膀胱癌共刺激因子相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

湯鋕城 蔡月橋 廖海琴 盧澤潮 唐福才 盧澤廣 張嘉豪 賴永長(zhǎng) 閻淑丹 何朝輝

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州 510000；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣州 511436；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣州 511436；4.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院泌尿外科，深圳 518033；5.廣州醫(yī)科大學(xué)第六臨床學(xué)院，廣州 511436）

作為中國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病率逐年攀升，即使應(yīng)用根治性膀胱切除術(shù)，仍有約50%患者復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，帶來沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。盡管基于順鉑的新輔助化療等新療法被應(yīng)用于臨床，但仍存在療效不確切和治療反應(yīng)差異大等難題，而基于新型生物標(biāo)志物的靶向療法和免疫療法展現(xiàn)了光明的前景［2］。2016年以來，包括阿特朱單抗的5種免疫檢查點(diǎn)抑制劑已獲得美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于一二線治療，標(biāo)志著膀胱癌免疫治療開啟新篇章［3］。然而，僅有部分膀胱癌患者對(duì)特定的靶向治療有效，這很可能與某些基因位點(diǎn)突變密切相關(guān)［4］。因此，進(jìn)一步探索膀胱癌中的免疫反應(yīng)機(jī)制、開發(fā)新型生物標(biāo)志物以評(píng)估患者的病情進(jìn)展和指導(dǎo)個(gè)性化治療，對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵點(diǎn)，不僅與惡性表型密切相關(guān)，也顯著影響治療效果［5］。TME主要由駐留的基質(zhì)細(xì)胞和被招募的免疫細(xì)胞組成。研究表明，基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的相互作用很可能參與胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，并顯著影響患者預(yù)后［6-8］。WU等［9］研究表明，膀胱癌中的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞豐度與患者預(yù)后密切相關(guān)。在TME中，T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)刺激，第一信號(hào)來自抗原，第二信號(hào)來自抗原提呈細(xì)胞，其提供的共刺激信號(hào)決定T細(xì)胞活化的方向。共刺激信號(hào)的缺失會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞不能被激活，并中止后續(xù)免疫過程，癌細(xì)胞可能通過這種方式實(shí)現(xiàn)腫瘤逃逸。作為潛在的治療靶點(diǎn)，共刺激因子近年備受關(guān)注。ENDER等［10］通過實(shí)驗(yàn)表明，共刺激因子相關(guān)基因敲除顯著影響了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非肥胖性糖尿病等自身免疫病模型小鼠的生存情況。此外，共刺激因子也在癌癥的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，研究證實(shí)，在肝細(xì)胞癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌中，共刺激因子相關(guān)基因與患者免疫治療反應(yīng)和預(yù)后密切相關(guān)［11-13］。泌尿系統(tǒng)腫瘤中也有相關(guān)報(bào)道，在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中，基于CMS的預(yù)后模型已被證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素［14］。然而，目前關(guān)于膀胱癌中共刺激因子的表達(dá)模式和臨床意義的研究鮮有報(bào)道。綜上，課題組推測(cè)共刺激因子可能在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可能基于此開發(fā)新的生物標(biāo)志物和預(yù)后模型。

本研究旨在篩選出影響膀胱癌患者預(yù)后的共刺激因子相關(guān)基因，并根據(jù)獲得的基因建立模型，進(jìn)一步探索其背后機(jī)制。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并分析了mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)集，篩選出3個(gè)具有顯著預(yù)后價(jià)值的基因，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，再于多數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證其有效性。此外，通過功能富集和免疫浸潤(rùn)分析，比較高低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫浸潤(rùn)水平和生物通路差異，以探究膀胱癌發(fā)展機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取與整理 通過腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載人類膀胱癌患者的基因表達(dá)矩陣和臨床數(shù)據(jù)，剔除數(shù)據(jù)缺失樣本后，包含389例膀胱癌組織樣本和19例癌旁正常組織，隨機(jī)分為TCGA訓(xùn)練組（n=287）和TCGA驗(yàn)證組（n=121）。通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）下載GSE31684數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)譜，剔除數(shù)據(jù)缺失樣本后包含93例膀胱癌組織樣本。

