣品粉末均勻平鋪在測試皿內(nèi)采集圖像并記錄色度值，平行測定3 次取平均值。

以明度值（L*）、紅綠值（a*）和黃藍值（b*）來表示色號并計算總色度值（Eab*），公式為Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2，Eab*越大顏色越淺[11]。其中L*由0～100 表示顏色由黑到白；a*由正到負表示顏色由紅到綠色；b*由正到負表示顏色由黃到藍[12-13]?？捎每偵钪担éab*）[11]表示2 個色號之間的色差，計算公式為ΔEab*＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2，規(guī)定當ΔEab*＞1.5 時，表示待測樣品顏色間有明顯差異[14]。顏色評分范圍見表3，不同炮制程度姜梔子飲片見圖2。由表3 可知，評分4 的總體亮度最高，顏色最淺，總體偏紅偏黃，符合主體紅黃色的外觀性狀描述；相比評分4，評分5 的姜梔子亮度、紅色度、黃色度均較小，故呈現(xiàn)金黃色的外觀；評分3、2、1 的姜梔子亮度、紅色度、黃色度隨著評分降低其下降幅度很大，其亮度逐漸變暗，顏色也逐漸加深，與肉眼所見的主觀感受相符合。取各個評分L*、a*、b*的平均值代入ΔEab*的計算公式，各個評分之間的ΔEab*按照評分順序從高到低分別為3.657、5.207、8.678、7.533 均遠大于規(guī)定所述的1.5，說明不同評分的姜梔子飲片顏色有明顯差異，故采用電子眼測色評價姜梔子的炮制程度是可行的。

表3 姜梔子顏色評分范圍Table 3 Color rating range of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

圖2 不同炮制程度姜梔子飲片F(xiàn)ig.2 Different processing degrees of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

（2）氣味評價：隨機選取15 名嗅覺正常的健康人員對炮制后的姜梔子飲片進行氣味測評，取其平均值作為氣味評分（評分標準見表2）。氣味評分結(jié)果見表1。

2.3.3 BBD-RSM 試驗結(jié)果 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按照標準曲線法計算，得出梔子苷、西紅花苷I 的含量；浸出物測定按照《中國藥典》2020 年版測定方法（通則2201），采用熱浸法提取醇溶性浸出物，提取溶劑為乙醇。結(jié)果見表1。

利用Design-Expert 10.0 軟件處理實驗數(shù)據(jù)，對各因素分別進行多元線性回歸和二項擬合，得到回歸方程Y＝?201.590 8＋0.652 9X1＋24.569 9X2＋24.661 8X3＋0.006 5X1X2－0.006 1X1X3－0.081 1X2X3－0.000 8X12－2.933 7X22－1.139 5X32，判定系數(shù)（R）0.982 0?；貧w模型具體數(shù)據(jù)見表4，本次建立的模型P＜0.001，F(xiàn)值為42.441 4，表明此響應回歸模型達到了極顯著性水平，具有統(tǒng)計學意義，且失擬項P值為0.095 6＞0.05，F(xiàn)值為4.321 9，失擬項不顯著，表明無失擬因素存在。因此，該回歸方程可對實驗結(jié)果進行分析。根據(jù)模型的判定系數(shù)（R2＝0.982 0）、調(diào)整判定系數(shù)（Radj2＝0.958 9）和預測判定系數(shù)（Rpre2＝0.943 3），可知有4.11%的變異不能用該模型解釋，說明該模型擬合性較好；變異系數(shù)（CV）2.58%＜10%表明試驗精確度可信度高。精密度是有效信號與噪聲的比值，為19.099 5＞4，說明試驗較為合理。

表4 Box-Behnken 回歸模型方差與顯著性分析Table 4 Analysis of variance and significance of Box-Behnken regression model

擬合模型中各系數(shù)的絕對值大小直接反映各因素對指標值的影響程度，X1、X2、X3、X12、X22、X32項P值具有統(tǒng)計學意義（均＜0.05），對綜合評分均有影響。其中單因素項的X1（炒制火力）和X2（炒制時間）對模型的影響表現(xiàn)出極顯著性水平（P＜0.001），對綜合評分影響較大，表明這2 項是影響姜梔子飲片質(zhì)量的主要因素。X3（姜汁用量）雖然不是影響姜梔子飲片質(zhì)量的主要因素，但仍表現(xiàn)出顯著性水平（P＜0.05）。根據(jù)F值大小得3 個因素對姜梔子炮制品質(zhì)量影響的貢獻率為X2＞X1＞X3。

