烏梅丸通過(guò)調(diào)控miR-146a對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

楊雪 儲(chǔ)琳 （.泰州市中醫(yī)院藥學(xué)部，泰州 5300；.泰州市中醫(yī)院脾胃病科，泰州 5300）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)腸和直腸慢性炎癥性疾病，多由遺傳、腸道環(huán)境、感染等因素共同作用引起，與大腸黏膜及黏膜下層有關(guān)，病程漫長(zhǎng)，常反復(fù)發(fā)作、難以治愈［1-2］。UC發(fā)病原因尚不明確，其治療主要以西藥控制炎癥為主，雖有一定療效，但易引起較多不良反應(yīng)［3］。近年中醫(yī)治療UC已成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)，效果明顯［4］。烏梅丸是漢代張仲景《傷寒雜病論》中治療厥陰病的方劑，臨床可用于治療上熱下寒所致頭痛、心煩、口干咽燥、腹痛、下痢、嘔吐、手足厥冷等，具有緩肝調(diào)中、清上溫下的作用，臨床研究已證明烏梅丸對(duì)UC有明顯治療效果［5-6］。微小RNA（miRNA）可參與調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，近年研究顯示miRNA與UC發(fā)病有關(guān)，如炎癥性腸?。║C、克羅恩病）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)上調(diào)，與病情嚴(yán)重程度有關(guān)［7］。烏梅丸與miR-146a對(duì)UC大鼠模型的影響未見(jiàn)報(bào)道，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)主要探討烏梅丸通過(guò)調(diào)控miR-146a對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SD雄性大鼠，體質(zhì)量（220.33±20.16） g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0002，本研究經(jīng)泰州市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220012）。

1.1.2 藥物 烏梅丸組成：烏梅16 g、附子6 g、干姜10 g、細(xì)辛6 g、桂枝6 g、蜀椒4 g、黃連16 g、黃柏6 g、人參6 g、當(dāng)歸4 g。藥物經(jīng)水浸泡后，常規(guī)煎煮、過(guò)濾及濃縮。所有藥物均購(gòu)自北京同仁堂有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 選取50只SD大鼠，每組10只，分為正常對(duì)照組（給予10 ml/kg生理鹽水）、模型組（TNBS/乙醇灌腸誘導(dǎo)UC形成）、烏梅丸低、中、高劑量組（灌胃13.3、26.6、53.2 g/kg烏梅丸）。UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將anti-miR-NC、anti-miR-146a模擬物分別轉(zhuǎn)染至UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞，作為anti-miR-NC組、antimiR-146a組；將miR-NC、miR-146a分別轉(zhuǎn)染至UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞，烏梅丸干預(yù)，作為烏梅丸+miR-NC組、烏梅丸+miR-146a組。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 每組取1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，貼壁后每孔添加10 μl CCK-8孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（OD）值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 調(diào)整各組細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，取5 μl Annexin V-FITC加入500 μl細(xì)胞懸液混合，加入5 μl PI，室溫暗室孵育1 h。流式細(xì)胞術(shù)分析染色情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)miR-146a表達(dá) Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，2-ΔΔCt計(jì)算miR-146a相對(duì)表達(dá)。

1.2.5 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞IL-1β和IL-13含量 提取細(xì)胞上清，ELISA試劑盒檢測(cè)IL-1β和IL-13含量，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá) 提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育90 min，ECL發(fā)光液顯影，ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，Quantity One軟件測(cè)定各組蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞存活率顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；烏梅丸低、中、高劑量組細(xì)胞存活率顯著高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表1 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of Wumei Pill on proliferation of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

Survival rate/%96.73±8.11 40.34±6.711）65.45±3.752）72.76±6.362）88.93±9.642）375.775 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.2 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)、Western blot結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；烏梅丸低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats

表2 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表2 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of Wumei Pill on apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P Apoptosis rate/%8.94±0.77 41.76±6.521）30.47±6.732）22.96±5.862）13.28±3.222）279.046 0.000 Bax protein 0.33±0.03 0.90±0.091）0.75±0.072）0.62±0.062）0.53±0.052）152.067 0.000 Bcl-2 protein 0.96±0.09 0.30±0.031）0.55±0.052）0.66±0.062）0.78±0.072）164.083 0.000

2.3 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞IL-1β、IL-13含量的影響 ELISA結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞IL-1β、IL-13含量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；烏梅丸低、中、高劑量組IL-1β、IL-13含量顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞IL-1β、IL-13含量的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats （±s，n=10，ng/L）

表3 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞IL-1β、IL-13含量的影響（±s，n=10，ng/L）Tab.3 Effects of Wumei Pill on IL-1β and IL-13 contents in colon cells of UC rats （±s，n=10，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

IL-13 25.97±7.04 92.46±8.991）63.83±7.862）58.94±5.742）28.75±.752）199.047 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P IL-1β 24.66±3.67 89.23±6.711）68.94±6.942）53.96±3.562）36.73±4.582）185.864 0.000

2.4 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞miR-146a表達(dá)的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞miR-146a表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；烏梅丸低、中、高劑量組miR-146a表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞miR-146a表達(dá)的影響（±s，n=10）Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats （±s，n=10）

表4 烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞miR-146a表達(dá)的影響（±s，n=10）Tab.4 Effects of Wumei Pill on miR-146a expression in colon cells of UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.01.

miR-146a 1.00±0.10 3.27±0.261）2.81±0.232）2.02±0.192）1.54±0.162）198.958 0.000 Groups Control Model Wumei Pill low dose Wumei Pill medium dose Wumei Pill high dose F P

2.5 抑制miR-146a對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響 anti-miR-146a組細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于miR-NC組，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、IL-1β、IL-13含量顯著低于anti-miR-NC組（P＜0.05）。見(jiàn)表5、圖2。

圖2 抑制miR-146a時(shí)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a inhibition

表5 抑制miR-146a對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=10）Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells （±s，n=10）

表5 抑制miR-146a對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=10）Tab.5 Effect of inhibition of miR-146a on proliferation and apoptosis of UC rat colon cells （±s，n=10）

Note：Compared with anti-miR-NC group， 1）P＜0.05.

