美沙拉秦介導(dǎo)TGF-β1/Smad信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥及凋亡

侯靜 劉加寧 馮如 陸偉 王云 蘇峰 （.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院消化內(nèi)科，宿遷 3800；.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院藥學(xué)部，宿遷 3800）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一類慢性炎癥性復(fù)發(fā)性疾病，表現(xiàn)為結(jié)腸、直腸黏膜及黏膜下層持續(xù)性、融合性炎癥反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和便血，嚴(yán)重者可發(fā)展為結(jié)直腸癌［1］。UC發(fā)病較為復(fù)雜，主要與地域、遺傳、環(huán)境、飲食和自身免疫等多種因素相關(guān)，隨著社會經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，全球UC發(fā)病率持續(xù)上升，且研究發(fā)現(xiàn)UC可能參與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚［2-3］。目前UC主要治療手段包括藥物治療和手術(shù)治療，治療初期通常選擇藥物治療，而美沙拉秦（Mesalazine，MS）腸溶片是常見UC治療西藥，主要成分為5-氨基水楊酸，具有非甾體類抗炎藥效果［4］；重癥UC患者則選擇手術(shù)治療，過早手術(shù)患者會失去保留結(jié)腸的機(jī)會，過晚又會錯過最佳手術(shù)時間。MS治療UC具有顯著效果，但MS預(yù)防UC的臨床證據(jù)尚需實驗研究證實，且MS治療UC的作用機(jī)制尚未闡明。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6及可溶性白細(xì)胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）作為被廣泛研究的炎癥因子，可促進(jìn)白細(xì)胞活化，使腸道黏膜炎癥反應(yīng)持續(xù)［5-7］。MAVROPOULOU等［8］證明克羅恩?。–rohn's disease，CD）患者血清IL-6水平和UC患者sIL-2R水平可作為非侵入性生物標(biāo)志物識別疾病活動狀態(tài)。

多項研究表明結(jié)腸上皮細(xì)胞與UC發(fā)生相關(guān)，其中增殖、凋亡與結(jié)腸生長息息相關(guān)［9］。TGF-β1/Smad信號通路在UC進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，且該通路可作為UC治療藥物靶點［10-11］。MS是否通過介導(dǎo)TGF-β1/Smad通路調(diào)節(jié)UC的報道較少。因此本研究為探求MS介導(dǎo)的可能機(jī)制，構(gòu)建體外UC細(xì)胞模型，研究MS對LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞生長、增殖和凋亡的影響，明確MS對炎癥因子TNF-α、IL-6和sIL-2R表達(dá)及TGF-β1/Smad信號通路的調(diào)控作用，從分子角度說明MS對UC的治療作用，為MS臨床治療UC提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心；LPS、MS（純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清、DMEM-H培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Hoechst 33258染色試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；ELISA試劑盒（北京貝博生物科技有限公司）；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白試劑盒（英國Abcam公司）；鼠抗人TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3和β-actin抗體（一抗）、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）（美國CST公司）；MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；OI 1000型凝膠成像系統(tǒng)（廣州光儀生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 KEGG信號通路富集分析 使用KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/pathway/）對炎癥性腸病細(xì)胞相關(guān)通路進(jìn)行分析，物種選擇“human”。

1.2.2 人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460培養(yǎng) 人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用DMEM-H培養(yǎng)基（補(bǔ)加10%胎牛血清），待細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上時進(jìn)行傳代，取第4代對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞分組與給藥 細(xì)胞分為Con組、LPS組、MS組（0.1、0.2、0.4 mg/L MS）和inhibitor組，Con組細(xì)胞不加藥物干預(yù)，LPS組加入1 mg/L LPS誘導(dǎo)24 h構(gòu)建UC細(xì)胞模型，MS組分別采用0.1、0.2、0.4 mg/L MS干預(yù)LPS組細(xì)胞，inhibitor組在0.2 mg/L MS組基礎(chǔ)上添加10 μmol/L LY2109761進(jìn)行干預(yù)，每組3個重復(fù)。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將各組藥物干預(yù)24 h的NCM-460細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照記錄。

1.2.5 EdU法測定NCM-460細(xì)胞增殖率 取各組干預(yù)48 h的細(xì)胞進(jìn)行EdU處理，去除培養(yǎng)液，0.5 ml 4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.5 ml 3%BSA洗滌3次；0.5 ml 0.3%TritonX-100室溫去除BSA 10 min，BSA洗滌3次；12孔板中每孔加200 μl Click反應(yīng)液（現(xiàn)配現(xiàn)用），室溫避光孵育30 min，3%BSA洗滌3次去除Click反應(yīng)液；每孔加入0.5 ml Hoechst，室溫避光孵育10 min；3%BSA洗滌3次去除Hoechst；裝片，熒光顯微鏡拍照，Image J軟件處理圖片。以EdU陽性染色細(xì)胞（紅色）占總細(xì)胞（藍(lán)色）的百分比表示細(xì)胞增殖率。

