轉錄因子SP1調控MAP3K1表達影響糖尿病視網膜病變細胞凋亡和炎癥反應

黃丹 鄧芳祝 謝功澤 李巧蓮

（1.郴州市第四人民醫(yī)院眼科，郴州 423000；2.郴州市第一人民醫(yī)院北院眼科，郴州 423000）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病主要并發(fā)癥，糖尿病仍是工作年齡人群視力喪失的主要原因［1-2］。研究表明糖尿病誘發(fā)的高血糖會增加冠心病、卒中和糖尿病微血管疾病等風險［3］。DR血管損傷的特征為血液-視網膜屏障破壞、毛細血管基底膜增厚和內皮細胞損傷引起的視網膜血流自動調節(jié)功能失調［4-5］。因此，人類視網膜微血管內皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，hRMECs）功能障礙的確切機制有待闡明，以便為DR患者制定有效治療策略。

特異性蛋白1（SP1）是一種普遍表達的核轉錄因子，屬于C2H2型鋅指蛋白家族成員，介導基因表達并響應各種細胞外和細胞內信號調節(jié)基因表達，包括參與細胞生長及分化、細胞凋亡、纖維化和炎癥［6］。敲低SP1可提高視網膜色素上皮細胞活力，降低高血糖或低氧條件下增加的細胞通透性和限制細胞遷移［7］。高血糖增加SP1在視網膜微血管中與MALAT1啟動子的結合以提升lncRNA MALAT1水平，lncRNA MALAT1通常與炎癥、血管生成和視網膜神經變性有關，在DR中發(fā)揮重要作用［8］。研究報道，DR中MAP3K1表達上調，激活NF-κB信號通路p65磷酸化，加劇視網膜微血管內皮細胞凋亡，加劇促炎因子釋放［9］。干擾MAP3K1表達可抑制細胞凋亡［10］。因此，本實驗旨在研究SP1對DR細胞凋亡和炎癥反應的影響及其分子機制是否與MAP3K1有關。

1 材料與方法

1.1 材料 hRMECs購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；內皮細胞培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司；si-NC、si-SP1、oe-NC和oe-MAP3K1均購自上海吉瑪公司；LipofectamineTM2000購自北京科展生物科技有限公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、RT-qPCR 試劑盒購自日本TaKaRa公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher scientific公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自上海酶聯生物公司；Anti-IgG和Anti-SP1購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) hRMECs在含10%胎牛血清的內皮細胞培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2、適宜濕度下培養(yǎng)，每周更新培養(yǎng)基2～3次。hRMECs分為高葡萄糖（HG）組和正常葡萄糖（Control）組。HG組用30 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)，Control組用5 mmol/L D-葡萄糖處理，均在37 ℃培養(yǎng)48 h（5%CO2）。

1.2.2 細胞轉染 HG組hRMECs使用LipofectamineTM2000試劑盒轉染或共轉染si-NC、si-SP1或oe-NC、oe-MAP3K1，將細胞分為si-NC組、si-SP1組、si-SP1+oe-NC組和si-SP1+oe-MAP3K1組，所有操作按照試劑盒說明書進行。轉染完成48 h后收集細胞，RT-qPCR檢測細胞mRNA表達，以確定是否轉染成功。

1.2.3 RT-qPCR檢測SP1和MAP3K1表達 TRIzol試劑提取總RNA，將其進行純化定量，逆轉錄試劑盒合成cDNA。參照RT-qPCR試劑盒操作步驟進行擴增，檢測SP1和MAP3K1表達。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt分析其表達。SP1正向引物：5'-ACGCTTCACACGTTCGGATGAG-3'，反向引物：5'-TGACAGGTGGTCACTCCTCATG-3'；MAP3K1正向引物：5'-CCAGACCAGTATCTCAGGAGATG-3'，反向引物：5'-CCGCTAAACTGTGGCAAGGAGT-3'；GAPDH正向引物：5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，反向引物：5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染和HG共處理48 h后，收集hRMECs。根據制造商說明，使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。室溫下用Annexin V-FITC黑暗培養(yǎng)20 min，加入碘化丙啶（PI），10 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 ELISA檢測細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量各組細胞4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清。參照說明書，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.2.6 ChIP-qPCR 穩(wěn)定生長的hRMECs中加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，超聲處理2 h，將DNA剪成0.2～1.0 kb片段。4 ℃下13 000 r/min離心5 min收集上清。分別用陰性對照抗體Anti-IgG和目的蛋白特異性抗體Anti-SP1對細胞裂解物進行免疫沉淀過夜。qPCR分析沉淀物對MAP3K1啟動子的富集能力。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件分析數據，數據以±s表示。兩組比較使用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達上調 與Control組相比較，HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達均升高（P＜0.05，表1）。

