基于IL-6/JAK2/STAT3信號通路探討灰樹花提取物對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)的影響

金雪 馬賢德 趙卓 徐銘 王建光 杜晗 關(guān)洪全 韓曉偉 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種好發(fā)于結(jié)腸的自身免疫性疾病，其特點為反復(fù)發(fā)作的黏膜粘連性炎癥［1］。我國UC的患病率已高達11.6/100 000，若UC患者不能得到及時有效的治療，其患結(jié)、直腸癌的風(fēng)險將大大增加，嚴(yán)重威脅患者生命健康［2-3］。目前普遍認為UC的致病因素與自身免疫系統(tǒng)異常、炎癥相關(guān)因子高表達以及腸道微生物群間的平衡紊亂等有關(guān)。西醫(yī)治療UC的常用藥物有柳氮磺吡啶、氨基水楊酸鹽類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等。盡管上述藥物被國際社會所普遍認可，但這些藥物對機體產(chǎn)生的副作用與不良反應(yīng)通常較大。調(diào)查顯示，幾乎50%UC患者都經(jīng)歷過皮質(zhì)類固醇相關(guān)的不良事件，如痤瘡、失眠、情緒障礙、葡萄糖不耐受和消化不良等，長期用藥也會提高UC患者罹患慢性疾病或造成肝毒性的風(fēng)險［4］。有限的臨床治療效果與多發(fā)的副作用及不良反應(yīng)正促使人們努力開發(fā)新的治療手段與藥物。

灰樹花（Grifola frondosa）屬真菌科，為一種藥食兩用菌，作為中藥材的一種，灰樹花性平味甘，具有很好的補脾生肌、扶正祛邪之功效，可有效治療臨床以正氣不足、脾陽虛衰、外邪入侵等為主要病機的疾病，且其具有明顯的改善機體免疫功能、抑制腫瘤生長等作用［5-7］?；覙浠ㄖ兴奶烊换衔镞€可消除全身炎癥反應(yīng)［8］，同西藥相比，灰樹花藥性具有更加溫和、無毒副作用，可從改善患者自身免疫力這一根本方向入手達到治療目的，這些為臨床使用灰樹花治療UC提供了依據(jù)與可能。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）/蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路是參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要通路，且對機體免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用［9-10］。近年有研究表明，IL-6/JAK2/STAT3通路相關(guān)因子在UC患者體內(nèi)表達明顯上調(diào)，證實此通路與UC發(fā)病存在密切聯(lián)系［11］。但目前鮮有文獻報道灰樹花提取物對UC大鼠炎癥反應(yīng)影響的具體作用機制，本研究以IL-6/JAK2/STAT3信號通路為切入點，探究灰樹花提取物治療UC的分子機制，旨在為臨床治療UC提供可靠的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡雄性SPF級SD大鼠共40只，體質(zhì)量200～240 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物合格證號：SCXK（遼）2020-0001，本研究經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，倫理審查編號：21000042022086。動物飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。

1.1.2 實驗試劑與儀器 灰樹花提取物（浙江方格藥業(yè)有限公司）；柳氮磺吡啶（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：09220802）；葡聚糖酸鈉鹽（DSS）（美侖云細胞生物科技有限公司，批號：O1031C）；HE染色試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：C0105S）；IL-6抗體、JAK2抗體（碧云天生物科技有限公司，批號：AF7236、AF1489）；STAT3抗體、p-STAT3抗體（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab30647、ab267373）；IL-6R、MPO抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：GB11117-100、GB111237-100）；ELISA試劑盒（安迪華泰生物科技有限公司，批號：AD202304）。RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；MV-100型渦旋混勻儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；Power Pac 1645050型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；1704150型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5200型顯影儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將40只大鼠隨機分為5組，即空白對照組、UC模型組、灰樹花治療組、西藥治療組、聯(lián)合治療組，每組8只。