1.2 免疫評(píng)分和基質(zhì)性評(píng)分的生成 免疫評(píng)分（estimate）是一種可用于評(píng)估腫瘤組織中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的算法工具，由YOSHIHARA等［15］首創(chuàng)，可較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)非腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。利用R包estimate進(jìn)行基質(zhì)和免疫微環(huán)境浸潤(rùn)評(píng)估，得出StromalScore和ESTIMATEScore，分別與基質(zhì)細(xì)胞、免疫和基質(zhì)細(xì)胞之和呈正相關(guān)，相應(yīng)分?jǐn)?shù)越高，提示TME中相應(yīng)成分比例越大。

1.3 共刺激因子相關(guān)基因預(yù)后模型的建立 Cox回歸模型是一種通過乘以風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)解釋協(xié)變量對(duì)總體效能的模型，常被用于評(píng)估諸如年齡、性別等患者臨床性狀對(duì)生存率的預(yù)測(cè)價(jià)值［16］。多變量Cox比例回歸模型被廣泛應(yīng)用于確定預(yù)后相關(guān)因子，并通過確定參數(shù)β和基因表達(dá)量計(jì)算獲得風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分［17］。檢索最新文獻(xiàn)，獲得60個(gè)與共刺激因子相關(guān)的編碼基因。為獲得預(yù)后相關(guān)基因并建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，使用R包Survival在TCGA驗(yàn)證組基因集進(jìn)行單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，獲得預(yù)后顯著相關(guān)的基因（P＜0.05）。再進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，獲得獨(dú)立預(yù)后相關(guān)基因（P＜0.05），并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。此公式由基因表達(dá)水平相應(yīng)回歸系數(shù)進(jìn)行加權(quán)后的線性組合確定。

1.4 預(yù)后模型的評(píng)價(jià) 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。使用R包pheatmap可視化兩組患者的生存情況和共刺激因子相關(guān)基因的表達(dá)量；使用R包Survminer繪制生存曲線比較兩組的總生存期；使用R包Survival進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析，并繪制森林圖可視化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、臨床分期、TMN分期與患者預(yù)后的相關(guān)性；通過R包timeROC繪制受試者工作特征（ROC）曲線，用以驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的準(zhǔn)確性。

1.5 列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證 為建立一個(gè)預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后的臨床工具，綜合考慮風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型與臨床特征（根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，年齡≥65歲很可能是重要預(yù)后危險(xiǎn)因素，因此將膀胱癌患者按年齡≥65歲或＜65歲分為高、低齡組［18］），并利用R包nomogramEx構(gòu)建了列線圖模型。該模型能夠分析1年、3年和5年的生存概率。此外，為可視化實(shí)際情況與預(yù)測(cè)結(jié)果間的一致性，利用R包rms繪制校準(zhǔn)曲線，其45°線代表最佳預(yù)測(cè)效能。