根據(jù)擬合回歸方程，運用Origin 2018 軟件建立矩陣并繪制三維效應面圖和等高線圖，結(jié)果見圖3。右側(cè)各影響因素兩兩交互的等高線均呈現(xiàn)橢圓形，說明各因素交互作用較為顯著。結(jié)合左側(cè)三維效應面圖可知，炒制火力（X1）、炒制時間（X2）的三維圖傾斜度較高，坡度較陡，顏色加深變化顯著，說明這2 個因素對姜梔子炮制工藝綜合評分影響較為顯著，該結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

圖3 炒制溫度 (X1)、炒制時間 (X2)、姜汁用量 (X3) 3 因素對綜合評分的三維效應面圖和等高線圖Fig.3 Response and contour surface plots of processing firepower (X1), frying time (X2) and the amount of ginger juice (X3)three factors to composite score

利用軟件進行數(shù)據(jù)預測可知，姜梔子的最優(yōu)炮制工藝為炒制火力368.543 W，炒制時間4.459 min，姜汁用量9.677%，綜合評分為92.805 分。結(jié)合實際操作，將最佳工藝修正為炒制火力400 W，炒制時間4.5 min，姜汁用量10%。

2.4 姜炙工藝驗證試驗

按照上述優(yōu)化工藝制備3 份樣品，樣品表面呈金黃色，具姜辣味。具體評分結(jié)果見表5，結(jié)果表明本研究優(yōu)選出的姜梔子炮制工藝穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Results of verification test

2.5 梔子姜炙前后化學成分變化

取“1.2”項下的凈梔子飲片（ZP01～ZP16）；按照優(yōu)選工藝制備姜梔子飲片（JZP01～JZP16），按“2.2”項下方法進行測定，計算各成分含量，實驗結(jié)果見表6。梔子飲片經(jīng)姜炙后其中的京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷的含量均有上升；西紅花苷I、II的含量顯著降低，尤以西紅花苷II 含量下降最為顯著，平均下降幅度約為46%。

表6 16 批梔子飲片和姜梔子飲片樣品中4 種成分含量測定 (n = 3)Table 6 Contents of four compounds in Gardeniae Fructus samples (n = 3)

3 討論

目前，針對姜梔子的研究較少且研究內(nèi)容基本都以單個成分含量檢測為主，缺少其他的代表性成分。本研究引入電子眼測色這一技術(shù)，將外觀評價的色澤進行量化，減少了主觀因素帶來的評判失誤，這樣就能更加科學合理地對姜梔子飲片的炮制程度進行客觀評判。

本研究發(fā)現(xiàn)梔子在姜炙過程中其外觀性狀與內(nèi)在化學成分均發(fā)生了變化。梔子在姜炙不及時呈現(xiàn)原本的紅黃色，在姜炙得當后呈現(xiàn)金黃色，在姜炙太過時顏色逐漸呈棕褐色；梔子經(jīng)姜炙后，其中所含的梔子苷與京尼平龍膽雙糖苷的含量均有上升，該結(jié)果與其他學者的研究相一致[10,15]；西紅花苷I、II 的含量顯著降低，尤以西紅花苷II 下降最為顯著，可能與其作為長鏈結(jié)構(gòu)的化合物性質(zhì)不穩(wěn)定，較易轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)有關[16-17]。

在進行氣味評價試驗時，本實驗參考姜炙工藝的相關文獻報道[18-20]，發(fā)現(xiàn)目前尚未見測試氣味時所采用的測試人員的相關信息（健康狀況、人數(shù)）。為了使得氣味評分結(jié)果更具客觀性，本實驗選擇15名具有正常嗅覺的健康人員進行測試評分，然后取平均值的方法來獲得最終的氣味測試結(jié)果，從而保證氣味評價數(shù)據(jù)的合理性。

本實驗將顏色變化以客觀量化方式納入考察范疇，使得試驗結(jié)果更加科學、準確、客觀。在考察指標方面選用了梔子中的梔子苷、西紅花苷等具有生理活性的物質(zhì)作為評價指標，相比于單一化學成分的考察更加合理，且這些指標成分在實際測定過程中耗費的資源成本較低，符合企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的要求。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突