幽門螺桿菌代謝物拮抗宿主先天免疫的機(jī)制研究

陳智 林煥雄 楊惠鈿

（1.潮州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，潮州 521021；2.潮州市湘橋區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，潮州 521000）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染了世界上一半以上的人口［1］。H.pylori感染的流行率和H.pylori毒力因子的主要基因型在不同地理區(qū)域差異很大［2］。H.pylori可以在惡劣的胃環(huán)境中持續(xù)數(shù)十年，其可破壞胃黏膜并改變胃激素釋放模式，從而影響胃生理。通過利用各種毒力因子，H.pylori靶向不同的細(xì)胞蛋白調(diào)節(jié)宿主先天免疫反應(yīng)（包括炎癥反應(yīng)），并啟動(dòng)對(duì)胃黏膜的多次打擊，導(dǎo)致慢性胃炎和消化性潰瘍［3］。H.pylori感染的長(zhǎng)期后果之一是胃惡性腫瘤，特別是胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤［4］。因此，H.pylori已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為Ⅰ類致癌物［5］。盡管H.pylori感染與感染部位被抑制的先天免疫之間存在密切的因果關(guān)系，但該過程所涉及的確切機(jī)制尚不明確。可以通過改變其表面分子逃避先天免疫受體的識(shí)別［6］。H.pylori還可通過抑制下游信號(hào)通路阻斷其他先天識(shí)別受體。另一方面，H.pylori能夠通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能逃避宿主適應(yīng)性免疫［7］。微生物代謝物與宿主先天免疫系統(tǒng)之間動(dòng)態(tài)相互作用，并在維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抑制炎癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。然而，H.pylori的代謝物是否參與宿主的先天免疫仍未清楚?；诖耍狙芯恐荚谔接慔.pylori代謝物拮抗宿主先天免疫的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃黏膜細(xì)胞GES-1購(gòu)自北京欣盛百泰科技有限公司（貨號(hào)：SC135）；L-谷氨酰胺購(gòu)自廣州小凡科技有限公司（貨號(hào)：76523-100MG）；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自廣州碩譜生物科技有限公司（貨號(hào)：D917531-500ml）；脂多糖（LPS）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司（貨號(hào)：S11060-100mg）；H.pyloriJP26菌株受贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)院微生物所；新生小牛血清購(gòu)自廣州市欣福聯(lián)生物科技有限公司（貨號(hào)：16010-159）；TRIzol試劑購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司（貨號(hào)：5301100）；NF-κB熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自YEASEN公司（貨號(hào)：11501ES03）；RNeasy試劑盒購(gòu)自廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司（貨號(hào)：74124）；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自廣州俊吉生物科技有限公司（貨號(hào)：HM10001、BO60009）；IL-8 ELISA試劑盒購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司（貨號(hào)：DG10305H-48T）；2-D-吡喃葡萄糖（2-D-Glucopyranose，2DG）購(gòu)自北京奇松生物科技有限公司（貨號(hào)：BQS145219-1g）；本研究所用的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除GES-1細(xì)胞系由上海朝瑞生物科技有限公司進(jìn)行敲除。TLR1、TLR2和GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司（貨號(hào)：ab68158、ab209216、ab8245）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 胃黏膜細(xì)胞GES-1培養(yǎng)于含有10%FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。使用終濃度為100 ng/ml的LPS處理GES-1細(xì)胞。

1.2.2H.pylori的培養(yǎng) 在37 ℃的微需氧條件下，H.pyloriJP26菌株在布魯氏菌肉湯液體培養(yǎng)基或瓊脂平板上生長(zhǎng)，輔以10%新生小牛血清。

1.2.3 RNA測(cè)序 TRIzol試劑裂解僅LPS刺激的GES-1細(xì)胞、LPS與H.pylori培養(yǎng)上清共同處理的GES-1細(xì)胞及未處理的GES-1細(xì)胞。使用RNeasy試劑盒提取總RNA。RNA的質(zhì)量用2100 Bioanalyzer檢測(cè)，定量用NanoDrop 2000檢測(cè)。選擇RNA完整性數(shù)（RIN）≥8的RNA樣品制備文庫(kù)。RNA-Seq文庫(kù)使用TruSeq?RNA Library Prep Kit v2進(jìn)行。在HiSeq 2500（Illumina）中對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙端測(cè)序（2×150 bp）。在數(shù)據(jù)分析之前，根據(jù)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)去除污染的原始reads：①去除帶有adapter的reads：包含超過5個(gè)adapter污染堿基的reads被認(rèn)為是adapter污染的reads，將被過濾掉；②排除頻率＞5%的未識(shí)別堿基的reads；③排除低質(zhì)量的reads：低質(zhì)量堿基數(shù)（Phred Quality 值＜19）占總堿基數(shù)15%以上的reads被視為低質(zhì)量reads。剩余的reads被認(rèn)為是“干凈的reads”用于生物信息學(xué)分析。使用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行通路富集分析，然后使用基于KEGG通路的Benjamini & Hochberg檢驗(yàn)，使用每個(gè)腫瘤的差異表達(dá)基因。FDR＜0.05的通路被認(rèn)為是顯著富集的通路。