1.6 基因集合富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 為分析膀胱癌患者在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的信號(hào)通路差異，進(jìn)行功能富集分析。導(dǎo)入MsigDb數(shù)據(jù)庫的c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt作為參考基因集，使用GSEA軟件（4.1.0）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的芯片矩陣進(jìn)行分析。設(shè)置基因置換排列次數(shù)為1 000，P＜0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.25為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 免疫浸潤(rùn)分析 CIBERSORT是一種通過實(shí)體腫瘤中的基因表達(dá)值評(píng)估組織細(xì)胞組成的方法［19］。利用CIBERSORT分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的程度及不同類型免疫細(xì)胞的比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 研究中的所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R語言（版本4.1.1）進(jìn)行。采用皮爾遜相關(guān)性算法計(jì)算相關(guān)性。采用Kaplan-Meier（KM）生存分析評(píng)估生存情況，并采用對(duì)數(shù)秩級(jí)檢驗(yàn)評(píng)估分層組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床數(shù)據(jù)與ESTIMATE免疫評(píng)分 TCGA數(shù)據(jù)集患者的臨床信息見附表1（www.immune99.com），包含生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、癌癥級(jí)別、TNM分級(jí)。為評(píng)估TME中基質(zhì)組分與免疫組分的占比與膀胱癌患者臨床分期的相關(guān)性，通過ESTIMATE分析免疫評(píng)分與組織學(xué)分級(jí)（grade）、臨床分期（stage）的相關(guān)性。結(jié)果顯示，高組織學(xué)組ESTIMATEScore評(píng)分顯著增高（圖1A），且臨床分期Ⅱ組與臨床分期Ⅳ組之間的ESTIMATEScore評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。StromalScore評(píng)分同樣與組織學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)（圖1C），不同臨床分期間StromalScore評(píng)分也存在明顯差異（圖1D）。以上結(jié)果提示，膀胱癌患者的臨床分期及組織學(xué)分級(jí)與TME中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)。

表1 TCGA訓(xùn)練組中預(yù)后相關(guān)的共刺激因子相關(guān)基因單因素Cox分析結(jié)果Tab.1 Univariate Cox analysis of prognostic costimulatory genes in TCGA training group

圖1 TCGA數(shù)據(jù)集中TME免疫評(píng)分箱型圖Fig.1 Box plot of ESTIMATE score in TCGA dataset

2.2 基于CMS的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的構(gòu)建與驗(yàn)證 對(duì)60個(gè)CMS相關(guān)基因進(jìn)行單因素Cox回歸分析，篩選得到4個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的基因，結(jié)果如表1所示。利用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析確定獨(dú)立預(yù)后因素并優(yōu)化模型，最終篩選出3個(gè)基因：TNFRSF14、CD276、ICOS。基于3個(gè)基因的表達(dá)水平和回歸系數(shù)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)公式：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（-0.026 040 787 258 630 7）×TNFRSF14+（0.015 842 801 886 645 3）×CD276+（-0.279 64）×ICOS。

根據(jù)中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。在TCGA訓(xùn)練組中，散點(diǎn)圖結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者存活率更低（圖2A）；基因表達(dá)熱圖提示，高/低風(fēng)險(xiǎn)組中這3個(gè)基因的表達(dá)量有明顯差異（圖2B）；繪制KM曲線可視化患者的生存情況，高風(fēng)險(xiǎn)組的生存率明顯較低（圖2C）。在TCGA驗(yàn)證組和GEO組中評(píng)估患者的生存狀態(tài)和基因表達(dá)情況（圖2D～I(xiàn)）得到相同結(jié)論：低風(fēng)險(xiǎn)組患者存活率更高，3個(gè)CMSs表達(dá)水平差異顯著且總生存期較長(zhǎng)。

圖2 CMS預(yù)后模型的建立與驗(yàn)證Fig.2 Establishment and validation of CMS prognostic model

為進(jìn)一步探究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及其他臨床特征與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)行單因素Cox及多因素回歸分析。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期（stage）、T分期、M分期、N分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分均與預(yù)后顯著相關(guān)（圖3A）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是膀胱癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素（圖3B）。

圖3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征的單因素和多因素Cox回歸分析森林圖Fig.3 Forest map of univariate and multivariate Cox analysis of risk score and clinical characteristics

在TCGA訓(xùn)練組、TCGA驗(yàn)證組和GEO組中繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和年齡、性別等臨床特征的ROC曲線，三組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在ROC曲線中所對(duì)應(yīng)的1年AUC值分別為0.698、0.706、0.620（圖4），均高于其他臨床特征。ROC分析結(jié)果提示，基于CMS的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)膀胱癌患者的預(yù)后評(píng)估準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)臨床特征。

