TLR4/ERK1/2信號通路在不明原因自然流產(chǎn)蛻膜組織中的作用研究

李娜 欒兆進△ 楊美霞 宮曉玲 趙紫薇 宋芳

（1.包頭醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，包頭 014000； 2.包鋼第三職工醫(yī)院，包頭 014000）

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）是指妊娠不足28周，胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止者，其病因十分繁雜，在臨床上仍有近半數(shù)的患者病因不明。越來越多的研究認為SA與蛻膜免疫微環(huán)境異常有關(guān)［1］，在正常妊娠期間占主導(dǎo)地位的細胞型是Th2型細胞，具有維持母體和胎兒免疫耐受的作用；一旦Th1型細胞占主導(dǎo)地位，將導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生［2］。Toll受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是蛻膜局部微環(huán)境重要的刺激信號之一，可經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起母胎界面的免疫活性因子Th1/Th2失衡［3］。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）可誘導(dǎo)Th1型細胞分化，在母胎免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［4］。LUO等［5］研究發(fā)現(xiàn)TLR4是ERK1/2的激活劑，病毒感染機體后，隨著TLR4的激活免疫反應(yīng)啟動，MAPKs信號通路被激活，進一步磷酸化轉(zhuǎn)錄因子和細胞蛋白，最終加重了炎癥反應(yīng)。然而，TLR4是否通過激活ERK1/2引發(fā)SA，是亟待解決的問題。因此，本文擬通過研究TLR4和ERK1/2在不明原因SA和正常妊娠蛻膜組織的表達差異及二者的相關(guān)性，探討蛻膜組織中TLR4通過ERK1/2信號途徑參與SA發(fā)生的可能性，為不明原因SA防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 流產(chǎn)組：2019年5月至2020年5月在包鋼第三職工醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診，夫妻雙方身體健康而B超提示胚胎死亡，需進行手術(shù)的32例不明原因SA患者。年齡22～31歲，平均（23.31±3.76）歲，妊娠時間（51±5） d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無明確致流產(chǎn)的因素；②初次發(fā)生自然流產(chǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有遺傳性疾病、不良飲食史、服藥史的患者。對照組：同期健康孕婦32例，年齡21～32歲，平均（24.32±3.38）歲，妊娠時間（53±5） d。無腹痛、陰道流血等癥狀，自愿行人工流產(chǎn)術(shù)。以上兩組所有研究對象均簽署知情同意書且本研究獲包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批［包醫(yī)審2022第（1號）］。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗人TLR4單克隆抗體（sc-293072，Santa Cruz公司）；兔抗人ERK1/2（4696S）、兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體（4370S，Cell Signaling Technology公司）；免疫組化通用型試劑盒（PV-6000，中杉金橋公司）、辣根過氧化物酶二抗（A0208、A0216，碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集與處理 將兩組患者手術(shù)后的蛻膜組織，快速用0.9%NaCl溶液清洗至無血色后，分為兩部分進行收集，一部分蛻膜組織用于免疫組織化學(xué)染色而進行包埋制成切片；另一部分蛻膜組織保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)的Western blot檢測。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色（IHC）法 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；滴加鼠抗人TLR4（1∶200）、兔抗人ERK1/2（1∶250）和p-ERK1/2（1∶400）一抗，4 ℃冰箱內(nèi)孵育12 h；滴加二抗進行孵育；顯色及細胞核復(fù)染后，常規(guī)操作直至封片完成，用SMART生物顯微鏡（B301）進行光鏡鏡檢。視野下每個標(biāo)本留取5個不重復(fù)的清晰圖片（×200），用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達相對含量，對兩組蛻膜組織進行半定量分析。

1.2.3 Western blot檢測 取流產(chǎn)組和對照組的每例蛻膜組織20 g收集到EP管中，通過BCA試劑盒檢測其蛋白濃度；電泳轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜進行封閉；洗滌液洗膜后，滴加鼠抗人TLR4（1∶1 000）、兔抗人ERK1/2（1∶1 000）和兔抗人p-ERK1/2（1∶2 000）一抗，4 ℃冰箱孵育；二抗孵育后，洗膜后將膜放入顯影液中，避光3 min，將膜放入一體式凝膠成像系統(tǒng)（OI100 Touch），觀察條帶，根據(jù)內(nèi)參條帶灰度值調(diào)整上樣量。使用Image J軟件進行灰度定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗；相關(guān)性用Pearson等級相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 在不明原因SA組和正常妊娠對照組蛻膜細胞的細胞質(zhì)上都有TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達，呈棕黃色顆粒，且各組陽性反應(yīng)強弱有別（圖1）。

