動態(tài)頂空萃取結合氣相色譜-嗅覺測量-質譜聯(lián)用技術解析不同品種烘青綠茶的揮發(fā)性成分

李瑋軒，解東超，邵晨陽，張 悅，呂海鵬，林 智，杜琪珍,*，朱 蔭,*

（1.浙江農林大學食品與健康學院，浙江 杭州 311300；2.農業(yè)農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

茶葉是全球三大無酒精飲料之一，受到了世界各國人民的廣泛喜愛[1]。綠茶位居中國傳統(tǒng)六大茶類之首，是中國產量最高的茶類，按照殺青和干燥方式的不同可分為炒青、烘青、蒸青和曬青綠茶4 類[2]。烘青綠茶產區(qū)分布較為廣泛，主要以安徽、浙江、福建三省為主，其余地區(qū)也有少量生產[3]。烘青綠茶因其烘干的干燥方式而得名，在綠茶揉捻后即直接烘干，可最大限度保留來自茶樹品種本身的天然風味，往往作為綠茶良種選育的首選加工工藝[4]。查明不同品種烘青綠茶的風味物質組成，可為高香茶樹品種選育、綠茶風味品質的定向加工與調控等提供科學理論依據(jù)。

香氣作為茶葉風味的主要影響因子，對其品質起著重要作用，關乎到茶葉品質的優(yōu)劣，影響著消費者喜好度[5]。茶葉香氣的實質是上百種揮發(fā)性成分以不同濃度組合而成的有機混合物，主要來源于茶樹鮮葉及后期加工中的生物合成途徑及糖苷、類胡蘿卜素、脂肪酸、氨基酸等前體物質的轉化[6]。迄今為止，已從茶葉中分離并鑒定出700 種以上揮發(fā)性物質[7]，然而由于各化合物的氣味特征及氣味閾值差別迥異，并非所有揮發(fā)性物質都對茶葉香氣品質形成具有直接貢獻，僅有一部分具有高香氣強度（aroma intensity，AI）值或高香氣活度值的嗅感物質對茶葉香氣品質起著關鍵作用。目前茶葉中約有184 種嗅感物質被鑒定出，包括醛、酮、醇、酚、吡嗪、硫化物、呋喃、呋喃酮、酸、酯、吲哚、吡咯、吡咯啉、氧化物、噻唑、二氫噻唑、硫酚、芳香族化合物、萜烯等[8]。研究表明，芳樟醇、香葉醇、反式β-紫羅蘭酮、庚醛、2-戊基呋喃、水楊酸甲酯等是許多烘青綠茶的關鍵嗅感成分，但不同品種或產地的烘青綠茶中嗅感物質組成也不盡相同[9-11]。

由于揮發(fā)性化合物總量僅占茶葉干質量的0.01%左右，所以茶葉香氣的提取方法至關重要。目前茶葉香氣的提取方法眾多，如頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）[12]、減壓蒸餾萃?。╲accum distillation extraction，VDE）[13]、同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）[14]、溶劑輔助風味蒸發(fā)（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）[15]、動態(tài)頂空（dynamic headspace，DHS）萃取[16]、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）[17]等。HS-SPME是目前最廣泛使用的茶葉香氣富集方法，操作簡便，但不同纖維涂層對不同類型的物質吸附程度不同，且吸附容量小、易過載；VDE可以在較為溫和的條件下提取出茶葉香氣成分，但耗時長，且需要的茶葉用量大；SDE是傳統(tǒng)提取方法，雖操作簡便、溶劑用量少、萃取效率較高、重現(xiàn)性好，但提取溫度過高，易發(fā)生降解反應，所獲得的茶葉香氣物質往往失真；SAFE法雖然萃取過程較為溫和、能夠較全面提取樣品中的揮發(fā)性成分，但價格昂貴、耗時長、對操作者的操作技能及嫻熟度有較高要求；SBSE與HS-SPME的吸附原理相似，而吸附量是HS-SPME的10 倍之多，是一種理想的提取方式，但成本較高，且對茶湯上方的低沸點香氣成分吸附效果欠佳；DHS萃取不僅適用于復雜基質中揮發(fā)性較高的組分，對較難揮發(fā)及濃度較低的組分也同樣有效，且因其具有所需樣品量少、重現(xiàn)性好、靈敏度高、全自動化等特點，能較好地反映茶葉中揮發(fā)性成分的整體輪廓[18]，已逐漸引起研究者們的關注[19-21]，但該方法也有一定缺陷，傾向于萃取疏水性化合物，對親水性化合物富集效果一般，需要不斷優(yōu)化技術[19]。Ochiai等[19]采用全樣品蒸發(fā)-動態(tài)頂空多次萃取模式確認了日本綠茶中的50 種香氣成分，王顧希等[20]采用動態(tài)頂空萃取聯(lián)合熱脫附/氣相色譜-質譜（DHS-thermal desorption/gas chromatography-mass spectrometry，DHS-TD/GC-MS）結合主成分分析（principle component analysis，PCA）法鑒定出了11 個產區(qū)綠茶中的50 種共有香氣成分及27 種特征香氣成分，田甜等采用類似方法確認了不同季節(jié)凌云白毫綠茶中37 種香氣成分的分布差異[21]。雖然DHS結合化學計量法在茶葉領域有了上述應用，但通過該技術與氣相色譜-嗅覺測量-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用法[22]的綜合應用從而篩選出能被直觀嗅聞的嗅感物質等研究內容罕有相關報道。