1.2.2 造模方法 采用3%DSS水溶液自由飲用法建立UC大鼠模型［12］。將DSS溶于蒸餾水，配制成3%DSS水溶液，實驗第1天開始，除空白對照組外，其余4組大鼠每日均給予足量的3%DSS水溶液自由飲用，連續(xù)7 d。空白對照組大鼠給予等量純凈水自由飲用。造模期間持續(xù)觀察并記錄各組大鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量、糞便性狀等變化情況。造模結(jié)束后，使用糞便隱血試劑盒分別檢測各組大鼠便隱血情況。若大鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質(zhì)量降低、黏液膿

血便等表現(xiàn)，且便隱血試驗呈陽性，則每組隨機取1只大鼠處死，觀察結(jié)腸組織病理改變，如有糜爛、潰瘍、炎癥細胞浸潤等病理學(xué)變化，表明造模成功。

1.2.3 給藥方法 實驗第8天（造模成功后）起，依據(jù)人與大鼠等效給藥劑量比值計算大鼠灌胃劑量［13］，灰樹花治療組給予灰樹花提取物10 mg/（kg·d），西藥治療組給予柳氮磺吡啶0.3 g/（kg·d），聯(lián)合治療組同時給予灰樹花提取物10 mg/（kg·d）和柳氮磺吡啶0.3 g/（kg·d），連續(xù)14 d?？瞻讓φ战M和UC模型組灌胃等量生理鹽水。

1.2.4 取材方法 藥物治療14 d后所有大鼠禁食24 h，實驗第22天，使用1%戊巴比妥麻醉大鼠，取腹主動脈血，3 500 r/min 離心15 min，收集上清；處死大鼠后，取結(jié)腸組織分別置于液氮及4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.5 大鼠一般狀態(tài)及疾病活動指數(shù)（DAI）評分 實驗第1天開始，每日觀察并記錄各組大鼠的一般狀態(tài)，隔日測量并記錄大鼠體質(zhì)量、糞便性狀及便潛血情況，實驗結(jié)束后統(tǒng)計各組大鼠DAI，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 DAI scoring criteria

1.2.6 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理改變 將大鼠結(jié)腸組織依次梯度脫水、包埋、切片，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色后各組大鼠的結(jié)腸形態(tài)，每個樣本高倍鏡下隨機選取5個視野。

1.2.7 Western blot檢測大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平 每個樣本取100 mg結(jié)腸組織研磨、裂解、離心后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，加入5×Buffer后煮沸使其變性。依次制備分離膠、濃縮膠，每組以70 μg/ml上樣量加入樣本，將電壓調(diào)至80 V與120 V分別進行電泳，而后采用濕轉(zhuǎn)法，70 V/70 min條件將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，放入含5%BSA的封閉液中封閉70 min，TBST洗滌5 min后孵育一抗過夜，TBST洗滌10 min×3次后孵育二抗2 h，TBST洗滌5 min×6次，使用biosharp發(fā)光液化學(xué)發(fā)光后采集圖像，分析灰度值。

1.2.8 ELISA法檢測大鼠血清中IL-6含量 按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，在96孔板中完成標(biāo)準(zhǔn)品的配制、加樣、洗滌等，最后加入顯色液，置于酶標(biāo)儀中，對各孔的吸光度值進行測定，根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組大鼠血清中IL-6含量。

1.2.9 免疫組化法測定大鼠結(jié)腸組織IL-6R、MPO含量 隨機選取各組大鼠結(jié)腸組織進行浸蠟包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、封閉，滴加一抗孵育過夜，滴加二抗孵育過夜，復(fù)染后封片、圖像采集，高倍鏡下隨機選取3個視野，使用Image J計算分析陽性面積比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察及DAI評分 實驗期間，空白對照組大鼠精神狀態(tài)佳，毛色柔順有光澤，食欲良好，體質(zhì)量穩(wěn)步增加，大便規(guī)律且性狀無異常。使用3%DSS水溶液造模7 d后，除空白對照組外，其余4組大鼠均出現(xiàn)不同程度的活動度下降，毛色光澤度變差，飲食攝入減少，大便次數(shù)增多，糞便不成形甚至肉眼血便表現(xiàn)，DAI評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。藥物治療7 d后，與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組與聯(lián)合治療組大鼠一般狀態(tài)有明顯改善，食欲有所提升，大便逐漸規(guī)律且成形，DAI評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。連續(xù)給藥14 d后，各治療組大鼠體質(zhì)量顯著增加，DAI評分降低更為明顯，而UC模型組大鼠DAI評分雖有所下降，但仍有較為明顯的精神狀態(tài)不佳、排便次數(shù)多、便溏等表現(xiàn)，大便不成形未見好轉(zhuǎn)，便隱血呈陽性。與UC模型組比較，其他3個治療組大鼠DAI評分均顯著下降（P＜0.01），尤以聯(lián)合治療組降低最為明顯，且與灰樹花治療組和西藥治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 大鼠DAI評分情況Fig.1 DAI score of rats

