HMGB1-TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在腺苷預(yù)處理保護(hù)腦缺血再灌注損傷中的作用

張振祥 高守媛 栗延偉 季禾 譚軍

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003）

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中后，通過(guò)各種途徑疏通血管實(shí)現(xiàn)再灌注對(duì)腦組織再次的創(chuàng)傷，嚴(yán)重影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞凋亡等，其中炎癥反應(yīng)在此過(guò)程中發(fā)揮的作用不容忽視［1-2］。因此，保護(hù)神經(jīng)功能的重要手段之一即是抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展；Toll樣受體廣泛存在于各種免疫細(xì)胞，作為模式識(shí)別受體是高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）的重要受體之一［3］；在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，HMGB1主要通過(guò)與Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）相結(jié)合，從而激活下游信號(hào)通路，如胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤壞死因子、IL-1、IL-6等炎癥因子的釋放［4-5］。HMGB1在腦組織中多種類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞中均有表達(dá)，當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后，缺血壞死的神經(jīng)細(xì)胞主動(dòng)將HMGB1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間，通過(guò)特異性識(shí)別并結(jié)合TLR4，使NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移而被活化，引發(fā)一系列細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，刺激神經(jīng)發(fā)生炎癥反應(yīng)［6-7］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HMBG1、TLR4、NF-κB信號(hào)通路參與了大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)［8］。目前較多研究發(fā)現(xiàn)，腺苷作為一種內(nèi)源性核苷，在機(jī)體能量代謝過(guò)程中能夠減少氧自由基的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞程序性死亡，保護(hù)血腦屏障，抑制炎癥因子釋放，對(duì)神經(jīng)功能起保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不完善［9-11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型探討HMGB1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的影響及腺苷預(yù)處理與該信號(hào)通路之間的聯(lián)系，為臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心選取80只體質(zhì)量220～270 g的成年雄性SD大鼠，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度、濕度適宜，食物水分充足，研究過(guò)程嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)相關(guān)規(guī)定，經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)審核通過(guò)（新醫(yī)三附院倫審［K2021-038-01號(hào)］）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 腺苷（北京索萊寶科技有限公司）；大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）栓線（西濃科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑粉劑（美國(guó)Sigma公司）；改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；NF-κB p65抗體、TLR4抗體、重組Anti-HMGB1抗體（南京川博生物技術(shù)有限公司）；Nikon顯微鏡（Nikon）；一體化智能蒸餾儀（山東濟(jì)南市盛泰有限公司）；HH600恒溫水浴箱（邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品）；DHG-9055A鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 從80只SD大鼠中剔除實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造模失敗的11只，其余69只按照隨機(jī)原則，分為假手術(shù)組（F組）、缺血再灌注組（I/R組）、腺苷預(yù)處理組（AP組）共3組，每組23只。其中AP組大鼠在術(shù)前3 d腹腔注射腺苷注射液1.5 mg/kg，用2 ml生理鹽水稀釋后注射，1次/d；F組、I/R組大鼠術(shù)前3 d于相同條件下腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 制備大鼠MCAO模型 I/R組、AP組于術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4～6 h禁水，配制10%水合氯醛溶液，避光條件下用注射器抽取適量溶液（3 ml/kg），對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，直至角膜反射消失，取仰臥位，用專(zhuān)用繃帶固定其四肢及頭部，用電動(dòng)剃刀剔除大鼠頸部的背毛，然后進(jìn)行局部皮膚消毒處理，沿頸正中線切開(kāi)4 cm小口，逐層分離各層組織，使用玻璃分針鈍性分離血管、神經(jīng)，動(dòng)作輕柔避免操作中大鼠神經(jīng)、血管斷裂導(dǎo)致大鼠死亡，充分暴露出大鼠的左頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）以及頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），用小動(dòng)脈夾臨時(shí)夾住ICA，用細(xì)線結(jié)扎CCA和ECA的近心端并在距CCA分叉處剪一斜行小口插入栓線，在CCA遠(yuǎn)心端系牢栓線，松開(kāi)小動(dòng)脈夾，然后輕推栓線直至遇到輕微阻力，在CCA遠(yuǎn)端用細(xì)線固定栓線避免脫出，消毒皮膚，縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，2 h后將栓線輕輕拔出10 mm。操作全程用60 W白熾燈照射，使體溫保持在37 ℃。操作過(guò)程中密切觀察大鼠的生命體征，蘇醒后觀察大鼠右側(cè)肢體癱瘓程度，評(píng)估造模是否成功。F組大鼠僅暴露分離ICA、ECA、CCA而不結(jié)扎，其余操作步驟同AP組及I/R組。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 參照LONGA等［12］的方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，0分：正常（無(wú)神經(jīng)功能損傷）；1分：提尾時(shí)大鼠對(duì)側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢內(nèi)收屈曲（輕度神經(jīng)功能損傷）；2分：向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)爬行（中度神經(jīng)功能損傷）；3分：站立或爬行時(shí)，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒（重度神經(jīng)功能損傷）；4分：意識(shí)障礙且無(wú)自主活動(dòng)。將輕度、中度、重度神經(jīng)功能損傷的大鼠納入實(shí)驗(yàn)，剔除評(píng)分0分、4分以及死亡的大鼠。