1.2.6 Hoechst 33258染色測定NCM-460細(xì)胞凋亡 PBS緩慢清洗藥物干預(yù)24 h的NCM-460細(xì)胞2次，5 min/次；4%多聚甲醛（現(xiàn)用現(xiàn)配） 4 ℃固定10 min；PBS洗滌3次（5 min/次），5 mg/L Hoechst 33258染色液染色10 min，PBS清洗3次（5 min/次），封固后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，隨機(jī)選擇3個視野拍照。

1.2.7 ELISA試劑盒檢測NCM-460細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子水平 收集各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞上清，分別按照TNF-α、IL-6和sIL-2R ELISA試劑盒說明書操作，測定炎癥因子TNF-α、IL-6和sIL-2R釋放量。細(xì)胞培養(yǎng)液離心收集上清，分別將100 μl標(biāo)準(zhǔn)品及待測上清加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育2 h，棄上清；加100 μl生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液37 ℃孵育1 h；洗滌后用90 μl底物溶液37 ℃孵育10 min；加入50 μl終止液，5 min內(nèi)測量各孔450 nm處OD值。

1.2.8 Western blot測定NCM-460細(xì)胞中TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá) 干預(yù)24 h后，收集各組細(xì)胞于RIPA液冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清進(jìn)行蛋白變性，制膠，上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，100 mA恒流轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，參照抗體說明加入一定比例稀釋的一抗（TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、p-Smad2、p-Smad3和β-actin），再加堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗稀釋液，顯影，一抗孵育2～3 h，二抗孵育2 h，分別用TBST洗滌3次，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，蛋白相對表達(dá)量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白（β-actin）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GraphPad Prism 8.0軟件作圖，Image J軟件計算EdU增殖細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)和蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1/Smad通路及炎癥因子選擇 使用KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫對人炎癥性腸病細(xì)胞進(jìn)行通路富集分析（圖1），TGF-β可間接抑制炎癥性腸病、參與CD發(fā)生，UC屬于炎癥性腸病的一種，因此選擇TGF-β通路進(jìn)行研究。人炎癥性腸病細(xì)胞中TGF-β通路直接調(diào)控下游Smad2/3基因，通過磷酸化發(fā)揮作用，Smad7可抑制Smad2/3蛋白表達(dá)（圖2），因此選擇TGF-β及下游Smad2/3、Smad7基因進(jìn)行研究。炎癥因子TNF-α和IL-6與炎癥性腸病發(fā)生相關(guān)（圖1），且MAVROPOULOU等［8］證明UC患者sIL-2R水平可作為非侵入性生物標(biāo)志物識別疾病活動狀態(tài)，所以本研究選擇IL-6、TNF-α和sIL-2R炎癥因子進(jìn)行實驗。

圖1 人類炎癥性腸病相關(guān)信號通路圖Fig.1 Signaling pathways associated with human inflammatory bowel disease

圖2 人炎癥性腸病中TGF-β信號通路圖Fig.2 TGF-β signaling pathway in human inflammatory bowel disease

2.2 MS對人結(jié)腸上皮NCM-460細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 人結(jié)腸上皮NCM-460細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞生長受到抑制；0.1、0.2、0.4 mg/L MS處理LPS組細(xì)胞24 h后，細(xì)胞生長抑制能力下降，輪廓逐漸清晰，貼壁能力增強(qiáng)，Inhibitor組細(xì)胞生長趨勢和形態(tài)變化與MS組細(xì)胞相同（圖3）。

圖3 倒置顯微鏡觀察NCM-460細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×20）Fig.3 Morphological changes of NCM-460 cells observed by inverted microscope （×20）

2.3 MS促進(jìn)NCM-460細(xì)胞增殖 LPS處理24 h后，EdU陽性細(xì)胞數(shù)比Con組明顯減少，提示LPS處理降低NCM-460細(xì)胞增殖率（圖4）；與LPS組相比，隨著MS濃度增加，細(xì)胞增殖率逐漸升高，其中0.2和0.4 mg/L MS增加顯著（P＜0.05）；與0.2 mg/L MS組相比，抑制劑進(jìn)一步提升細(xì)胞增殖率（P＜0.05）。

圖4 EdU檢測NCM-460細(xì)胞增殖情況（×20）Fig.4 NCM-460 cell proliferation detected by EdU assay （×20）

2.4 MS抑制NCM-460細(xì)胞的凋亡 正常細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，形態(tài)呈圓形，凋亡細(xì)胞核呈亮藍(lán)色。LPS處理24 h后，LPS組細(xì)胞與Con組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加；與LPS組相比，MS組細(xì)胞凋亡數(shù)隨著處理濃度增加逐漸減少，而Inhibitor組細(xì)胞凋亡數(shù)進(jìn)一步減少（圖5）。