1.2.4 NF-κB活性的檢測(cè) 通過由NF-κB熒光素酶報(bào)告載體驅(qū)動(dòng)的熒光素酶產(chǎn)生來測(cè)量H.pylori代謝物或16 h的H.pylori培養(yǎng)上清對(duì)NF-κB通路活性的影響。將15 μl GeneJuice在250 μl DMEM中在25 ℃下平衡 5 min，加入2 μg報(bào)告質(zhì)粒并再孵育15 min，然后將混合物添加到約5×106個(gè)GES-1細(xì)胞中。立即將細(xì)胞接種于96孔板中，并使其黏附長(zhǎng)達(dá)24 h。將H.pylori代謝物或不同濃度的2DG或LPS添加到新鮮培養(yǎng)基的細(xì)胞中。4～16 h后，根據(jù)制造商的說明使用商業(yè)試劑測(cè)量熒光素酶活性，并使用Wallac Victor2光度計(jì)從重復(fù)的孔中評(píng)估發(fā)光。

1.2.5 TNF-α、IL-6和IL-8分泌水平的檢測(cè) ELISA檢測(cè)不同條件處理后GES-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和IL-8的分泌水平。

1.2.6 免疫共沉淀和免疫印跡 將2DG處理或不處理的GES-1細(xì)胞在Hanks緩沖液中充分洗滌，并用1 ml預(yù)冷的裂解緩沖液［20 mmol/L Tris（ pH=8）、137 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、2 mmol/L EDTA、10%甘油］裂解蛋白酶抑制劑PMSF（1 nmol/L）、亮肽素和抑肽酶（10 μg/ml）。裂解物以10 000 g離心5 min，收集上清液并與20 μl TLR1或TLR2抗體在4 ℃下孵育1 h。將沉淀在缺乏蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中徹底洗滌，并通過SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡上進(jìn)行分析。使用抗TLR1、TLR2或GAPDH抗體孵育過夜后，以HRP偶聯(lián)的羊抗兔多克隆抗體孵育1 h，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析。

1.2.7 非靶向代謝質(zhì)譜 收集培養(yǎng)4 h（對(duì)照組）和16 h（實(shí)驗(yàn)組）的H.pylori培養(yǎng)上清。將含有2 μg/ml L-2-氯苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)的1 ml提取溶液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1）加入H.pylori上清中。渦旋振蕩30 s后，將樣品在40 Hz頻率下均質(zhì)化4 min，然后在冰水浴中超聲處理10 min。均質(zhì)化和超聲處理循環(huán)重復(fù)3次。將樣品于-40 ℃下孵育1 h，并在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min。將總共800 μl上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，并于37 ℃的真空濃縮器中干燥，然后冰上超聲處理10 min，將干燥的樣品在200 μl 50%乙腈中復(fù)溶，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，并將75 μl上清液轉(zhuǎn)移到新的玻璃小瓶中進(jìn)行LC/MS分析。MS原始數(shù)據(jù)文件隨后由ProteoWizard轉(zhuǎn)換為mzXML格式，并由R包“xcms”處理。該過程包括峰解卷積、對(duì)齊和積分。Minfrac和截止分別設(shè)置為0.5和0.3。內(nèi)部MS2數(shù)據(jù)庫(kù)用于代謝物鑒定。缺失值被最小值的一半填充。將數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行總離子電流歸一化。

