痛風(fēng)基因表達(dá)譜的差異基因表達(dá)及免疫細(xì)胞浸潤分析

陳鋒 李華南 章曉云 黃慧蓮 陳躍平 任國武 （.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科，南寧 500；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 0006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 0004）

痛風(fēng)是人類最常見的代謝性風(fēng)濕病之一，其特征為單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體慢性沉積，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石、腎結(jié)石和痛風(fēng)性腎?。?］。流行病學(xué)證據(jù)表明，從1990年到2017年，痛風(fēng)在中國的患病率和發(fā)病率分別增長了6.88%和6.16%，其變化幅度遠(yuǎn)高于全球水平，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚［2］。隨著免疫學(xué)機(jī)制在骨科疾病中的應(yīng)用，越來越多研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)與骨骼之間存在共享分子和相互作用。研究表明，關(guān)節(jié)滑膜組織中除了滑膜細(xì)胞還包含巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中這些免疫細(xì)胞的異?；罨瘯龠M(jìn)關(guān)節(jié)炎癥和MSU晶體的形成［3-4］。因此，深入研究痛風(fēng)潛在的免疫細(xì)胞作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)安全有效的診療靶點(diǎn)非常重要。

本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（gene expression omnibus，GEO）下載痛風(fēng)患者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行差異基因表達(dá)和信號通路分析，再通過免疫細(xì)胞浸潤分析各免疫細(xì)胞在痛風(fēng)患者及健康對照者中的表達(dá)情況，最后分析痛風(fēng)差異基因、信號通路與免疫細(xì)胞間的作用關(guān)系，為研究痛風(fēng)發(fā)病的相關(guān)免疫機(jī)制提供新的見解，并確定痛風(fēng)的預(yù)期靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 篩選痛風(fēng)的相關(guān)芯片 以“Gout”“Human”“Peripheral blood”為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索痛風(fēng)的相關(guān)芯片，獲得編號為GSE160170的芯片矩陣文件和編號為GPL21827的平臺文件。該芯片中共納入12例樣本，其中6例為痛風(fēng)患者外周血，6份為健康對照者外周血。

1.2 重注釋比對 將平臺文件中的探針核酸序列整理為fasta格式，在Gencode數(shù)據(jù)庫（https：//www.gencodegenes.org/）下載人類染色體上所有轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列文件，運(yùn)用R語言（版本4.1.1）將探針核酸序列與人類染色體上所有轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列文件進(jìn)行比對，得到含有基因名的探針文件。

1.3 芯片數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用Perl語言（版本5.34.0）將矩陣文件與探針文件比對，獲得痛風(fēng)患者和健康對照者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集。然后利用R語言的limma包對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，再進(jìn)行差異分析。以P＜0.05和|log2fold change （FC）|＞1.2作為過濾條件，篩選出存在差異表達(dá)的基因，最后運(yùn)用R語言的pheatmap繪制差異基因聚類熱圖。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步探究痛風(fēng)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，將差異基因?qū)氲鞍谆プ鳎╬rotein-protein interaction，PPI）分析數(shù)據(jù)庫STRING（https：//string-db.org/）中，設(shè)定研究物種為“Homo Sapiens”，并設(shè)置連接評分＞0.98，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中（版本3.7.2），利用“NetworkAnalyzer”工具進(jìn)行可視化處理，并利用“CytoHubba”工具根據(jù)度值篩選出關(guān)鍵基因。

1.5 關(guān)鍵基因的功能富集分析 使用R語言的clusterProfiler包對關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，研究痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的主要生物功能及相關(guān)信號通路，最后運(yùn)用R語言的ggplot2包繪制GO及KEGG富集分析氣泡圖。

1.6 免疫細(xì)胞分析法 利用R語言CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/）包中的反卷積算法及其提供的22種免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征矩陣，對痛風(fēng)患者血清的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行1 000次模擬，計(jì)算各樣本中不同免疫細(xì)胞占比，并分析痛風(fēng)患者外周血和健康對照組中免疫細(xì)胞的差異性，從而獲得免疫細(xì)胞浸潤及分布情況；然后用R語言的barplot、pheatmap、corrplot、vioplo及ggplot2包分別繪制免疫細(xì)胞分布柱狀圖、免疫細(xì)胞聚類熱圖、免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖、小提琴圖以及主成分分析（principal components analysis，PCA）圖。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)差異基因的分析 利用perl和R語言等工具對芯片進(jìn)行重注釋后，再對其進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，痛風(fēng)患者共存在858個(gè)明顯改變的基因，其中496個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，362個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。選取差異表達(dá)最顯著的20個(gè)基因（表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的基因中各選取10個(gè)）繪制聚類熱圖，見圖1。