圖5 熒光倒置顯微鏡下觀察NCM-460細(xì)胞凋亡（×40）Fig.5 NCM-460 cells apoptosis observed under fluorescent inverted microscope （×40）

2.5 MS抑制NCM-460細(xì)胞炎癥 ELISA檢測不同處理組NCM-460細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和sIL-2R表達(dá)（圖6），與Con組相比，LPS組細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6及sIL-2R表達(dá)均顯著升高；MS處理后，炎癥因子水平逐漸降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）；與0.2 mg/L MS組相比，抑制劑進(jìn)一步降低炎癥因子表達(dá)（P＜0.05）。

圖6 ELISA檢測NCM-460細(xì)胞炎癥因子釋放量Fig.6 Release of inflammatory factors from NCM-460 cells by ELISA

2.6 MS抑制NCM-460細(xì)胞TGF-β1/Smad通路活化 Western blot測定不同處理組NCM-460細(xì)胞TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7表達(dá)（圖7），各組Smad2和Smad3蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。與Con組相比，LPS組細(xì)胞Smad7表達(dá)顯著減少，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)顯著增加；與LPS組相比，MS組細(xì)胞Smad7表達(dá)顯著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與0.2 mg/L MS組相比，Inhibitor組Smad7表達(dá)顯著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)顯著降低。

圖7 Western blot檢測NCM-460細(xì)胞TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 TGF-β1/Smad pathway-related proteins expressions in NCM-460 cells detected by Western blot

3 討論

UC是一種常見的消化道疾病，病程較長，極難治愈，具有易復(fù)發(fā)、治療病程長等特點，且極易惡化發(fā)展為結(jié)直腸癌［12］。最近報道指出UC在我國乃至全世界發(fā)病率逐年上升，因此，對UC發(fā)病機(jī)制的研究及治療方法的探討成為醫(yī)療衛(wèi)生界重要課題。多數(shù)研究者認(rèn)為該病主要由促炎因子（TNF-α、IL-6等）以及抗炎因子不平衡導(dǎo)致，臨床一般選用藥物消除炎癥反應(yīng)，而MS作為治療UC的常見藥物，能有效抑制炎癥介質(zhì)白三烯形成、腸壁組織炎癥反應(yīng)和機(jī)體腸道病菌炎癥遞質(zhì)，清除氧自由基，改善機(jī)體或血小板活化因子活性狀況，從而改善UC患者臨床癥狀［13-15］。為探求MS介導(dǎo)的可能新機(jī)制，本研究探討其對結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460功能、炎癥及TGF-β1/Smad信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)MS可能通過降低TGF-β1/Smad通路活性抑制其凋亡和炎癥。

研究表明LPS能夠誘發(fā)促炎因子表達(dá)從而引發(fā)炎癥。李迪等［16］利用LPS誘導(dǎo)的小鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞后IL-6釋放量顯著增加，而郝浩揚等［17］發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺組織中TNF-α顯著增加，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM-460增殖受到抑制，凋亡增加，且炎癥因子TNF-α、IL-6、sIL-2R水平升高。祝斌等［18］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠UC模型中，MS可能通過T細(xì)胞亞群發(fā)揮抗炎及治療UC作用；耿艷麗等［19］研究表明MS治療后UC患者癥狀顯著減輕，且體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著低于治療前，證實了MS對UC的治療作用。本研究利用不同濃度MS處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著MS濃度增加，NCM-460細(xì)胞增殖率升高，細(xì)胞凋亡率降低，且TNF-α、IL-6、sIL-2R表達(dá)呈濃度依賴性降低，說明MS能夠保護(hù)NCM-460細(xì)胞免受LPS傷害，促進(jìn)NCM-460細(xì)胞生長。

TGF-β1/Smad信號通路能夠參與機(jī)體發(fā)育過程中的細(xì)胞生長、分化、凋亡和細(xì)胞動態(tài)平衡過程，且與炎癥性腸病相關(guān)［20-21］。陶鵬宇等［22］研究表明TGFβ1/Smad信號通路可能是六味地黃丸減輕糖尿病腎病炎癥損傷的機(jī)制之一。于芝等［23］研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定通過抑制TGF-β1/Smad信號通路激活減輕炎癥對人軟骨細(xì)胞的損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)明顯下降，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)顯著增加，表明LPS組細(xì)胞TGF-β1/Smad信號通路被激活；而MS組和抑制組細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)顯著升高，而TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達(dá)顯著降低，說明MS可通過抑制TGF-β1/Smad信號通路發(fā)揮其抗炎作用。

綜上，MS通過抑制TGF-β1/Smad信號通路從而減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)和促凋亡作用，抑制UC細(xì)胞增殖，促進(jìn)NCM-460細(xì)胞生長。