1.2.4 大鼠腦梗死體積計(jì)算 腦缺血再灌注24 h后隨機(jī)從每組大鼠中選取3只，同上述方法深部麻醉后，解剖腦組織，并將大腦組織放入-20 ℃的冰箱中冷凍30 min，然后植入腦切片模具中，沿冠狀軸將大腦切成2 mm厚的腦片，然后放入2%TTC染色劑中避光保存，37 ℃下孵育30 min，每5 min翻動(dòng)1次，均勻染色后拍照記錄。使用Image J軟件準(zhǔn)確測(cè)量出各組大鼠的腦梗死面積（S），參考公式：V=∑n（Sa+Sb）×d/2（其中V為腦梗死體積，n為腦組織切片的數(shù)量，Sa與Sb為同一腦片上下兩面的面積，d為腦片厚度），計(jì)算每組大鼠腦梗死體積。

1.2.5 標(biāo)本的采集和處理 缺血再灌注2 h、6 h、24 h、48 h各取5只大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液深度麻醉后，仰臥于手術(shù)架上，開(kāi)胸充分暴露心臟，剪開(kāi)心包，血管鉗固定心臟，從心尖處插入穿刺針到主動(dòng)脈并固定穿刺針，剪開(kāi)右心耳后往心臟中反復(fù)注射4 ℃的生理鹽水，直至右心耳流出液變澄清，肺、眼珠及足部變白，隨即用冰凍4%多聚甲醛溶液灌注心臟至前肢、頸部僵硬，斷頭取腦，將腦組織于固定液中固定24 h，切取視交叉前后2 mm行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚約4 μm），于 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 HE染色 將石蠟切片置于60 ℃恒溫箱中，2 h后取出，分別放入兩道二甲苯中，各需10 min，由高到低經(jīng)梯度濃度乙醇各浸泡5 min，然后用蒸餾水沖洗，再將切片放入蘇木素溶液中，7 min后用自來(lái)水沖洗，再經(jīng)1%鹽酸乙醇分化30 min，自來(lái)水沖洗返藍(lán)后再用蒸餾水沖洗，然后通過(guò)伊紅染液染色2 min，再經(jīng)過(guò)低濃度到高濃度乙醇各5 min，隨后經(jīng)兩道二甲苯透明，然后放置風(fēng)干后用封片膠封片。將切片依次放在顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 免疫組化檢測(cè)各組大鼠腦組織HMGB1、TLR4、NF-κB的表達(dá) 石蠟切片脫蠟方法同HE染色，脫蠟后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS）沖洗3次×5 min；然后將切片浸入改進(jìn)型檸檬酸鹽修復(fù)液（1×）中，經(jīng)微波爐加熱至沸騰，持續(xù)亞沸騰10 min（95～98 ℃）后冷卻30 min；取出切片并滴加適量?jī)?nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑覆蓋組織，然后放置于室溫環(huán)境下，10 min后用0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片并滴加100 μl正常山羊血清工作液封閉覆蓋組織，室溫環(huán)境下放置，10 min后倒去血清，滴加稀釋后的一抗（兔抗HMGB1、兔抗TLR4、兔抗NF-κB），37 ℃環(huán)境下放置60 min后用0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片，滴注適量的生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物覆蓋組織，室溫環(huán)境下放置，10 min后用0.01 mol/L PBS緩沖溶液反復(fù)沖洗3遍×3 min；取出切片并滴加適量辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作溶液，室溫下放置10 min。0.01 mol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍×3 min；加入新制備的DAB彩色溶液并在室溫下孵育8 min。流動(dòng)水沖洗后放入蘇木素染液中染色20 s，同HE染色依次分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片。