對(duì)銀屑病患者外周血中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成的觀察

屈小燕 陳盼 倪文瓊 肖輝 （鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科，鄭州 450007）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病，成人和兒童均可發(fā)病，全身泛發(fā)的皮損給個(gè)人帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)［1］。除了皮膚損害，銀屑病患者發(fā)生某些其他系統(tǒng)疾病共病的概率升高，包括銀屑病關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、代謝綜合征和自身免疫性疾病等［2］。銀屑病與其共病的機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有研究認(rèn)為其由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起［3］。許多經(jīng)典的（包括T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）和非經(jīng)典的免疫細(xì)胞（如角質(zhì)形成細(xì)胞）參與了銀屑病的發(fā)病，其中短壽命的中性粒細(xì)胞（poly morphonuclear neutrophil，PMN）可能發(fā)揮一定作用［4-6］。

中性粒細(xì)胞可以率先捕獲外源性的刺激，如細(xì)菌、病毒等，并通過獨(dú)特的死亡機(jī)制釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）［7］。2004年，BRINKMANN等［8］描述了這一機(jī)制，即組蛋白3（Histone 3，H3）瓜氨酸化修飾使染色質(zhì)解螺旋，最終導(dǎo)致顆粒來源蛋白修飾的染色質(zhì)纖維網(wǎng)（即NETs）的程序性外化，該過程被命名為NETosis。已有研究發(fā)現(xiàn)，NETs作為一種天然的生物防御機(jī)制，其升高與炎癥反應(yīng)和相關(guān)疾病如肥胖、自身免疫性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等有關(guān)［9-10］。

本研究通過觀察銀屑病患者外周血和皮損中PMN形成NETs的情況，并與臨床分型、疾病嚴(yán)重性及炎癥指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探索NETs與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性，以期為研究中性粒細(xì)胞參與銀屑病發(fā)病的機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 將2018年8月至2020年12月就診于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科的符合中國銀屑病診療指南診斷標(biāo)準(zhǔn)的63例銀屑病患者作為銀屑病組，其中斑塊型39例、點(diǎn)滴型11例、紅皮病型5例、膿皰型6例、關(guān)節(jié)型2例。上述患者均由皮膚科2位主任醫(yī)師參照《中國銀屑病治療專家共識(shí)（2014版）》《中國銀屑病診療指南（2018完整版）》明確診斷。同時(shí)選取性別、年齡匹配的同期健康體檢者27例作為對(duì)照組（排除血常規(guī)異常、肝功能指標(biāo)異常、急慢性感染、過敏性疾病、自身免疫病患者），分別抽取2 ml外周血，同時(shí)對(duì)銀屑病患者的皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估（PASI、BSA評(píng)分），收集銀屑病組及對(duì)照組的家族史，以及血常規(guī)、血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、ASO、RF、CRP、PCT、ESR、血糖、血脂、血尿酸等臨床資料，并計(jì)算中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞（neutrophil/lymphocyte ratio，NLR）、外周血血小板/淋巴細(xì)胞（platelet/lymphocyte ratio，PLR）、系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)（systemic immune-inflammation index，SII）、衍生中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞（derived neutrophil/lymphocyte ratio，dNLR）等常見的血液炎癥指標(biāo)。同時(shí)采集其中5例銀屑病患者皮損。該研究通過鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)審查，所有參與者均已簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 Histopaque-1119、Histopaque-1077（Sigma）；紅細(xì)胞裂解液、BSA（索萊寶）；抗瓜氨酸化組蛋白3（Histone 3 citrullinated，H3Cit）、抗MPO、熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（Abcam）；抗熒光淬滅封片液（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 分離外周血中性粒細(xì)胞 采用密度梯度離心法分離外周血中性粒細(xì)胞。離心管中依次緩慢加入Histopaque-1119 4 ml、Histopaque-1077 2 ml、外周血（采血后1 h內(nèi)進(jìn)行）2 ml，700 g室溫離心30 min。小心吸取中性粒細(xì)胞層細(xì)胞懸液，PBS洗滌1次，再經(jīng)紅細(xì)胞裂解液分離得到中性粒細(xì)胞。