2.2 大鼠結(jié)腸組織病理改變 結(jié)果顯示，空白對照組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，無明顯異常；與空白對照組比較，UC模型組大鼠可見結(jié)腸組織黏膜缺損或脫落，腺體排列紊亂，炎癥細胞浸潤明顯，黏膜基層增厚；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組與聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸黏膜病變均有減輕，黏膜缺損有不同程度改善，腺體排列趨向規(guī)則，但部分仍可見炎癥細胞浸潤，見圖2。

圖2 大鼠結(jié)腸組織病理改變（HE，×200）Fig.2 Histological changes of rats colon （HE，×200）

2.3 大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平 與空白對照組比較，UC模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組、聯(lián)合治療組大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），但各治療組間上述蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

圖3 大鼠結(jié)腸組織IL-6、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of IL-6， JAK2， STAT3 and p-STAT3 proteins in rats colon tissue

2.4 大鼠結(jié)腸組織IL-6R、MPO含量 與空白對照組比較，UC模型組大鼠結(jié)腸組織中IL-6R、MPO含量均顯著增高（P＜0.01）；與UC模型組比較，各治療組大鼠結(jié)腸組織中IL-6R含量均顯著降低（P＜0.01），MPO含量也明顯降低，其中灰樹花治療組和西藥治療組（P＜0.05），聯(lián)合治療組（P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠結(jié)腸組織IL-6R、MPO表達情況（免疫組化，DAB染色，×400）Fig.4 Expressions of IL-6R and MPO in colon tissue of rats （immunohistochemistry，DAB staining，×400）

2.5 大鼠血清中IL-6含量 與空白對照組比較，UC模型組大鼠血清中IL-6含量顯著升高（P＜0.01）；與UC模型組比較，灰樹花治療組、西藥治療組大鼠血清中IL-6含量明顯減少（P＜0.05），聯(lián)合治療組大鼠血清中IL-6含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 大鼠血清IL-6含量Fig.5 IL-6 content in rats serum

3 討論

近幾十年來，新興工業(yè)化國家UC的發(fā)病率迅速上升，由其誘發(fā)的炎癥相關(guān)結(jié)腸癌較其他類型的結(jié)腸癌預(yù)后更差，病死率更高［14-15］。目前西醫(yī)治療UC的主要手段都存在一定的局限性，如根治困難、長期使用后極易出現(xiàn)不良反應(yīng)、耐藥性升高等，因此，研制和開發(fā)治療UC的新藥迫在眉睫。

