升麻素通過NF-κB通路對支氣管上皮細(xì)胞過敏性炎癥反應(yīng)的抑制作用

陳俊杰 楊道文 （.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009；.中日友好醫(yī)院中醫(yī)肺病一部，北京 0009）

哮喘是一種常見的以氣道炎癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多、黏液過度分泌、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性為主要特征的慢性炎癥性疾病，其患病率在全球范圍內(nèi)迅速上升［1-2］。哮喘作為一種復(fù)雜的疾病，其發(fā)病機(jī)制與遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用有關(guān)［3］。過敏性哮喘是最常見的哮喘表型，常見過敏原包括塵螨、花粉、香料等［4-5］。皮質(zhì)類固醇和β2受體激動劑的治療常伴有一系列不良反應(yīng)并加重病情［6］。因此，開發(fā)新的治療藥物對于延緩哮喘進(jìn)展、避免哮喘發(fā)作有重要意義。我國傳統(tǒng)中藥材防風(fēng)具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理活性。YAO等［7］研究提示，黃芪防風(fēng)可抑制過敏性哮喘氣道重塑。同樣，防風(fēng)的主要成分升麻素（圖1）在過敏性炎癥中發(fā)揮抑制作用［8-9］。然而，升麻素在過敏性哮喘中的作用機(jī)制還未可知。

圖1 升麻素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of cimifugin

核因子-kappaB （nuclear factor-kappaB，NF-κB）是應(yīng)對損傷或感染免疫和炎癥過程的主要調(diào)節(jié)因子［10］。有研究表明，NF-κB通路在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［11-12］。然而，關(guān)于升麻素與NF-κB信號通路在哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)系探究卻鮮有報道。鑒于此，本研究重點(diǎn)探討升麻素對過敏性哮喘體外模型的具體影響并對其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B由美國菌種保藏中心提供；DMEM培養(yǎng)基（11965092）、胎牛血清（FBS；10099141C）購自美國Gibco公司；屋塵螨（house dust mite，HDM；XPB82D3A2.5）購自北京博蕾德生物科技有限公司；升麻素（B21156）和地塞米松（dexamethasone，Dex；B25793）購自上海源葉生物科技有限公司；MTT試劑（C0009S）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑（KGA-701）購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA試劑盒（PC0020）、RIPA裂解液（R0010）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源Bcl-2（B cell lymphoma-2；ab32124）、Bax（Bcl-2-associated X；ab32503）、cleaved caspase-3（ab32042）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS；ab178945）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2；ab179800）、閉鎖小帶蛋白（zonula occludens-1，ZO-1；ab276131）、閉合蛋白（Occludin；ab216327）、緊密連接蛋白-4（Claudin-4；ab210796）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα；ab32518）、NF-κB p65（ab207297）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65；ab239882）、GAPDH抗體（ab9485）、山羊抗兔IgG-FITC（ab6717）、Alexa Fluor?594偶聯(lián)的二抗（ab150080）、IL-6（ab178013）、IL-1β（ab214025）和TNF-α試劑盒（ab181421）均購自美國Abcam；化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（36208ES 60）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell小室購自美國BD公司、FITC標(biāo)記葡聚糖4 kDa（MS0901-0050MG；上海懋康生物科技有限公司）；分光光度計（上海美谷分子儀器有限公司）；伏特歐姆計（美國默克公司）；Varioskan熒光酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.1.2 實驗細(xì)胞株 人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下進(jìn)行孵育。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 分別用濃度為0.01、0.1、1、10 μmol/L的升麻素處理長滿單層的BEAS-2B細(xì)胞24 h，并設(shè)不加升麻素的空白對照組（Control）以及升麻素0.01、0.1、1和10 μmol/L組檢測升麻素對BEAS-2B細(xì)胞的最大無毒濃度。依據(jù)文獻(xiàn)對細(xì)胞分別進(jìn)行不同濃度升麻素（0.01、0.1、1 μmol/L）或1 μmol/L Dex處理［13-14］。利用HDM建立過敏性哮喘體外模型［15］。將細(xì)胞暴露于300 ng/ml HDM中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為空白對照組（Control）、HDM組、HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組，檢測藥物對暴露在HDM環(huán)境中BEAS-2B細(xì)胞活力的影響。實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 將BEAS-2B細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)（2×103個/孔）。經(jīng)升麻素或Dex處理后，將細(xì)胞暴露于HDM下，每孔加入10 μl 5%MTT試劑，37 ℃下孵育4 h。分光光度計檢測570 nm處吸光度值，每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.3 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 經(jīng)升麻素或1 μmol/L Dex處理后，將暴露于HDM的BEAS-2B細(xì)胞接種于6孔板，利用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對細(xì)胞進(jìn)行固定和透化處理，添加TUNEL檢測液，嚴(yán)格按試劑盒說明書實驗步驟37 ℃避光反應(yīng)45 min，采用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色。熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察細(xì)胞凋亡情況。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot 采用BCA試劑盒檢測RIPA裂解液提取的蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離等量蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并在5%脫脂牛奶中室溫封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜后，洗膜后再用HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗于室溫下孵育。加入化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒對蛋白條帶進(jìn)行顯影，利用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）記錄灰度值，分析Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3/pro-caspase 3、ZO-1、Occludin、Claudin-4及iNOS、COX-2蛋白濃度。