1.2.2 外周血和皮損NETs免疫熒光染色 將分離的中性粒細(xì)胞接種于6孔板，貼片1 h后，4%多聚甲醛固定液固定20 min，0.2%Triton X-100透膜10 min，5%BSA封閉1 h后，再用5%BSA稀釋的H3Cit和抗MPO混合一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，用5%BSA稀釋的熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG混合二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次?？篃晒獯銣绶馄悍馄?，置于熒光顯微鏡下觀察NETs的形態(tài)及數(shù)量。每例樣本在200倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野采集圖像。采用Image J圖像分析軟件分析熒光強(qiáng)度及半定量計(jì)數(shù)，以每個(gè)視野內(nèi)H3Cit（+）細(xì)胞數(shù)/DNA（+）細(xì)胞數(shù)作為NETs陽性率，以H3Cit的綠色熒光強(qiáng)度和面積代表NETs的熒光強(qiáng)度和面積。對(duì)制備好的銀屑病患者的蠟塊切片，進(jìn)行抗原修復(fù)后處理，具體步驟同外周血中性粒細(xì)胞的免疫染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)銀屑病組及對(duì)照組外周血自發(fā)NETs情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)將銀屑病組的NETs與臨床炎癥指標(biāo)及疾病嚴(yán)重性進(jìn)行相關(guān)性分析，采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試都是雙向的。多組對(duì)比采用Kruskal-Wallis Test，兩組間對(duì)比采用Mann-WhitneyUtest。相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病組皮損中NETs形成情況 熒光顯微鏡下觀察NETs的表達(dá)情況。銀屑病患者皮損的Munro微膿腫中可見H3Cit陽性表達(dá)（圖1）。

圖1 1例銀屑病患者皮損中NETs表達(dá)情況Fig.1 Expression of NETs in psoriatic lesions in 1 patient

2.2 銀屑病組及對(duì)照組外周血自發(fā)NETs情況對(duì)比 熒光顯微鏡下觀察NETs的形態(tài)及數(shù)量。結(jié)果顯示：銀屑病患者外周血中NETs的陽性率、H3Cit的總熒光強(qiáng)度、平均熒光強(qiáng)度、熒光面積均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖2、表1）。

表1 銀屑病及健康對(duì)照者外周血自發(fā)NETs陽性率及熒光強(qiáng)度對(duì)比分析表Tab.1 Comparative analysis table of positive rate and fluorescence intensity of spontaneous NETs in peripheral blood of psoriasis patients and healthy controls

圖2 銀屑病組及健康對(duì)照組自發(fā)NETs情況Fig.2 Spontaneous NETs in psoriasis group and healthy control group

2.3 NETs陽性率與銀屑病嚴(yán)重程度相關(guān)性分析為了解NETs作為銀屑病臨床指征的可能性，評(píng)估NETs產(chǎn)生與銀屑病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。結(jié)果如下：外周血NETs陽性率與銀屑病PASI評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.31，P=0.013），與BSA評(píng)分無明顯相關(guān)性（r=0.17，P=0.175，圖3）。

圖3 銀屑病外周血NETs陽性率與PASI、BSA相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of correlation between positive rate of NETs in psoriatic peripheral blood and scores of PASI and BSA