由于DHS涉及的實驗參數(shù)較多，如孵化及捕集溫度、吹掃速率及總量等，均會影響茶葉香氣的提取效率。為了更加全面地了解烘青綠茶的香氣化學物質基礎，本實驗采用DHS-TD/GC-MS技術建立了烘青綠茶香氣成分的最優(yōu)提取方法，繼而采用DHS-TD/GC-O-MS及多元統(tǒng)計分析手段分析并比較了不同品種烘青綠茶中的主要揮發(fā)性成分及嗅感物質，以期為綠茶的加工技術提升和香氣品質調控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)《中國無性系茶樹品種志》[4]指導，選擇烘青綠茶適制品種：龍井43、中茶108、福鼎大白茶為研究對象，在2022年3月于中國農業(yè)科學院茶葉研究所嵊州茶葉綜合實驗基地，以統(tǒng)一的一芽一葉為采摘標準進行采摘。

無水乙醇、正構烷烴（C8～C40）北京百靈威科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈有限公司。

1.2 儀器與設備

6 C C H-63 型電炒鍋、6-C H M-901 型碧螺春烘干機 浙江春江茶葉機械有限公司；6-CRM-25型茶葉揉捻機 浙江綠峰機械有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、20 mL頂空玻璃瓶、HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）美國Agilent科技有限公司；DHS自動采樣系統(tǒng)、ODP-3嗅辯儀、Tenax TA吸附管 德國Gerstel股份有限公司；AB104-S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團；Tube Mill 100 control研磨儀 德國IKA儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 綠茶的制備與處理

采用統(tǒng)一的烘青加工工藝（攤放、殺青、揉捻、烘干）制備成相應品種的烘青綠茶。具體加工工藝：一芽一葉鮮葉→攤放（室內自然攤放10～12 h至葉片含水率為70%左右）→殺青（鍋溫260 ℃、葉溫約90 ℃）→揉捻（空壓（10 min）-輕壓（10～15 min）-空壓（10 min））→初烘（烘干溫度120 ℃、時間20 min）→復烘（烘干溫度120 ℃、時間10 min）。

將各品種的烘青綠茶均勻研磨后，0～4 ℃密封保存待用。從各品種樣中分別取出1 g并混合，制備成質量控制樣本，用于DHS分析方法的優(yōu)化。

1.3.2 茶葉感官審評

委托中國農業(yè)科學院茶葉研究所農業(yè)農村部茶葉質量監(jiān)督檢驗測試中心對樣品進行感官審評，并對各樣品的外形、湯色、香氣、滋味和葉底等指標進行打分。

1.3.3 DHS萃取方法

DHS自動采樣系統(tǒng)由安裝在GC-MS系統(tǒng)上的MPS-2自動進樣平臺和Maestro軟件完成（德國Gerstel股份有限公司）。分別向20 mL頂空進樣瓶中加入20、40、60、80、100、200 mg和250 mg混合茶粉，并迅速注入1.0 mL沸蒸餾水。DHS傳輸線溫度設置為150 ℃，恒溫振蕩器待機溫度為60 ℃，振蕩模式設置為振蕩10 s后停止1 s，轉速設置為500 r/min。DHS自動采樣系統(tǒng)首先將含待測樣的頂空進樣瓶抓取至恒溫振蕩器中，分別在70、75、80、85 ℃和90 ℃條件下平衡振蕩3 min后，分別采用300、350、400 mL和600 mL的高純氮氣（99.999%）將頂空瓶中的揮發(fā)性成分吹掃捕集至Te n a x-TA解吸附管，流速分別設置為10、20、30、40 mL/min和50 mL/min，捕集溫度分別為45、50、55、65 ℃和70 ℃。捕集完成后，用100 mL高純氮氣對解吸附管進行干燥處理，流速設置為10、25、50、75 mL/min和100 mL/min，干燥溫度為60 ℃。干燥完成后，將Tenax-TA解吸附管轉移至含熱脫附及冷進樣系統(tǒng)的進樣口中，解吸附后采用上述GC-MS條件分析。各個品種烘青綠茶的DHS萃取及分析實驗分別做3 次技術重復。