圖1 痛風(fēng)患者與健康對照組差異基因的聚類熱圖Fig.1 Clustering heat map of differential genes between gout patients and healthy controls group

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò) 借助STRING數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行分析，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)篩選出關(guān)鍵基因，見圖2。圖中共涉及25個(gè)節(jié)點(diǎn)，47條邊。度值排名前6的蛋白基因?yàn)镮L-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，基本信息見表1。

表1 關(guān)鍵基因的基本信息Tab.1 Basic information of key genes

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

2.3 GO和KEGG富集分析 GO富集分析關(guān)鍵基因功能的過程中，共確定了915個(gè)條目；KEGG富集分析關(guān)鍵基因共得到60條信號通路，根據(jù)富集的基因數(shù)排序，選取富集基因數(shù)最多的10個(gè)條目以氣泡圖的形式展現(xiàn)（P＜0.05），見圖3。分析結(jié)果顯示，痛風(fēng)發(fā)生發(fā)展的生物過程主要包括細(xì)胞對脂多糖、細(xì)菌來源分子及生物刺激的反應(yīng)；主要涉及IL-17、Toll樣受體、NOD樣受體、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等信號通路。

圖3 GO和KEGG富集分析氣泡圖Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis bubble plot

2.4 免疫細(xì)胞浸潤分布情況 本研究共涉及22種免疫細(xì)胞的類型，包括初始B細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞、初始CD4+T細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞、活化的CD4+記憶T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、未活化的NK細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。在R語言中，用barplot包繪制柱狀圖，可見不同免疫細(xì)胞在各個(gè)樣本中的具體占比情況，見圖4。然后用pheatmap包對免疫細(xì)胞與樣本的矩陣數(shù)據(jù)繪制熱圖：未活化的CD4+記憶T細(xì)胞、γδT細(xì)胞、未活化的NK細(xì)胞、未活化肥大細(xì)胞在健康對照組中表達(dá)相對較高；記憶性B細(xì)胞、活化的CD4+記憶T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在痛風(fēng)患者中表達(dá)相對較高，見圖5。

圖4 免疫細(xì)胞在不同樣本中的分布柱狀圖Fig.4 Histogram of distribution of immune cells in different samples

圖5 免疫細(xì)胞在不同樣本中的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of immune cells in different samples

2.5 免疫細(xì)胞間的相關(guān)性分析 本研究通過分析免疫細(xì)胞間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，濾泡輔助性T細(xì)胞與活化的肥大細(xì)胞相關(guān)系數(shù)最高，為0.91，即在同一樣品中濾泡輔助性T細(xì)胞與活化的肥大細(xì)胞呈正相關(guān)。而在同一樣品中，未活化的NK細(xì)胞與單核細(xì)胞相關(guān)系數(shù)最低，為-0.87，即在同一樣品中未活化的NK細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，見圖6。

圖6 免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖Fig.6 Heat map of correlations between immune cells

2.6 免疫浸潤差異分析 運(yùn)用R語言的vioplot包繪制小提琴圖，通過分析痛風(fēng)患者與健康對照組間免疫浸潤細(xì)胞差異，發(fā)現(xiàn)未活化的NK細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞在健康對照中顯著表達(dá)，而記憶性B細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在痛風(fēng)患者中顯著表達(dá)（P＜0.05，圖7）。

圖7 痛風(fēng)患者與健康對照組間免疫細(xì)胞的對比情況Fig.7 Comparison of immune cells between gout patients and healthy controls group

2.7 PCA 通過對痛風(fēng)患者與健康對照組中免疫細(xì)胞的浸潤情況行PCA，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者與健康對照組中的免疫細(xì)胞的主成分不交叉，區(qū)分度較好。該免疫細(xì)胞浸潤分析能夠很好地將痛風(fēng)患者與健康對照組區(qū)分開，見圖8。