表1 Control組和HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of SP1 and MAP3K1 in control group and HG-treated hRMECs （±s，n=9）

表1 Control組和HG處理的hRMECs中SP1和MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.1 Expressions of SP1 and MAP3K1 in control group and HG-treated hRMECs （±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

MAP3K1 1.00±0.08 2.17±0.261）20.54 0.000 Groups Control HG t P SP1 1.00±0.06 1.89±0.211）16.79 0.000

2.2 敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs凋亡 在HG誘導的hRMECs中使用干擾技術抑制SP1表達，細胞凋亡能力檢測顯示，與Control組相比，HG組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HG組相比，HG+si-NC組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與HG+si-NC組相比，HG+si-SP1組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，圖1）。表明敲低SP1可顯著抑制HG誘導的hRMECs凋亡。

圖1 各組細胞凋亡率比較Fig.1 Comparison of cell apoptosis rate in each group

2.3 敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs炎癥反應檢測敲低SP1的HG誘導的hRMECs中炎癥反應，與Control組相比，HG組細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達明顯增加（P＜0.05）；與HG組相比，HG+si-NC組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與HG+si-NC組相比，HG+si-SP1組炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯減少（P＜0.05，表2）。表明敲低SP1可抑制HG誘導的hRMECs炎癥反應。

表2 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents of cells in each group （±s，n=9）

表2 各組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s，n=9）Tab.2 Comparison of TNF-α，IL-1β and IL-6 contents of cells in each group （±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with HG+si-NC group，2）P＜0.05.

IL-6 48.38±3.67 132.55±10.831）137.91±9.74 75.68±6.162）Groups Control HG HG+si-NC HG+si-SP1 TNF-α 35.76±2.87 162.35±12.191）168.43±14.77 69.51±5.252）IL-1β 17.63±1.38 68.28±5.141）72.81±6.14 35.46±2.742）

2.4 抑制SP1降低MAP3K1表達 JASPAR生物信息學網站分析顯示，SP1與MAP3K1啟動子存在結合位點（附圖1，www.immune99.com）。為確定SP1與MAP3K1的啟動子序列能夠結合，ChIP-qPCR實驗發(fā)現，在hRMECs中使用SP1特異性抗體沉淀的復合物中MAP3K1富集水平明顯高于Anti-IgG（P＜0.05，表3），抑制SP1表達后Anti-SP1對MAP3K1的富集水平明顯降低（P＜0.05，表4）。與HG+si-NC組相比，抑制SP1表達后MAP3K1表達明顯降低（P＜0.05，表5）。

表3 Anti-IgG和Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.3 Enrichment ability of Anti-IgG and Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

表3 Anti-IgG和Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.3 Enrichment ability of Anti-IgG and Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

Note：Compared with Anti-IgG group， 1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter 1.00±0.14 8.39±0.631）35.83 0.000 Groups Anti-IgG Anti-SP1 t P

表4 Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.4 Enrichment ability of Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

表4 Anti-SP1對MAP3K1啟動子序列的富集能力（±s，n=9）Tab.4 Enrichment ability of Anti-SP1 for MAP3K1 promoter sequences （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-NC group，1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter Groups 1.00±0.07 0.38±0.031）17.10 0.000 HG+si-NC HG+si-SP1 tP

表5 SP1敲低前后hRMECs中MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.5 MAP3K1 expression in hRMECs before and after SP1 knockdown （±s，n=9）

表5 SP1敲低前后hRMECs中MAP3K1表達（±s，n=9）Tab.5 MAP3K1 expression in hRMECs before and after SP1 knockdown （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-NC group，1）P＜0.05.

MAP3K1 promoter Groups 1.00±0.11 0.57±0.041）14.51 0.000 HG+si-NC HG+si-SP1 t P

2.5 過表達MAP3K1逆轉si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用 在敲低SP1抑制HG誘導的hRMECs中進一步過表達MAP3K1，與HG+si-SP1+oe-NC相比，HG+si-SP1+oe-MAP3K1組MAP3K1表達升高，細胞凋亡率升高，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量增加（P＜0.05，圖2、表6）。表明SP1通過調控MAP3K1影響HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應。

圖2 細胞凋亡率比較Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate

表6 干擾MAP3K1表達逆轉si-SP1對hRMECs的作用（±s，n=9）Tab.6 Interference with MAP3K1 expression reverses effect of si-SP1 on hRMECs （±s，n=9）

表6 干擾MAP3K1表達逆轉si-SP1對hRMECs的作用（±s，n=9）Tab.6 Interference with MAP3K1 expression reverses effect of si-SP1 on hRMECs （±s，n=9）

Note：Compared with HG+si-SP1+oe-NC group， 1）P＜0.05.