圖4 TCGA訓(xùn)練組、TCGA驗(yàn)證組和GEO驗(yàn)證組中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及其他臨床特征的ROC曲線Fig.4 ROC curves of risk scores and other clinical features among TCGA training group， TCGA validation group and GEO group

2.3 預(yù)后列線圖的構(gòu)建與驗(yàn)證 綜合考慮臨床分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分等臨床病理特征構(gòu)建了預(yù)測(cè)總生存期的列線圖。將預(yù)后相關(guān)因素在點(diǎn)軸上對(duì)應(yīng)的評(píng)分相加可得到總得分，再向下繪制到1年、3年、5年的生存軸，可預(yù)測(cè)1年、3年、5年的生存率。由圖5可知，大部分患者的總分為190～240分。

圖5 1年，3年和5年總生存期的預(yù)后預(yù)測(cè)列線圖Fig.5 Nomogram for predicting 1- ，3- and 5-year OS

為檢驗(yàn)列線圖的預(yù)后預(yù)測(cè)效能，使用校準(zhǔn)曲線進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在TCGA訓(xùn)練組和GEO驗(yàn)證組中，預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際觀測(cè)具有良好的一致性（圖6A、C）。隨后，對(duì)列線圖預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，訓(xùn)練組在ROC曲線中對(duì)應(yīng)的1年、3年、5年的AUC值分別為0.740、0.710、0.718（圖6B），驗(yàn)證組在ROC曲線中對(duì)應(yīng)的1年、3年、5年的AUC值分別為0.730、0740、0.718（圖6D）。綜上所述，基于CMS的列線圖顯示出良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效能。

圖6 TCGA組和GEO組中列線圖1年、3年及5年總生存期校準(zhǔn)曲線與ROC曲線Fig.6 1-， 3- and 5 year OS correction curve and ROC curve of bladder cancer patients in TCGA and GEO group

2.4 基因集合富集分析 通過GESA方法分析TCGA數(shù)據(jù)集和GEO數(shù)據(jù)集中高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異的生物功能通路。結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）互作受體、抗原處理與提呈、自身免疫性甲狀腺病、卵母細(xì)胞成熟分裂、細(xì)胞周期等功能通路中；低風(fēng)險(xiǎn)組主要富集在1型糖尿病、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等功能通路中（圖7）。

圖7 基于CMS構(gòu)建的預(yù)后模型得到高、低風(fēng)險(xiǎn)組基因富集通路Fig.7 Gene enrichment analysis of high and low risk groups based on CMS risk score

2.5 免疫浸潤(rùn)分析 為研究膀胱癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞含量情況，使用CIBERSORT算法計(jì)算TME浸潤(rùn)免疫細(xì)胞。藍(lán)色為高風(fēng)險(xiǎn)組，紅色為低風(fēng)險(xiǎn)組。如圖8所示，差異浸潤(rùn)免疫細(xì)胞組分的箱形圖顯示，CD8+T細(xì)胞（P＜0.001）、濾泡輔助性T細(xì)胞（P＜0.01）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（P＜0.001）、活化的NK細(xì)胞（P＜0.05）在低風(fēng)險(xiǎn)組中更豐富，M0巨噬細(xì)胞（P＜0.001）則在高風(fēng)險(xiǎn)組浸潤(rùn)程度更高。

圖8 高、低風(fēng)險(xiǎn)組間不同免疫細(xì)胞組成的小提琴圖Fig.8 Violin plot of different immune cell components between high and low risk groups