所用切片均通過(guò)低倍鏡（×100）隨機(jī)定位于額頂葉梗死周邊區(qū)，即缺血半暗帶，然后置于高倍鏡（×400）下選取不連續(xù)的5個(gè)視野采集圖像，用ImageJ 1.53e圖像處理軟件計(jì)算每張圖片HMGB1、TLR4、NF-κB的平均光密度值，求其平均值并記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用±s來(lái)表示，運(yùn)用單因素方差分析法對(duì)各組數(shù)值的變量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用最小顯著差LSD檢驗(yàn)對(duì)各組之間進(jìn)行比較分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 由表1可見(jiàn)，F(xiàn)組大鼠的神經(jīng)功能無(wú)異常，而另外兩組大鼠的神經(jīng)功能均出現(xiàn)了不同程度的受損，且AP組神經(jīng)功能評(píng)分相比I/R組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurological function scores in each group （±s，n=5）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s，n=5）Tab.1 Comparison of neurological function scores in each group （±s，n=5）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs I/R group.

48 h 0.000±0.000 2.20±0.4471）1.20±0.4472）Groups F I/R AP 2 h6 h24 00±0.0000.000±0.0000.000±0.0 2.60±0.5481）1.80±0.4472）2.60±0.5481）1.40±0.5482） h0.000 2.40±0.5481）1.20±0.4472）

2.2 各組大鼠腦梗死體積 F組、AP組、I/R組腦梗死體積分別為（0.000±0.000）mm3、（93.670±4.509）mm3、（123.670±7.234）mm3，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=515.372，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦切片TTC染色Fig.1 TTC staining of brain section of rats in each group

2.3 HE染色觀察各組大鼠腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變將HE染色后的各組大鼠腦組織切片置于（×400倍）顯微鏡下觀察，其中F組大鼠腦組織可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)規(guī)則無(wú)破壞，胞核清晰可見(jiàn)呈類(lèi)圓形，細(xì)胞間質(zhì)無(wú)水腫；I/R組大鼠腦組織可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，氣球樣改變，細(xì)胞間質(zhì)疏松，胞核固縮，部分細(xì)胞未見(jiàn)細(xì)胞核。而AP組大鼠腦梗死區(qū)細(xì)胞損傷程度較I/R組輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）Fig.2 Pathological changes of cerebral cortex cells in each group（HE，×400）

2.4 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后HMGB1表達(dá)情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間段的HMGB1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表2。

圖3 各組大鼠腦組織中HMGB1的表達(dá)情況（IHC，×400）Fig.3 Expression of HMGB1 in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表2 各組大鼠腦組織HMGB1蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.2 Expression level of HMGB1 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表2 各組大鼠腦組織HMGB1蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.2 Expression level of HMGB1 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