圖1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達（×200）Fig.1 Expressions of TLR4， ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in decidual tissue （×200）

圖像分析結(jié)果顯示，TLR4、p-ERK1/2蛋白在不明原因SA患者蛻膜組織的表達明顯高于正常妊娠對照者（P＜0.01）；與正常妊娠對照組相比，不明原因SA組蛻膜組織上ERK1/2的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Tab.1 Different expressions of TLR4， ERK1/2 and PERk1/2 proteins in decidua tissues （±s）

表1 TLR4、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Tab.1 Different expressions of TLR4， ERK1/2 and PERk1/2 proteins in decidua tissues （±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01.

p-ERK1/2 0.436±0.0761）0.323±0.080 Control 0.102±0.0660.331±0.074 Groups SA TLR4 0.174±0.0301）ERK1/2 0.340±0.149

2.2 Western blot 結(jié)果顯示，在不明原因SA組蛻膜組織中，TLR4的蛋白相對含量高于正常妊娠對照組（P＜0.05），p-ERK1/2的蛋白相對含量明顯高于正常妊娠對照組（P＜0.01），ERK1/2的蛋白相對含量與正常妊娠對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 Western blot分析TLR4、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白在蛻膜組織中的表達差異（±s）Fig.2 Western blot analysis of TLR4， ERK1/2， p-ERK1/2 protein expressions in decidua tissues （±s）

2.3 TLR4與p-ERK1/2的相關(guān)性分析 在不明原因SA組的蛻膜組織中，TLR4與p-ERK1/2的表達呈顯著正相關(guān)（r=0.890，P＜0.01，圖3）。

圖3 SA組TLR4與p-ERK1/2的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of TLR4 and p-ERK1/2 in SA group

3 討論

SA病因與發(fā)病機制極其復(fù)雜，目前已經(jīng)證明母體內(nèi)分泌紊亂、感染性因素等都會引起SA的發(fā)生，但仍有約40%～50%的患者病因不明。在妊娠障礙相關(guān)疾病中，不明原因SA的發(fā)病率逐年增高，引起眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，有研究表明不明原因SA的發(fā)生與蛻膜微環(huán)境免疫失衡有關(guān)。正常妊娠期間的關(guān)鍵細胞型是Th2型細胞，以分泌IL-4和TGF-β等細胞因子為主，這些Th2型細胞因子起到阻抑免疫炎癥反應(yīng)作用，促進胎兒生長維持妊娠；Th1型細胞主要分泌的細胞因子有IL-2、IL-12和IFN-γ等，這些Th1型細胞因子在滋養(yǎng)細胞侵襲時具有一定的抑制作用，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。在胚泡植入的過程中，子宮內(nèi)膜蛻膜化后成為蛻膜，蛻膜的免疫細胞群可以調(diào)控免疫平衡，發(fā)揮免疫抑制作用，同時能抵抗氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和免疫排斥等，維持母體對胎兒的耐受［6-7］。DU等［8］的研究表明蛻膜異常發(fā)育將引發(fā)SA，與金麗穎［9］的研究所得結(jié)論一致，在SA患者的蛻膜免疫微環(huán)境中，具有促血管生成能力的蛻膜自然殺傷（decidual natural killer，dNK）細胞數(shù)量有所降低，同時dNK細胞分泌IL-10和TGF-β減少，使滋養(yǎng)細胞入侵能力減弱，影響子宮螺旋動脈重塑，進一步影響胎盤形成，從而導(dǎo)致妊娠失敗。