3 討論

作為全球范圍內(nèi)常見癌癥之一，膀胱癌2020年報(bào)告新增病例約573 000例，男性患者多見，病死率居高不下，造成巨大社會(huì)負(fù)擔(dān)［20］。因其早期診斷困難，易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，膀胱癌患者的預(yù)后始終較差［2］。近年來，免疫治療展現(xiàn)出光明前景，促使與之密切相關(guān)的TME重回大眾視野［21］。ZHOU等［22］研究提示，在膀胱癌中，腫瘤浸潤(rùn)性B淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)鏈非編碼RNA可能成為TME中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)指標(biāo)，用以預(yù)測(cè)免疫治療療效；CHEN等［23］則從細(xì)胞焦亡方面證實(shí)了TME浸潤(rùn)對(duì)膀胱癌免疫治療策略的指導(dǎo)意義重大。

作為TME的重要調(diào)控分子，共刺激因子已成為時(shí)下研究熱點(diǎn)。其被證實(shí)在不同腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮雙向調(diào)控作用：TNFRSF14高表達(dá)淋巴瘤患者往往預(yù)后較差，而TNFRSF14過表達(dá)與膀胱癌細(xì)胞凋亡和增殖減慢相關(guān)［24-25］。作為預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，其已在肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中有相關(guān)研究，并取得一定進(jìn)展［26-28］。而在膀胱癌中，相關(guān)研究鮮有報(bào)道。綜上所述，課題組設(shè)計(jì)本研究以篩選潛在預(yù)后生物標(biāo)志物，并探究共刺激因子在膀胱癌進(jìn)展的可能機(jī)制。

免疫評(píng)分結(jié)果顯示，TME中免疫和基質(zhì)成分比例與患者臨床與組織學(xué)分期密切相關(guān)：免疫評(píng)分越高，組織學(xué)分級(jí)、臨床分期越高，患者預(yù)后越差，表明免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在膀胱癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。隨后，從相關(guān)文獻(xiàn)中選取60個(gè)與共刺激因子相關(guān)的編碼基因，通過單因素和多因素Cox回歸分析，篩選預(yù)后相關(guān)基因并優(yōu)化模型，最終得到TNFRSF14、CD276、ICOS 3個(gè)基因，并開發(fā)了一種新的生存預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。生存分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存期明顯較短，存活率較低。該模型在TCGA驗(yàn)證組和GEO組中均得到了良好的驗(yàn)證。多因素Cox分析也證明，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型是膀胱癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。以上結(jié)果提示，基于CMS的預(yù)后模型有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，篩選出的TNFRSF14、CD276、ICOS可能成為膀胱癌診斷或免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

TNFRSF14又稱皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)（HVEM），作為TNFRSF家族成員之一，可與TNF家族成員LIGHT交聯(lián)刺激T細(xì)胞，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，也可與BTLA結(jié)合，觸發(fā)T細(xì)胞的抑制信號(hào)［29］。文獻(xiàn)報(bào)道，在黑色素瘤等腫瘤中，HVEM在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)比PD-L1更廣泛，有作為預(yù)后標(biāo)志物的潛在價(jià)值［30］。WANG等［31］發(fā)現(xiàn)TNFRSF14可能通過Wnt-β-catenin依賴途徑在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮作用，其可能是一種腫瘤抑制因子，與本研究結(jié)果一致。CD276也稱B7-H3，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑中的免疫檢查點(diǎn)因子。LIU等［32］研究表明，在膀胱癌、乳腺癌等癌組織中，CD276的表達(dá)水平較癌旁組織顯著上調(diào)。研究證實(shí)，CD276與CTLA-4具有協(xié)同作用，可在乳腺癌腫瘤、黑色素瘤、肝細(xì)胞癌和宮頸癌等癌癥的增殖和進(jìn)展方面起到關(guān)鍵作用［33-34］。此外，CD276也在膀胱癌中的研究取得一定進(jìn)展：ZHENG等［35］研究表明，在膀胱癌中，CD276高表達(dá)者免疫治療后預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)者。ICOS（CD278、AILIM、H4）屬于B7-CD28/CTLA-4家族成員，在多種癌癥進(jìn)展發(fā)揮作用：AMATORE等［36］指出，一方面，ICOS促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞激活，發(fā)揮抗腫瘤作用；另一方面，ICOS通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加腫瘤免疫逃逸的機(jī)會(huì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。數(shù)據(jù)研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，ICOS可顯著增強(qiáng)CTLA-4抑制劑的療效［37］；但在黑色素瘤患者中，ICOS擴(kuò)增預(yù)示著更差的預(yù)后［38］。而ICOS與膀胱癌的關(guān)系鮮有研究，LIAKOU等［39］設(shè)計(jì)術(shù)前臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗CTLA-4的單克隆抗體后，患者外周血和腫瘤組織中ICOS濃度顯著增加，可反映治療進(jìn)展。本研究側(cè)面驗(yàn)證ICOS可能是CTLA-4單抗發(fā)揮抗腫瘤活性的重要一環(huán)，具有用于監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)用藥的潛在價(jià)值。