圖8 免疫細(xì)胞PCAFig.8 PCA of immune cells

3 討論

痛風(fēng)作為一種慢性炎癥性疾病，其反復(fù)發(fā)作的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，且痛風(fēng)及其并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)隨年齡的增長而增加。此外，痛風(fēng)明顯增加了肥胖、心血管疾病、慢性腎臟疾病、靜脈血栓栓塞等亞健康或疾病風(fēng)險(xiǎn)［5］。目前認(rèn)為痛風(fēng)最主要的發(fā)病機(jī)制是MSU沉積誘發(fā)的損傷，并引起炎癥反應(yīng)和免疫功能紊亂［6］。然而，痛風(fēng)發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制和免疫機(jī)制仍有待研究。隨著生物信息技術(shù)的興起，該研究使得研究人員能夠探測和研究痛風(fēng)的基因變化［7］。因此本研究從GSE160170芯片中提取數(shù)據(jù)，并在痛風(fēng)患者和健康對照組之間鑒定出496個(gè)上調(diào)和362個(gè)下調(diào)的基因。PCA結(jié)果證實(shí)，這些基因可以很好地區(qū)分痛風(fēng)患者與健康對照組。為探尋痛風(fēng)的關(guān)鍵基因、信號通路與免疫細(xì)胞作用機(jī)制，篩選了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，并對其進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示IL-6、IL-1β、TNF、CCL3、CXCL8和CXCL1在痛風(fēng)患者的血清中均上調(diào)，主要富集在IL-17、Toll樣受體、NOD樣受體和NF-κB信號通路上，其生物過程主要涉及細(xì)胞對脂多糖、細(xì)菌來源分子及生物刺激的反應(yīng)。

下述將針對關(guān)鍵基因、信號通路與免疫細(xì)胞間的關(guān)系展開討論：①炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF與CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞：輔助性T細(xì)胞（helper T cells，Th）又稱為CD4+T細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)MSU晶體能夠以非抗原依賴的方式直接激活CD4+T細(xì)胞，使其表面NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NFκB ligand，RANKL）高表達(dá)，并通過與單核巨噬細(xì)胞表面的NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）進(jìn)行細(xì)胞間接觸，進(jìn)而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，最終產(chǎn)生骨質(zhì)破壞［8-10］。此外，在MSU晶體誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠中，CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化顯著增多，而Th17細(xì)胞分泌的IL-17不僅能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子加劇痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)［11-14］；②趨化因子CCL3、CXCL8、CXCL1與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞：CCL3通過與CCR1、CCR4和CCR5等受體結(jié)合而在炎癥中發(fā)揮作用。研究表明，痛風(fēng)關(guān)節(jié)滑膜組織中CCL3表達(dá)升高并介導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集［15］。CXCL8編碼的蛋白通常為IL-8，主要由單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生。而MSU晶體會刺激滑膜內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，進(jìn)而激活中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，加重炎癥反應(yīng)［16］。CXCL1與IL-8的作用相似，主要由受到IL-1β刺激的中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其同樣會介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的募集。而通過運(yùn)動(dòng)療法能夠降低MSU晶體對IL-1β、CXCL1的誘導(dǎo)作用［17-18］；③Toll、NOD樣受體信號與巨噬細(xì)胞：Toll樣受體屬于模式識別受體，激活前需要形成異源或同源二聚體。研究表明，痛風(fēng)患者外周血單核細(xì)胞表面的TLR2、TLR4識別MSU晶體后會募集IκB激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）/NF-κB信號，最終誘導(dǎo) IL-1β等炎癥因子的表達(dá)［19-20］。巨噬細(xì)胞的NOD樣受體3（NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）受到MSU晶體激活后會與 caspase-1組成蛋白復(fù)合體（NLRP3炎癥小體），進(jìn)而釋放IL-1β并引起炎癥反應(yīng)［21-22］?；谒Y選的基因、信號通路與痛風(fēng)免疫細(xì)胞的作用機(jī)制分析可見，影響痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基因和其調(diào)控的生物過程及信號通路均與免疫細(xì)胞的介導(dǎo)相關(guān)。