2.4 各型銀屑病間自發(fā)NETs比較分析 為了解NETs形成與銀屑病分型間的關(guān)系，本研究對(duì)比了各型銀屑病間的NETs形成情況，結(jié)果顯示，斑塊型、點(diǎn)滴型、紅皮病型、膿皰型、關(guān)節(jié)型銀屑病組間的NETs陽性率、總熒光強(qiáng)度、平均熒光強(qiáng)度、熒光面積均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 外周血NETs與銀屑病臨床指標(biāo)相關(guān)性分析回顧性收集患者代謝相關(guān)、TNF-α、IL-6、CRP、PCT等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)資料，將銀屑病組分為結(jié)果正常組及結(jié)果異常組，分析兩組間PASI、BSA、自發(fā)NETs的差異情況，結(jié)果如下：以代謝異常作為影響因素的研究部分，共收集48例銀屑病患者資料，其中合并代謝異常的患者23例（占總?cè)藬?shù)的47.92%），不合并代謝異常的患者25例（占總?cè)藬?shù)的52.08%），對(duì)比兩組發(fā)現(xiàn)，合并代謝異常組的NETs熒光面積顯著高于未合并代謝異常組（P=0.03）；高TNF-α組有患者20例（占總?cè)藬?shù)的47.62%），正常TNF-α組有患者22例（占總?cè)藬?shù)的52.38%），高TNF-α組的NETs總熒光強(qiáng)度和熒光面積均顯著高于正常TNFα組（P=0.01）；高IL-6、CRP、PCT組NETs陽性率、平均熒光強(qiáng)度、總熒光強(qiáng)度和熒光面積及PASI、BSA評(píng)分較正常IL-6、CRP、PCT組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 銀屑病組臨床指標(biāo)與NETs及疾病嚴(yán)重性相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of laboratory indicators with NETs and disease severity in psoriasis group

2.6 外周血炎癥標(biāo)志物與銀屑病嚴(yán)重程度及外周血自發(fā)NETs的相關(guān)性分析 本研究收集銀屑病組及健康對(duì)照組的NLR、PLR、SII、dNLR等數(shù)據(jù)，并與NETs及疾病嚴(yán)重性進(jìn)行相關(guān)性分析，以探索其作為評(píng)價(jià)銀屑病疾病嚴(yán)重性的可能性。結(jié)果如下：銀屑病組NLR、PLR、SII、dNLR較健康對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。銀屑病組的NLR、PLR、SII、dNLR與PASI、BSA、NETs的陽性率、總熒光強(qiáng)度、平均熒光強(qiáng)度及熒光面積間均無相關(guān)性（Pearson檢驗(yàn)，P＞0.05）。此外，本研究分別根據(jù)銀屑病組NLR、PLR、SII、dNLR的中位數(shù)將銀屑病患者分為高NLR、PLR、SII、dNLR組（≥中位數(shù)）和低NLR、PLR、SII、dNLR組（＜中位數(shù)），對(duì)比兩組的PASI、BSA及自發(fā)NETs情況，結(jié)果顯示兩組PASI、BSA、NETs的陽性率、總熒光強(qiáng)度、平均熒光強(qiáng)度及熒光面積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表3 銀屑病組及健康對(duì)照組血清炎癥指標(biāo)分析Tab.3 Analysis of serum inflammatory indexes in psoriasis group and healthy control group

3 討論

遺傳和環(huán)境因素與銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)［11］。在遺傳易感性和環(huán)境觸發(fā)器之間的相互作用中，微生物群入侵導(dǎo)致的感染可能是一個(gè)關(guān)鍵角色［12］。而中性粒細(xì)胞作為感染早期響應(yīng)的免疫細(xì)胞，在接收來自微生物的刺激后發(fā)揮的作用與銀屑病的炎癥免疫反應(yīng)有相關(guān)性。