在中醫(yī)學(xué)中，UC屬“大瘕瀉”“痢疾”“腸澼”等范疇。在隋代巢元方所著《諸病源候論》中就曾有論述：“凡痢皆由榮衛(wèi)不足，腸胃虛弱，冷熱之氣乘虛入客于腸間，腸虛則泄，故為痢也”。UC的中醫(yī)病機極為復(fù)雜，先天不足或后天失養(yǎng)導(dǎo)致脾腎虛弱是主要病因之一，由于脾氣不能散布精氣于全身，腎氣不能溫煦、蒸化、制約陰寒，體內(nèi)正氣不足，進而寒從中生，腸道運化能力失司，病情遷延不愈［16-18］。因此，在治療UC時，首先應(yīng)考慮補益脾氣，兼以辨證施治，如此才能在最大程度上緩解UC病情?；覙浠ㄓ置踝幽ⅰ⑶Х鹁?，其性平味甘，具有健脾益氣、扶正補虛之功效，可從根本改善患者體質(zhì)，補益正氣、驅(qū)邪外出，很大程度上解決了目前西藥在治療UC方面所面臨的難題。據(jù)文獻報道，干灰樹花子實體中含蛋白質(zhì)31.5%、碳水化合物49.69%、粗纖維10.7%，營養(yǎng)元素遠超其他食用菌，居首位［5］。由于灰樹花子實體中含有大量的天門冬氨酸與谷氨酸，有“食用菌之王”“華北人參”的美譽，其含有的多糖、肽類等具有很好的抗腫瘤、抑制炎癥感染、改善免疫功能的作用，含有的多酚具有明顯的抗氧化功效，可起到一定的治療和緩解作用［7-8，19］。也有實驗證實灰樹花具有一定的免疫調(diào)節(jié)及抗炎活性，能夠顯著增強動物脾淋巴細胞的增殖能力，灰樹花中的吡喃糖環(huán)及α型和β型糖苷鍵還可有效抗擊腫瘤［20-22］。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，UC模型組大鼠一般狀態(tài)欠佳，大便次數(shù)增多，糞便不成形，甚至肉眼可見血便表現(xiàn)，DAI評分顯著升高，且結(jié)腸組織可見黏膜缺損與炎癥細胞浸潤，MPO活性也顯著升高，說明UC大鼠模型制備成功。與UC模型組比較，各治療組大鼠的一般狀態(tài)有所改善，DAI評分均有不同程度的降低，且結(jié)腸黏膜損傷減輕，尤以聯(lián)合治療組下降最為明顯。說明灰樹花提取物可在一定程度上有效改善DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

IL-6是一種典型的促炎細胞因子，主要由巨噬細胞及T細胞產(chǎn)生，多數(shù)在炎癥反應(yīng)的急性期分泌，可將其視作炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過程的主要標(biāo)志物之一。在既往的實驗及臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，UC患者的血清檢測和組織活檢中IL-6含量均大幅增加。JAK2是一類重要的酪氨酸蛋白激酶，在UC的炎性級聯(lián)式反應(yīng)中發(fā)揮重要的傳導(dǎo)和銜接作用。STAT3是信號傳導(dǎo)通路家族的重要成員之一，與細胞增殖分化和凋亡密切相關(guān)，其在人體免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。在IL-6/JAK2/STAT3通路中，大量IL-6首先與靶細胞表面IL-6受體（sIL-6R）識別并結(jié)合，形成sIL-6R/IL-6復(fù)合物，進而活化細胞膜表面gp130，然后激活JAK2，使受體酪氨酸激酶活化，并與STAT3蛋白結(jié)合，使STAT3磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控炎癥細胞因子表達，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，UC模型組大鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達均顯著升高，經(jīng)藥物治療后上述蛋白含量明顯降低，其中聯(lián)合治療組IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白含量下降最為明顯，提示灰樹花提取物與西藥聯(lián)合治療效果優(yōu)于單一西藥治療作用。此外，本研究結(jié)果還顯示灰樹花提取物可降低UC大鼠血清中IL-6含量，且與西藥聯(lián)合應(yīng)用后，效果明顯優(yōu)于西藥治療組。

綜上所述，灰樹花提取物調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號通路相關(guān)因子表達，可能是改善UC大鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)的重要機制之一。本研究結(jié)果提示灰樹花提取物在改善UC炎癥方面具有一定優(yōu)勢，協(xié)同西藥治療后優(yōu)于單獨應(yīng)用西藥治療效果?？煽紤]在臨床治療UC疾病時協(xié)同或交替用藥，降低西藥的不良反應(yīng)。因UC病機復(fù)雜，病情又多隨病程轉(zhuǎn)變，用藥治療機制還待進一步探索，課題組后續(xù)也將深入探討影響UC病程進展的其他可能機制。