1.2.5 ELISA檢測炎癥因子水平 向BEAS-2B細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，3 500 r/min離心5 min，取上清液，按照ELISA劑盒說明書檢測上清液中BEAS-2B細(xì)胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.2.6 TEER檢測上皮完整性 依據(jù)文獻(xiàn)［14］以3×105個/孔將細(xì)胞接種于Transwell室，并在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在聚碳酯膜上生長、分化，形成連續(xù)的單細(xì)胞層。培養(yǎng)細(xì)胞4～6 d至完全融合后，使用伏特歐姆計測量TEER值，確定細(xì)胞單層的緊密與完整性。當(dāng)測定的TEER值達(dá)到穩(wěn)定后3 d或4 d，按照1.2.1實驗分組處理細(xì)胞，24 h后，測量TEER值。

1.2.7 FD-4評估細(xì)胞單層膜的滲透性 依據(jù)文獻(xiàn)［14］將細(xì)胞以3×105個/孔接種于Transwell室內(nèi)，形成單層膜細(xì)胞后，將10 μl FD-4（10 mg/ml）添加到上室，避光孵育2 h后，使用Varioskan熒光酶標(biāo)儀檢測Transwell底層小室熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為520 nm）。

1.2.8 免疫熒光檢測NF-κB核易位 利用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100分別對處理后的BEAS-2B細(xì)胞進(jìn)行固定和透化處理。經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉后，25 ℃下與兔源NF-κB抗體孵育過夜，并與Alexa Fluor?594偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h。PBST洗滌后，DAPI于25 ℃下對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，并通過熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，實驗結(jié)果表示為±s，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 升麻素增強(qiáng)HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞活力與對照組相比，0.01、0.1、1 μmol/L升麻素對細(xì)胞活性無顯著影響；升麻素處理濃度為10 μmol/L時，細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.05，圖2A）。由此，選擇0.01、0.1、1 μmol/L無毒濃度升麻素進(jìn)行后續(xù)實驗。為驗證升麻素對過敏性哮喘的影響，BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)HDM誘導(dǎo)后，成功建立過敏性哮喘體外模型。與對照組相比，HDM暴露顯著降低細(xì)胞活力（P＜0.001）；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組細(xì)胞活力顯著提高，且呈濃度依賴性（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖2B）。

圖2 不同濃度升麻素對BEAS-2B細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of cimifugin on viability of BEAS-2B cells

2.2 升麻素抑制HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡與對照組相比，HDM暴露導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率顯著升高；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著減少，且呈濃度依賴性（P＜0.001，圖3A）。此外，與對照組相比，HDM組抗凋亡Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡Bax、Cleaved-caspase 3/pro-caspase 3表達(dá)上調(diào)（P＜0.001）；HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組較HDM組Bcl-2表達(dá)呈濃度依賴性增加，Bax、Cleaved-caspase 3/pro-caspase 3表達(dá)呈濃度依賴性下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖3B）。

圖3 升麻素降低HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞凋亡Fig.3 Cimifugin reduced HDM-induced apoptosis of BEAS-2B cells

2.3 升麻素抑制HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞分泌炎癥因子 與對照組相比，暴露于HDM的BEAS-2B細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著提高（P＜0.001）；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組IL-6、IL-1β、TNF-α水平均呈濃度依賴性下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖4A）。與對照組相比，HDM組iNOS、COX-2蛋白水平明顯升高（P＜0.001）；HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組較HDM組iNOS、COX-2蛋白水平顯著降低，且顯示出量效關(guān)系（P＜0.01或P＜0.001，圖4B）。

圖4 升麻素抑制HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎癥反應(yīng)Fig.4 Cimifugin suppressed HDM-induced inflammatory response in BEAS-2B cells

2.4 升麻素對HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞屏障保護(hù)作用 與對照組比較，HDM刺激導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞TEER值顯著降低，F(xiàn)D-40通量升高（P＜0.001），提示HDM誘導(dǎo)單層BEAS-2B細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞屏障功能受損；與HDM組比較，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組TEER值濃度依賴性升高，F(xiàn)D-40通量濃度依賴性減少（P＜0.001，圖5A、B）。與對照組比較，HDM組中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表達(dá)顯著降低（P＜0.001）；經(jīng)不同濃度（0.01、0.1、1 μmol/L）升麻素或1 μmol/L Dex處理后，ZO-1、Occludin、Claudin-4蛋白表達(dá)呈濃度依賴性升高（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖5C、D）。