IL-13/（ng·L-1）89.95±6.14 42.07±4.411）55.001 0.000 Groups anti-miR-NC anti-miR-146a t P Survival rate/%43.96±3.06 91.06±9.141）119.047 0.000 Apoptosis rate/%38.94±5.02 9.05±0.191）94.730 0.000 Bcl-2 protein 0.35±0.04 0.90±0.091）39.005 0.000 Bax protein 0.88±0.08 0.31±0.031）18.037 0.000 IL-1β/（ng·L-1）85.76±7.14 33.45±2.961）47.904 0.000

2.6 過(guò)表達(dá)miR-146a逆轉(zhuǎn)烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響 烏梅丸+miR-146a組細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于烏梅丸+miR-NC組，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)、IL-1β、IL-13含量顯著高于烏梅丸+miR-NC組（P＜0.05）。見(jiàn)表6、圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-146a時(shí)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Apoptosis-related proteins expressions on miR-146a overexpression

表6 過(guò)表達(dá)miR-146a逆轉(zhuǎn)烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=10）Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

表6 過(guò)表達(dá)miR-146a逆轉(zhuǎn)烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響（±s，n=10）Tab.6 Overexpression of miR-146a expression reverses effect of Wumei Pill on proliferation and apoptosis of colon cells in UC rats （±s，n=10）

Note：Compared with Wumei Pill+miR-NC group， 1）P＜0.05.

IL-13/（ng·L-1）38.96±5.16 97.14±8.811）175.550 0.000 Groups Wumei Pill+miR-NC Wumei Pill+miR-146a t P Survival rate/%92.37±7.66 45.06±10.051）269.046 0.000 Apoptosis rate/%10.58±1.35 41.67±5.671）117.885 0.000 Bcl-2 protein 0.88±0.08 0.26±0.021）104.839 0.000 Bax protein 0.38±0.04 0.94±0.091）116.779 0.000 IL-1β/（ng·L-1）43.60±12.36 95.73±8.991）103.447 0.000

3 討論

UC是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為慢性或亞急性腹瀉、黏液膿血便及腹痛等，病因尚未明確，目前認(rèn)為多因素相互作用所致，一般呈慢性病程，為終生復(fù)發(fā)性疾病［8-9］。目前研究普遍認(rèn)為UC是一種多基因靶點(diǎn)參與的疾病，與腸道感染、腸細(xì)胞凋亡、免疫功能、炎癥反應(yīng)等相關(guān)［10］。腸細(xì)胞凋亡與UC病程中腸黏膜損傷有關(guān)，Bcl-2和Bax兩種基因是細(xì)胞凋亡常見(jiàn)標(biāo)志蛋白，可參與調(diào)節(jié)線粒體途徑凋亡［11］。UC發(fā)病時(shí)可促進(jìn)腸細(xì)胞釋放大量炎癥因子，如IL-1β、IL-13、TNF-α等，而IL-1β、IL-13是白細(xì)胞家族成員，在UC患者血清內(nèi)高表達(dá)，與UC嚴(yán)重程度密切相關(guān)［12］。本研究通過(guò)構(gòu)建UC大鼠模型發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)腸細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，并釋放大量IL-1β、IL-13，提示UC模型構(gòu)建成功。

近年中醫(yī)藥治療UC已表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如芍藥內(nèi)酯苷能抑制UC大鼠模型炎癥反應(yīng)，并減輕結(jié)腸組織氧化反應(yīng)及病變［13］；雷公藤多苷可減輕UC大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)［14］。烏梅丸主要由烏梅、附子、干姜、細(xì)辛、桂枝等組成，始載于《傷寒雜病論》，臨床用于UC治療已獲得認(rèn)可，可通過(guò)抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡及炎癥因子釋放等發(fā)揮UC治療效果［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)烏梅丸可通過(guò)抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡對(duì)UC起治療作用［17］。烏梅丸可抑制UC結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡起治療作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)烏梅丸處理UC大鼠明顯提高細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)，降低凋亡率、Bax蛋白表達(dá)，減少I(mǎi)L-1β、IL-13釋放，提示烏梅丸可明顯減輕UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，與文獻(xiàn)［17-18］結(jié)果相似。

miR-146a是miRNA，與UC發(fā)病密切相關(guān)，如雷公藤多苷片通過(guò)調(diào)控miR-146a抑制大鼠UC［19］。miR-146a可通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路減少炎癥因子釋放緩解UC癥狀［20］。安腸湯通過(guò)調(diào)控miR-146a/IRAK-1軸減輕UC大鼠腸黏膜炎癥反應(yīng)。表明miR-146a有望成為UC的潛在標(biāo)志物。本研究顯示UC模型組細(xì)胞miR-146a表達(dá)增加，烏梅丸處理后miR-146a表達(dá)降低，抑制miR-146a細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率、IL-1β、IL-13含量顯著降低。過(guò)表達(dá)miR-146a逆轉(zhuǎn)烏梅丸對(duì)UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖和凋亡的影響，說(shuō)明烏梅丸通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)抑制UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡。

綜上，烏梅丸通過(guò)上調(diào)miR-146a表達(dá)降低UC大鼠結(jié)腸細(xì)胞凋亡，為腸炎治療提供了依據(jù)。