中性粒細(xì)胞在銀屑病中作為固有免疫反應(yīng)中的“先鋒士兵”，可通過吞噬、脫顆粒作用或活化轉(zhuǎn)變?yōu)镹ETs參與免疫應(yīng)答［13-14］。研究表明，在類銀屑病小鼠模型中，消耗中性粒細(xì)胞可緩解類似銀屑病的皮損癥狀［15］。在藥物誘導(dǎo)的粒細(xì)胞缺乏癥患者中銀屑病皮損情況得到改善，而在中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；筱y屑病復(fù)發(fā)［16］。而且，有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者外周血和皮損中NETs含量明顯升高［17］。在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中，連續(xù)7 d靜脈注射CI-酰胺后，小鼠外周血中NETs含量明顯下降，皮膚細(xì)胞表達(dá)的炎癥因子水平降低，小鼠背部皮膚的鱗屑和棘層肥厚也減少，提示抑制NETs釋放可顯著緩解銀屑?。?8］。本研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血NETs形成增多，且與銀屑病PASI評(píng)分呈正相關(guān)，提示在銀屑病中，中性粒細(xì)胞可能以形成NETs的方式參與銀屑病發(fā)病，但其具體機(jī)制尚不明確。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)NETs中包含大量趨化因子和炎癥因子等成分，可促使未活化的中性粒細(xì)胞從血管中大量趨化、遷移至表皮并進(jìn)一步分泌NETs，形成以中性粒細(xì)胞反復(fù)激活為基礎(chǔ)的免疫激活循環(huán)［19］。在這一循環(huán)中，持續(xù)激活的中性粒細(xì)胞釋放NETs的同時(shí)，激活pDC，與Th1、Th17相互作用，釋放大量趨化因子和炎癥因子，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞［20］。因此，檢測(cè)外周血NETosis細(xì)胞可能作為評(píng)估銀屑病患者病情的一個(gè)炎癥指標(biāo)，或?yàn)榘邢蛑行粤＜?xì)胞的治療提供依據(jù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清TNF-α與NETs存在相關(guān)性。這種相關(guān)性在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和放射性軸性脊柱關(guān)節(jié)炎中也有報(bào)道，且后者在應(yīng)用Infliximab治療后發(fā)現(xiàn)NETosis生成減少［21-22］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，運(yùn)用Infliximab治療可通過抑制NETs的形成減少炎癥因子產(chǎn)生，改善疾病活動(dòng)性［23］。以上研究結(jié)果說明TNF-α可能促進(jìn)NETs的形成，而NETs有可能成為TNF-α單抗治療銀屑病的療效評(píng)估指標(biāo)之一

近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)NETs的產(chǎn)生與多種非感染性急慢性疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)［24］。環(huán)境因素如微生物感染、壓力、吸煙、肥胖和飲酒，作為銀屑病的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素和觸發(fā)因素，對(duì)機(jī)體的影響是全身性的，因此銀屑病也常常與其他疾病共病，越來越多的臨床研究證實(shí)銀屑病常合并代謝相關(guān)疾?。?5］。有研究認(rèn)為，代謝綜合征直接增加了銀屑病患者心血管疾病和過早死亡的風(fēng)險(xiǎn)，從而大大降低了他們的預(yù)期壽命［26］。這些共病中長(zhǎng)期的代謝紊亂可引起固有免疫的長(zhǎng)程激活，造成持久的代謝性炎癥，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激環(huán)境和炎癥因子將為NETosis過程提供有利的微環(huán)境，在某個(gè)觸發(fā)因素的影響下引起銀屑病復(fù)發(fā)［27］。研究表明，2型糖尿病及其相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化中，NETs形成明顯增加，與ApoE-/-敲除小鼠相比，通過敲除中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和蛋白酶-3進(jìn)而抑制NETosis的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變明顯減輕［28］。而對(duì)患有代謝綜合征和1型糖尿病的受試者使用Secukinumab進(jìn)行治療，反應(yīng)較好的患者平均體重、腰圍和BMI與對(duì)照組相比持續(xù)下降［29］。這些發(fā)現(xiàn)都說明NETs與銀屑病及其代謝相關(guān)共病密切關(guān)聯(lián)。本研究顯示合并代謝異常的銀屑病患者相對(duì)不合并代謝異常的銀屑病患者，其外周血自發(fā)NETs增強(qiáng)，NETs有可能是關(guān)聯(lián)銀屑病及其共病之間的機(jī)制之一。針對(duì)中性粒細(xì)胞，特別是針對(duì)NETs的藥物可能成為銀屑病的治療靶點(diǎn)之一。銀屑病的治療藥物富馬酸二甲酯具有削弱中性粒細(xì)胞功能和抑制NETs形成的作用，從另一方面佐證了NETs作為銀屑病治療靶點(diǎn)的可能性［30］。

急性感染是銀屑病觸發(fā)和復(fù)發(fā)機(jī)制中的關(guān)鍵因素，而中性粒細(xì)胞是早期響應(yīng)急性感染的“種子”，代謝紊亂患者體內(nèi)的炎癥狀態(tài)為這一過程提供“肥沃土壤”，促使中性粒細(xì)胞NETosis釋放NETs，在此微環(huán)境中，炎癥免疫反應(yīng)迅速級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，最終導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)。而這一過程涉及的具體機(jī)制還需要更深入的探索和研究。