為進(jìn)一步探究痛風(fēng)免疫細(xì)胞間的作用機(jī)制，進(jìn)行免疫細(xì)胞間的相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，濾泡輔助性T細(xì)胞 （T cells follicular helper，Tfh）與活化的肥大細(xì)胞呈正相關(guān)，未活化的NK細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。①HUANG等［23］研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者外周血中Tfh細(xì)胞傾向于Tfh2細(xì)胞的極化，且Tfh2/Tfh1細(xì)胞比值與痛風(fēng)衰老呈正相關(guān)。DALBETH等［24］通過鑒定痛風(fēng)患者痛風(fēng)石的研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞大量分布于電暈區(qū)和纖維血管區(qū)，且表達(dá)出大量IL-1β。表明活化的肥大細(xì)胞參與痛風(fēng)石、血管炎癥的病變過程。相關(guān)細(xì)胞功能研究表明Tfh細(xì)胞能促進(jìn)IgE抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而與肥大細(xì)胞IgE受體結(jié)合，促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)（組胺、前列腺素、IL-1β等）［25］；②NK細(xì)胞在痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)中以擴(kuò)增式形成，且高尿酸患者經(jīng)過低嘌呤飲食后能降低血清中NK細(xì)胞數(shù)量［26］。痛風(fēng)發(fā)作時(shí)單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織，并分為成熟的巨噬細(xì)胞以提高對MSU晶體的吞噬能力；此外，成熟的巨噬細(xì)胞會分泌IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-18（IFN-γ誘導(dǎo)因子）等多種炎癥因子介導(dǎo)關(guān)節(jié)、腎臟等組織的炎癥［27］。目前尚缺少痛風(fēng)病變中NK細(xì)胞與單核細(xì)胞的共培養(yǎng)研究，但單核細(xì)胞分泌的IL-2、IL-18能夠刺激NK細(xì)胞增殖分化并產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α，而IFN-γ、TNF-α又能反向促進(jìn)單核細(xì)胞分化為成熟的巨噬細(xì)胞［28-29］。痛風(fēng)患者血清生物因子的調(diào)查研究也支持這一觀點(diǎn)，相較于健康人，痛風(fēng)患者血清中IL-1β、IL-2、IL-18、IFN-γ、TNF-α明顯升高［30］。因此，痛風(fēng)疾病中NK細(xì)胞與單核細(xì)胞存在相互介導(dǎo)活化作用，反而言之，未活化的NK細(xì)胞與單核細(xì)胞則具有負(fù)相關(guān)關(guān)系。

免疫浸潤差異分析結(jié)果顯示：活化的肥大細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞在痛風(fēng)患者中顯著表達(dá)。上文已討論活化的肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞免疫浸潤介導(dǎo)高尿酸、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。樹突狀細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，不依賴于特定細(xì)胞表面受體模式而是通過晶體-脂質(zhì)接觸方式與MSU晶體相互作用，當(dāng)其活化后會釋放IL-1β介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［31-32］；MSU與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)研究表明，MSU晶體會迅速誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分泌ATP到細(xì)胞外環(huán)境中，并誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、CXCL8、CCL2、CCL3等多種炎癥因子或趨化因子表達(dá)［33］。而記憶B細(xì)胞尚缺少在痛風(fēng)模型中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，未來仍待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)篩選并論述了痛風(fēng)中關(guān)鍵基因和相關(guān)通路在免疫細(xì)胞中的作用機(jī)制、痛風(fēng)免疫細(xì)胞的浸潤情況以及免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，可為痛風(fēng)的基礎(chǔ)研究提供理論支持。此外本研究尚存在一定局限性：首先，GEO數(shù)據(jù)集中有關(guān)痛風(fēng)的樣本量較??；其次，痛風(fēng)疾病中免疫細(xì)胞代謝和反應(yīng)受諸多因素影響，存在風(fēng)險(xiǎn)偏倚。但利用生物信息技術(shù)，綜合并分析各數(shù)據(jù)庫的相關(guān)研究，能夠更加系統(tǒng)、全面地預(yù)測痛風(fēng)分子機(jī)制與免疫細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性，并為理解痛風(fēng)免疫機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的診療靶點(diǎn)提供更全面的視角。