48 h 0.189 6±0.004 5 0.235 8±0.006 01）0.288 0±0.002 52）Groups F AP I/R 2 h6 h 0.170 4±0.013 10.202 6±0.014 90.21 0.211 0±0.008 51）0.476 8±0.012 61）0.49 0.269 6±0.027 82）0.605 8±0.029 02）24 h0 6±0.015 9 9 0±0.006 31）0.617 6±0.013 12）

2.5 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后TLR4表達(dá)情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間段的TLR4表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組大鼠腦組織中TLR4的表達(dá)情況（IHC，×400）Fig.4 Expression of TLR4 in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表3 各組大鼠腦組織TLR4蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.3 Expression level of TLR4 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表3 各組大鼠腦組織TLR4蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.3 Expression level of TLR4 protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

48 h 0.196 0±0.022 2 0.294 0±0.021 61）0.342 0±0.013 12）Groups F AP I/R 2 h 6 h 2 0.192 1±0.009 6 0.359 6±0.039 71）0.569 0±0.018 32）0.188 3±0.022 2 0.523 6±0.032 11）0.665 6±0.047 22）4 h 0.191 3±0.017 1 0.315 6±0.013 01）0.451 8±0.038 62）

2.6 各組大鼠腦缺血再灌注損傷后NF-κB表達(dá)情況 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間段的NF-κB表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表4。

圖5 各組大鼠腦組織中NF-κB的表達(dá)情況（IHC，×400）Fig.5 Expression of NF-κB in brain tissues of rats in each group （IHC，×400）

表4 各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.4 Expression level of NF-κB protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

表4 各組大鼠腦組織NF-κB蛋白表達(dá)量（±s，AOD）Tab.4 Expression level of NF-κB protein in rat brain tissues in each group （±s，AOD）

Note：1）P＜0.05，vs F group； 2）P＜0.05，vs AP group.

Groups F AP I/R 2 h6 h.198 8±0.013 30.202 0±0.012 50.200 1）1）0 0.339 2±0.014 9 0.431 0±0.031 92）48 h 0.203 2±0.011 8 0.269 0±0.007 31）0.366 8±0.028 42）0.362 8±0.016 8 0.454 2±0.031 52）24 h6±0.014 9 0.328 2±0.041 71）0.482 0±0.034 62）

3 討論

腦缺血再灌注損傷是缺血性卒中后通過(guò)靜脈溶栓或機(jī)械取栓等措施實(shí)現(xiàn)血管再通、組織再灌注后引起二次損傷，從而加重神經(jīng)功能損傷的過(guò)程，其病理過(guò)程主要包括氧化抗氧化作用失衡、炎癥反應(yīng)、線粒體功能異常、凋亡基因過(guò)度表達(dá)等［13-14］。目前研究發(fā)現(xiàn)，采用藥物預(yù)處理的方式提前激活神經(jīng)保護(hù)過(guò)程，從而減輕腦缺血再灌注后對(duì)腦組織的再次傷害，為臨床診治提供新的治療方案，改善患者的運(yùn)動(dòng)功能，減輕其痛苦。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺苷預(yù)處理不僅可以減輕腦缺血再灌注的神經(jīng)損傷同時(shí)可以減輕腦細(xì)胞的破壞，這與既往研究者的研究結(jié)果相吻合，由此可見(jiàn)腺苷預(yù)處理對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用［15］。腺苷是機(jī)體能量代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種核苷酸，當(dāng)機(jī)體受到各種病理刺激后，導(dǎo)致機(jī)體缺血、缺氧，能量供應(yīng)減少，腺苷被釋放到細(xì)胞外，以此來(lái)減少ATP的消耗，恢復(fù)缺血部位的能量供應(yīng)，從而避免組織損傷［16］。腺苷分布廣泛，存在于心、腦、胃腸等多個(gè)組織中，在腦組織中，其主要通過(guò)激活相應(yīng)的受體（腺苷A1受體）對(duì)缺血腦組織起神經(jīng)保護(hù)功能［17-18］。目前研究證實(shí)，腺苷預(yù)處理可以通過(guò)多種途徑減輕MCAO大鼠再灌注引起的腦組織損傷［9-11］；但具體機(jī)制尚未闡明。