圖5 升麻素對HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞的屏障保護(hù)作用Fig.5 Protective role of cimifugin in epithelial barrier of HDM-induced BEAS-2B cells

2.5 升麻素抑制HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中NFκB及相關(guān)蛋白活化 免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，HDM暴露下NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)含量明顯增加；與HDM組相比，HDM+0.01 μmol/L組、HDM+0.1 μmol/L組、HDM+1 μmol/L組、HDM+Dex組NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的含量顯著減少，并顯示出明顯的量效作用（圖6A）。同樣，升麻素或Dex處理能增加IκBα蛋白表達(dá)，下調(diào)p-NF-κB p65蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001，圖6B）。

圖6 升麻素抑制HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中NF-κB及相關(guān)蛋白活化Fig.6 Cimifugin inhibits HDM-induced activation of NF-κB and related proteins in BEAS-2B cells

3 討論

哮喘是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅患者健康［16-17］。大量研究表明，哮喘發(fā)作期間會引發(fā)炎癥反應(yīng)，釋放促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等［18］。此外，細(xì)胞凋亡也參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展，抑制細(xì)胞凋亡可有效改善哮喘［19］。氣道上皮是抵御外來物質(zhì)，如吸入性過敏原、空氣傳播顆粒的一線宿主屏障，與哮喘發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［20］。氣道上皮屏障的破壞可能導(dǎo)致過敏原致敏風(fēng)險增加，從而引發(fā)過敏性哮喘的慢性炎癥［21］。HDM是一種普遍存在的氣源性過敏原，是哮喘患者過敏原的主要來源［22］。HDM暴露和氣道上皮細(xì)胞的相互作用可直接導(dǎo)致氣道上皮功能障礙［23］。因此，本研究利用HDM對人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B進(jìn)行誘導(dǎo)，構(gòu)建過敏性哮喘體外模型。

升麻素是中藥防風(fēng)中色原酮的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有抗腫瘤、抗炎等作用［24］。研究報道，升麻素可通過恢復(fù)上皮屏障緊密連接從而改善過敏性炎癥進(jìn)展［8-9］。本研究利用不同濃度升麻素處理BEAS-2B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)中低濃度（0.01、0.1、1 μmol/L）升麻素對BEAS-2B細(xì)胞活性無顯著影響，而高濃度（10 μmol/L）升麻素可顯著降低細(xì)胞活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，暴露于HDM的BEAS-2B細(xì)胞活性顯著下降，凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，抑癌基因Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)原癌基因Bax、Cleaved caspase-3/pro-caspase 3蛋白表達(dá)上調(diào)；不同濃度升麻素可提高HDM誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax、cleaved caspase-3/pro-caspase 3蛋白表達(dá)。HDM刺激可導(dǎo)致實驗細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加，并促進(jìn)炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達(dá)，這與CAI等［25］的研究結(jié)果一致；升麻素處理可降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平并減少iNOS、COX-2蛋白表達(dá)。研究報道HDM可直接破壞氣道上皮細(xì)胞之間的緊密連接以及屏障結(jié)構(gòu)［26］。本研究同樣檢測上皮完整性、細(xì)胞單層膜滲透性及緊密連接蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDM暴露可導(dǎo)致細(xì)胞TEER值顯著下降，F(xiàn)D-40通量升高，同時緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-4表達(dá)下調(diào)，提示HDM能誘導(dǎo)單層BEAS-2B細(xì)胞通透性增加，屏障功能紊亂，并破壞上皮細(xì)胞間的緊密連接；經(jīng)升麻素處理后，TEER值上升，F(xiàn)D-40通量減少，ZO-1、Occludin、Claudin-4蛋白表達(dá)增加，且呈濃度依賴性，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［8-9］。

NF-κB信號傳導(dǎo)通過協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)參與哮喘的發(fā)生發(fā)展［27-28］。此外，升麻素可通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)，從而抑制疾病中的炎癥反應(yīng)［13，29-30］。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，HDM暴露能誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞NFκB發(fā)生核易位，IκBα蛋白表達(dá)減少，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)增加；升麻素處理后能明顯抑制細(xì)胞NFκB核易位，并濃度依賴性地降低p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，促進(jìn)IκBα蛋白表達(dá)。

綜上所述，升麻素可減輕HDM誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞過敏性炎癥損傷并保護(hù)細(xì)胞屏障，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。