1.2.8 分子對(duì)接 所有分子對(duì)接研究均使用AutoDock 4.2.6軟件包進(jìn)行。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）中檢索到TLR2的晶體結(jié)構(gòu)（ID：6NIG）。該結(jié)構(gòu)是通過添加氫原子、去除水和添加Gasteiger電荷制備的。2DG的三維結(jié)構(gòu)取自chemspider（https：//www.chemspider.com/），ID為71358，通過添加氫原子和Gasteiger電荷制備。使用Propka 3.1在pH=7下測(cè)定受體蛋白和VP的質(zhì)子化狀態(tài)。然后將配體以默認(rèn)參數(shù)對(duì)接到TLR2的結(jié)合位點(diǎn)，并導(dǎo)出20個(gè)對(duì)接結(jié)構(gòu)以進(jìn)行進(jìn)一步的視覺分析。使用AutoDock 4.2計(jì)算每個(gè)結(jié)構(gòu)的對(duì)接分?jǐn)?shù)。結(jié)合自由能使用分子力學(xué)/泊松-玻爾茲曼表面積（MM-PBSA）方法計(jì)算。使用PyMOL 2.4.0（https：//pymol.org/2/）構(gòu)建2DG與TLR2對(duì)接結(jié)果的最佳結(jié)合結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件包進(jìn)行。兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)。多組間比較采用方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，其兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，P值經(jīng)Bonferroni法校正。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1H.pylori代謝物抑制GES-1細(xì)胞的NF-κB通路 相較于僅LPS刺激的GES-1細(xì)胞，LPS與H.pylori培養(yǎng)上清共同處理后，多種基因的表達(dá)水平受到調(diào)控，并趨于未處理的GES-1細(xì)胞水平，見圖1A。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，上述基因主要存在于NF-κB通路，主要包括CCL2、CCL20、CCL4、CCL5、CCND1、CCNL1、CCRL2、CD44、CD69、CD80、CD83、CEBPD、CFLAR、CLCF1、CSF1、CSF2、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL2、CXCL3、CXCL6、CXCR7、CYR61、DDX58、DENND5A、FJX1、IFIH1、IFIT2、IFNGR2、IL8、IL15RA、IL18、IL1A、IL1B、IL23A、IL6、IRF1、IRS2、JAG1、JUN、KLF4、KLF6、KLF9、KYNU、LAMB3、MAP3K8、MARCKS、MCL1、NFAT5、OLR1、REL、RELA、RELB、RHOB、RIPK2、SMAD3、SNN、SOCS3、SOD2、TANK、TAP1、TNC、TNF、TNFAIP2、TNFAIP3、TNFAIP6、TNFAIP8、TNFRSF9、TNFSF9、TNIP1、TNIP2、TRAF1，存在于NF-κB通路的下游，見圖1B。LPS與H.pylori培養(yǎng)上清共同處理后，NF-κB通路的活性受到抑制（P＜0.05，圖1C）。使用3KD超濾管過濾H.pylori培養(yǎng)上清，并采用過濾的濾液（代謝物部分）和截留的溶液（蛋白部分）處理LPS刺激的GES-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3KD超濾管過濾的濾液（代謝物部分）能夠抑制NF-κB通路活性（P＜0.05，圖1D）。此外，H.pylori代謝物能夠抑制NF-κB的磷酸化，見圖1E。同時(shí)，H.pylori代謝物能夠抑制NF-κB通路效應(yīng)因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌（P＜0.05，圖1F～H）。

圖1 幽門螺桿菌代謝物抑制GES-1細(xì)胞的NF-κB通路Fig.1 Helicobacter pylori metabolites inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.2 2 DG抑制GES-1細(xì)胞的NF-κB通路 將H.pylori代謝物進(jìn)行非靶向代謝質(zhì)譜，相比于對(duì)照組（培養(yǎng)4 h的H.pylori代謝物），培養(yǎng)16 h的H.pylori代謝物中有32種滿足以下條件：①表達(dá)上調(diào)；②具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A。在LPS處理的同時(shí)，將上述代謝物以5 μmol/L處理GES-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)2DG處理后，GES-1細(xì)胞中NF-κB通路活性受到抑制（圖2B）。在LPS處理的同時(shí)，使用1、5、25 μmol/L 2DG處理后，GES-1細(xì)胞中NF-κB通路活性均受到抑制（圖2C）。在LPS處理的同時(shí)，1、5、25 μmol/L 2DG處理后，GES-1細(xì)胞中NF-κB通路效應(yīng)因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌受到抑制（P＜0.05，圖2D～F）。在LPS處理的同時(shí)，1、5、25 μmol/L 2DG均可抑制NF-κB的磷酸化，見圖2G。