本課題通過(guò)探討HMGB1-TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路在腺苷預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注中的影響，來(lái)作為對(duì)上述作用機(jī)制的補(bǔ)充，為后續(xù)的科學(xué)研究提供依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性卒中發(fā)生后，由于藥物或機(jī)械作用導(dǎo)致生物體血流再灌注進(jìn)而對(duì)組織引起的再次損傷，在此過(guò)程中炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵性作用，而抑制炎癥反應(yīng)則能很大程度上來(lái)減輕缺血性腦組織的損傷［19-21］。

高遷移率族蛋白1是其家族中蛋白含量最豐富的非組核蛋白，在心、肝、腎、腦等全身多個(gè)器官中均有明顯表達(dá)，其主要通過(guò)與DNA結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可維持DNA的正常空間結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素受體的活性以及基因的轉(zhuǎn)錄［22］。病理情況下，當(dāng)組織受到病原微生物攻擊或受到機(jī)械、理化因素刺激后，組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞變性、壞死，HMGB1被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間隙，作為配體通過(guò)與其受體結(jié)合，激活相應(yīng)的信使，繼而促進(jìn)NF-κB核轉(zhuǎn)移發(fā)揮其顯著的促炎作用。

HMGB1不僅參與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展，而且參與腫瘤、創(chuàng)傷、風(fēng)濕免疫等非感染性疾病過(guò)程［23］。TLRs受體包括TLR1-13等受體，作為一種模式識(shí)別受體能夠感知各種危險(xiǎn)信號(hào)，存在于非特異免疫中，可以在巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表面表達(dá)［24］；HMGB1主要通過(guò)與受體TLR4結(jié)合發(fā)揮促炎效應(yīng)，兩者結(jié)合后可使TLR4的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而激活NF-κB，促使IL-1、IL-6及TNF等炎癥因子大量釋放，觸發(fā)炎癥反應(yīng)［25］。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，其與抑制蛋白IκBα結(jié)合以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)機(jī)體受到病理刺激后被激活，從而由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)到細(xì)胞核，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放，如TNF-α、IL-1、IL-6，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的過(guò)程［26］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TLR4可以通過(guò)調(diào)控抑癌基因、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶B、NF-κB等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生炎癥反應(yīng)［27］。

本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的HMGB1、TLR4、NF-κB等蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)I/R組及AP組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯高于F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組大鼠HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)水平從腦缺血再灌注后2 h開(kāi)始升高，24 h后逐步下降，而TLR4的表達(dá)水平從腦缺血再灌注后6 h即開(kāi)始下降，提示HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白均在腦缺血再灌注損傷的早期階段發(fā)揮重要作用。AP組大鼠缺血再灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平較I/R組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測(cè)HMGB1、TLR4、NF-κB三組蛋白作為炎癥反應(yīng)中的重要媒介，參與缺血性腦卒中后，由于血管再通引起的腦組織損傷的病理生理過(guò)程，而腺苷預(yù)處理則可通過(guò)抑制此類(lèi)蛋白的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，減輕腦組織損傷，對(duì)機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，腺苷預(yù)處理不僅能夠減輕腦缺血再灌注的細(xì)胞損傷，縮小缺血壞死的腦組織，同時(shí)能夠挽救更多的神經(jīng)細(xì)胞，改善其功能；而HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白共同參與了腦缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中，腺苷預(yù)處理可以減輕上述蛋白的表達(dá)，抑制其信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這為后續(xù)的科學(xué)研究提供依據(jù)，為未來(lái)的臨床研究指明新的方向。