通過GSEA探索相關(guān)生物通路，結(jié)果主要富集在以下3個(gè)功能通路：ECM-受體相互作用、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期。ECM是一種非細(xì)胞的三維大分子網(wǎng)絡(luò)，由膠原蛋白，蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層狀體和糖蛋白組成，其在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活和形態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中舉足輕重［40］。ECM在TME中含量豐富，據(jù)RIEGLER等［41］研究，膠原蛋白和ECM與腫瘤細(xì)胞生物行為方面的功能密切相關(guān)。ECM在癌癥等疾病中呈現(xiàn)混沌狀態(tài)，ECM異常將促進(jìn)細(xì)胞分化與轉(zhuǎn)移，加速癌癥進(jìn)程［42］。文獻(xiàn)報(bào)道，ECM微環(huán)境Ⅰ型膠原蛋白的變化可能會(huì)促進(jìn)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的進(jìn)展［43］。細(xì)胞周期是所有生物體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的共有過程，包括在有絲分裂期間染色體DNA的復(fù)制［44］。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的G2/M期的細(xì)胞周期停滯，可發(fā)揮抗腫瘤作用［45］。此外，多項(xiàng)研究表明，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和細(xì)胞周期通路是膀胱癌的顯著富集信號(hào)通路［46-47］。綜上，課題組推測(cè)，膀胱癌細(xì)胞可能通過影響減數(shù)分裂過程，改變正常細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)ECM，促進(jìn)ECM-受體相互作用，完成其增殖和侵襲，而阻斷細(xì)胞周期和抑制黏附信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為膀胱癌的潛在治療方法。

膀胱癌發(fā)生發(fā)展與免疫密不可分，免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示，高?；颊吆芸赡芴幱诿庖咭种茽顟B(tài)。CD8+T細(xì)胞及濾泡輔助性T細(xì)胞浸潤(rùn)程度低，M0巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度高，對(duì)腫瘤抑制力弱，且難以刺激B細(xì)胞增殖產(chǎn)生后續(xù)抗體。低?；颊叩腃D8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度高，提示這些患者的抗腫瘤免疫應(yīng)答可能處于相對(duì)活躍的狀態(tài)，與理論分析一致。

本研究所建立的基于CMS的預(yù)后模型具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，但仍然具有局限之處。首先，本研究的病例均為回顧性樣本，未獲得前瞻性研究驗(yàn)證。其次，本研究主要基于TCGA和GEO在線數(shù)據(jù)庫的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，亞裔樣本量小，分析結(jié)果具有一定的提示作用，但結(jié)論尚需結(jié)合實(shí)際情況和臨床成果進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究篩選出TNFRSF14、CD276、ICOS 3個(gè)基因，它們有可能成為膀胱癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)；基于CMS建立了膀胱癌患者的預(yù)后模型和臨床列線圖，可較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)膀胱癌患者的預(yù)后，并反映癌組織中不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，有助于膀胱癌患者早期預(yù)后評(píng)估和治療方案選擇。