圖2 2DG抑制GES-1細(xì)胞的NF-κB通路Fig.2 2DG inhibits NF-κB pathway of GES-1 cells

2.3 2 DG拮抗宿主TLR2分子抑制NF-κB通路識(shí)別細(xì)菌刺激的先天免疫系統(tǒng)主要是TLR受體家族，且TLR受體家族是NF-κB通路的上游。因此，本研究構(gòu)建了TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞系。使用LPS處理后，相對(duì)于對(duì)照組（Parent組），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1細(xì)胞中NF-κB活性顯著降低（P＜0.05）；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的GES-1細(xì)胞中NF-κB活性無顯著變化。在LPS處理的同時(shí)使用2DG或H.pylori培養(yǎng)上清處理后，TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10敲除的GES-1細(xì)胞中NF-κB活性顯著降低（P＜0.05）；而TLR1和TLR2敲除的GES-1細(xì)胞中NF-κB活性無顯著變化（圖3A）。使用2DG處理后，GES-1細(xì)胞中TLR1和TLR2的相互作用均減弱（圖3B、C）。通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，2DG能夠與TLR2氨基酸殘疾R321、K347、F349結(jié)合，結(jié)合能為-12 kcal/mol（圖3D）。構(gòu)建TLR2野生型和突變型質(zhì)粒（R321K、K347R、F349A），并分別轉(zhuǎn)染TLR2敲除的GES-1細(xì)胞，在LPS處理的同時(shí)使用2DG或H.pylori培養(yǎng)上清處理后并不能減少轉(zhuǎn)染TLR2突變型GES-1細(xì)胞的NF-κB活性（圖3F）。

3 討論

在本研究中，H.pylori代謝物2DG能夠抑制NF-κB通路活性，抑制NF-κB磷酸化，抑制NF-κB通路效應(yīng)因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori利用Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）將CagA注入宿主胃上皮細(xì)胞，并通過激活NF-κB通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［9］。CagA是一種蛋白，應(yīng)在3KD超濾管過濾的截留的溶液中（蛋白部分）。但本研究的蛋白部分不能影響NF-κB通路的活性，而代謝物2DG抑制了NF-κB通路。不同H.pylori菌株之間存在異質(zhì)性。在許多非洲國(guó)家發(fā)現(xiàn)H.pylori感染率高，但H.pylori相關(guān)疾病發(fā)病率低［10］。因此，本研究所使用的H.pyloriJP26可能并不表達(dá)CagA蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在接種H.pylori后第1天，小鼠NF-κB活性和炎癥反應(yīng)顯著上升［11］。然而，在接種H.pylori后第30天或第135天，胃中NF-κB活性水平下降。因此，H.pylori急性感染和長(zhǎng)期感染時(shí)，NF-κB活性水平有所差異。本研究所用的是體外培養(yǎng)的H.pylori，其抑制NF-κB活性的代謝物2DG是否在H.pylori長(zhǎng)期感染中抑制NF-κB活性值得進(jìn)一步探討。

在本研究中，使用LPS處理后，相對(duì)于對(duì)照組（Parent組），TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10敲除的GES-1細(xì)胞中NF-κB活性顯著降低；而TLR3、TLR7、TLR8敲除的胃黏膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞中NF-κB活性無顯著變化。Toll樣受體（TLR）家族蛋白通過識(shí)別多種微生物分子（包括脂蛋白、脂肽、脂多糖、鞭毛蛋白和核酸）中的保守模式在先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。研究表明，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9、TLR10能夠識(shí)別細(xì)菌的模式識(shí)別受體，而TLR3、TLR7、TLR是識(shí)別病毒的基因組［13］。因此，TLR3、TLR7、TLR8敲除后，細(xì)菌獨(dú)有物質(zhì)LPS刺激下NF-κB的活性水平無顯著差異。

TLR2與TLR1結(jié)合對(duì)于識(shí)別細(xì)菌脂蛋白和脂肽至關(guān)重要［14］。這些脂蛋白通過由脂質(zhì)鏈修飾的保守N末端錨定在細(xì)胞膜上，并在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的促炎信號(hào)［15］。TLR2缺陷小鼠對(duì)脂蛋白無反應(yīng)，更容易患金黃色葡萄球菌引起的敗血癥、肺炎鏈球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的腦膜炎，以及結(jié)核分枝桿菌感染［16］。因此，TLR2在細(xì)菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有不可或缺的作用。本研究發(fā)現(xiàn)2DG能夠與TLR2氨基酸殘疾R321、K347、F349結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，TLR1和TLR2胞外域的異二聚化是介導(dǎo)NF-κB通路活化所必需的［17］。TLR1和TLR2氨基酸形成疏水、氫鍵和離子相互作用，穩(wěn)定蛋白質(zhì)異二聚體。其中，TLR2的R321會(huì)與TLR1的E321和E366形成離子鍵，TLR2的K347會(huì)與TLR1的T361和T363形成氫鍵，TLR2的F349會(huì)與TLR1的Y320和V339形成疏水鍵。因此，2DG打斷了這些鍵的形成，減少了TLR1和TLR2的相互作用，使TLR1-TLR2的異源二聚體不穩(wěn)定，抑制了NF-κB通路活化。

綜上所述，H.pylori代謝物2DG能夠與TLR2相互作用，減少TLR2與TLR1異源二聚體的形成，抑制先天免疫NF-κB通路活性。