TLR4與各種妊娠障礙有關(guān)，因為TLR4在妊娠維持尤其是免疫耐受中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可激活其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路NF-κB、MyD88、ERK等，引發(fā)Th1型細胞因子的分泌和免疫應(yīng)答的發(fā)生［10］。從本實驗研究結(jié)果中可見：在不明原因SA患者蛻膜細胞的細胞質(zhì)內(nèi)TLR4蛋白有所表達，說明TLR4可能參與不明原因SA；Western blot結(jié)果顯示，TLR4蛋白表達量在不明原因SA患者蛻膜組織中高于正常對照組，該結(jié)果與XU等［11］的研究結(jié)果趨于一致。以往的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，Th1型細胞激活會激活NK細胞，引起胎兒SA的級聯(lián)反應(yīng)［12］，因此推測，TLR4蛋白表達上調(diào)促進Th1型細胞分泌更多的Th1型細胞因子，Th1型細胞因子參與免疫應(yīng)答時抑制dNK細胞的表達，從而引起胚胎血管生成能力降低，子宮螺旋動脈重塑受阻，導(dǎo)致胚胎缺血、缺氧，阻礙胚胎發(fā)育，發(fā)生流產(chǎn)。

ERK1/2是經(jīng)典的MAPK家族成員之一，ERK1/2活化能誘導(dǎo)Th1型細胞分化，促進細胞因子IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α等的產(chǎn)生，調(diào)控Th1/Th2的平衡，在蛻膜免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TLR4作為上游信號分子可以調(diào)控下游級聯(lián)反應(yīng)，包括MAPKs的激活，刺激信號可激活磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2），將信息轉(zhuǎn)至細胞核內(nèi)［13］。有研究表明，p-ERK1/2可以防止滋養(yǎng)細胞過度增殖，為胚胎的著床和生長發(fā)育提供所需的物質(zhì)基礎(chǔ)［14］，但是關(guān)于ERK1/2在不明原因SA蛻膜組織中的作用未見報道，而且關(guān)于TLR4介導(dǎo)ERK1/2信號通路的研究主要集中在病毒感染免疫方面。本研究發(fā)現(xiàn)蛻膜細胞的細胞質(zhì)是p-ERK1/2蛋白的表達定位點，且p-ERK1/2蛋白在不明原因SA組呈高表達，在對照組呈低表達；同時Western blot實驗結(jié)果與上述半定量結(jié)果趨于一致，p-ERK1/2蛋白水平在流產(chǎn)組明顯高于對照組，而ERK1/2蛋白的表達水平，在兩組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示，ERK1/2信號被激活后，其活化形式p-ERK1/2可能參與不明原因SA的發(fā)生。另外，在不明原因SA患者蛻膜組織中，TLR4與p-ERK1/2具有正相關(guān)性，推測TLR4/ERK1/2信號通路參與SA的發(fā)生，但不明原因SA蛻膜組織中TLR4/ERK1/2信號通路的改變是不明原因SA發(fā)生的原因還是結(jié)果尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4、ERK1/2基因及蛋白表達，可抑制炎癥反應(yīng)［15］。由此推測，在不明原因SA蛻膜組織中，Th1型細胞因子的釋放可能是通過TLR4/ERK1/2信號途徑促進的，導(dǎo)致胚胎發(fā)育原本的蛻膜微環(huán)境被Th1型細胞因子的分泌而破壞，從而引發(fā)不明原因SA。在胚泡著床后，胚胎和蛻膜組織都有大量生長因子及其受體的轉(zhuǎn)錄，其中核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（activator protein-1，AP-1），在人胎盤中表達較廣泛，且AP-1活化后對胎盤形成及胎兒發(fā)育具有調(diào)控作用。VIEDT等［16］研究發(fā)現(xiàn)Th1型細胞因子的釋放過程需要AP-1參與調(diào)控，另外，OLDENHOF等［17］發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路的激活可調(diào)節(jié)AP-1活性影響其活化。因此，可能是TLR4/ERK1/2/AP-1信號通路被激活后，增加Th1型細胞因子的分泌量，引起蛻膜微環(huán)境免疫失衡，導(dǎo)致SA的發(fā)生。

綜上所述，不明原因SA的發(fā)生過程可能涉及TLR4和ERK1/2參與，而且ERK1/2的活化可能是通過TLR4激活引起，但是關(guān)于TLR4/ERK1/2下游有哪些信號因子，共同參與不明原因SA的發(fā)生發(fā)展，有待于進一步研究。因此進一步研究蛻膜細胞中TLR4/ERK1/2通路發(fā)揮作用的機制將為闡明不明原因SA的分子機制提供幫助，對蛻膜細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究也可能為不明原因SA的治療提供新的思路。