Groups HG+si-SP1+oe-NC HG+si-SP1+oe-MAP3K1 MAP3K1 TNF-α IL-1β IL-6 1.00±0.12 72.51±5.25 31.46±2.74 65.68±5.76 2.02±0.261）117.43±6.771）55.81±3.341）103.91±8.041）t P 22.17 0.000 18.54 0.000 28.41 0.000 14.56 0.002

3 討論

全球糖尿病患者中DR總體患病率為35%，發(fā)病機制極為復雜［11］。隨著糖尿病成為全球流行病，DR作為其嚴重微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率也在上升［12-13］。視網膜內微血管異常增加了血管通透性和新血管形成，這些異常包括血管基底膜增厚、緊密連接失敗、周細胞喪失和無細胞毛細血管形成。因此，毛細血管閉塞和非灌注導致局部缺血并引發(fā)病理性血管生成［14］。血管生成涉及現有脈管系統(tǒng)的新血管生長，以響應非灌注和缺血后發(fā)生的血液/氧氣和營養(yǎng)物質供應減少［15］。DR的另一個重要分類是糖尿病性黃斑水腫，是一種積聚到神經視網膜中的液體導致視網膜異常增厚，且經常出現黃斑囊樣水腫，是DR患者視力喪失的最常見原因［16-17］。DR早期高血糖是引起視網膜病理變化的主要誘因，與誘導氧化應激、炎癥、增殖、新生血管等有關［18-19］。本研究已證明轉錄因子SP1參與DR炎癥反應和hRMECs凋亡，進一步過表達MAP3K1逆轉了si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用。從機制上講，本研究表明SP1通過促進MAP3K1表達促進hRMECs凋亡及炎癥反應。

SP1是鋅指家族成員，與含GC-box的DNA結合。除SP1外，鋅指蛋白家族成員還包括SP2、SP3和SP4，具有相似的DNA結合特異性，在基因調控中發(fā)揮不同作用。其中SP1作為被廣泛研究的因子，已被證實可激活許多含GC-box的啟動子［20］。SP1能夠響應各種細胞外和細胞內信號調節(jié)多種基因表達，包括參與增殖、細胞周期、DNA修復和凋亡的基因［21］。研究發(fā)現SP1介導高血糖誘導的DR Robo4上調，影響細胞遷移、單層通透性和血管生成，表明SP1可能在DR微血管功能障礙中起重要作用［22］。此外，SP1的O-GlcNAc修飾介導高血糖時ICAM-1上調，導致視網膜損傷和炎癥反應［23］。本研究通過構建DR模型，發(fā)現SP1在此模型中高表達。隨后在hRMECs中干擾SP1表達，通過30 mmol/L D-葡萄糖誘導48 h，發(fā)現抑制SP1表達后，DR細胞凋亡率降低，炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量也降低，炎癥反應被抑制，表明在DR細胞中降低SP1表達減輕了hRMECs凋亡和炎癥反應。

為識別SP1的下游靶標mRNA，通過JASPAR生物信息學網站分析發(fā)現，SP1與MAP3K1啟動子區(qū)域存在結合位點。ChIP-qPCR實驗發(fā)現，SP1的特異性抗體可與MAP3K1結合，抑制SP1表達后MAP3K1表達明顯降低，證實SP1可調控MAP3K1表達。文獻報道，MAP3K1作為一種全長蛋白具有產生抗凋亡信號的潛力，MAP3K1上調發(fā)揮促凋亡作用［10］。此外，AL-SADI等［24］指出MAP3K1通過經典NF-κB通路與腸道炎癥密切關聯，刺激炎癥發(fā)生。抑制MAP3K1會減輕HG誘導的hRMECs凋亡和促炎因子釋放［9］。M2巨噬細胞可通過抑制MAPK通路FGFR2、MAP3K1、MRAS、BRAF和p-ERK表達，保護腎小球內皮細胞免受糖基化產物損害［25］。本研究顯示，MAP3K1在DR細胞模型中高表達，與XU等［9］結果一致。本實驗還發(fā)現進一步過表達MAP3K1逆轉了si-SP1對HG誘導的hRMECs凋亡和炎癥反應的抑制作用。

綜上，DR中，轉錄因子SP1通過促進MAP3K1表達，促進細胞凋亡及加劇促炎因子釋放。表明SP1參與DR進展，為DR提供了潛在治療靶點。