1.3.4 熱脫附及冷進樣口系統(tǒng)條件

熱脫附采用溶劑排空模式，傳輸線溫度設置為300 ℃，初始溫度設為30 ℃，延遲1.0 min，保留1.0 min，以100 ℃/s速率升溫至250 ℃，保持4.0 min。冷進樣口采用液氮冷卻至-100 ℃，平衡1.0 min后，以12 ℃/s升溫到280 ℃，保持3.0 min。

1.3.5 GC-MS測定條件

傳輸線溫度設為250 ℃，高純氦氣（99.999%）為載氣，流速為1.6 mL/min，采用不分流進樣模式。柱溫程序初始溫度為50 ℃，保持3.0 min后以4 ℃/min升至265 ℃，并保持5.0 min。質譜條件：EI電離能量為-70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；運行全掃描模式，質譜傳輸線溫度為250 ℃，掃描質量范圍30～450 u；溶劑延遲3.0 min。

1.3.6 GC-O-MS測定條件

GC-MS測定條件與1.3.5節(jié)保持一致；GC-O-MS的嗅辯儀端與MS端1∶1分流進樣；嗅聞口溫度150 ℃；傳輸線溫度220 ℃；補償氣為高純氮氣（99.999%，流速50 mL/min）。嗅聞分析組由6 名具有豐富審評經驗的健康審評員組成，所有嗅聞人員對GC-O有較好的實驗基礎，并經過了至少30 h的標準品及實際茶樣培訓；在實驗過程中若至少有3 名評價員在同一嗅聞時間處得到相同的感官描述，則將該記錄記入最終結果，并進行相應的結構鑒定。感官評價員不僅要描述化合物的氣味性質，還要確定化合物的AI值。AI用數(shù)值“1～4”表示，“1”表示香氣強度弱，“2”表示香氣強度中等，“3”表示香氣強度強，“4”表示香氣強度非常強。取各審評人員的AI平均值作為最終數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

茶葉揮發(fā)性成分的定性通過：1）NIST標準譜庫自動檢索、與標準質譜數(shù)據(jù)比對（相似度＞75%）；2）結合化合物結構分析、排除干擾物質；3）保留指數(shù)（retention index，RI）驗證（計算值與報道值差值小于20）；4）部分重要化合物（如嗅感物質）的標準品驗證等步驟完成。揮發(fā)性化合物的相對含量采用峰面積歸一化法進行計算。柱狀圖采用Excel 2013（美國Microsoft公司）完成；PCA、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA 14.1軟件（瑞典Umetrics公司）完成，原始數(shù)據(jù)均采用unit variance scaling（UV）歸一化處理；非參數(shù)檢驗、單因素方差分析等統(tǒng)計學分析采用SPSS Statistics 20.0（美國IBM公司）完成；層次聚類分析使用MeV生物信息學分析軟件（美國Oracle公司）完成。

2 結果與分析

2.1 DHS分析方法的建立

為探明DHS-TD/GC-MS的最優(yōu)實驗條件，進行了如下單因素試驗，并對各實驗結果進行單因素方差分析。盡管茶湯的濃度與茶葉中蘊含的揮發(fā)性物質在一定范圍內呈正相關，但隨著茶葉用量的增加，茶湯里的溶質處于飽和狀態(tài)后，揮發(fā)性物質的含量增加變緩，甚至可能出現(xiàn)下降趨勢[23]。本實驗首先考察了茶葉用量（20～250 mg）對茶葉揮發(fā)性成分的影響，以統(tǒng)一的方法沖泡后，在其他條件一致的情況下，分別經過DHSTD/GC-MS提取并檢測后，以識別到的化合物（未精確定性）的總峰面積和數(shù)量評價萃取效果。如圖1A所示，當茶葉用量為200 mg時，所獲得的總峰面積最高（P＜0.05），化合物數(shù)量最多（P＜0.05），因此，茶葉用量為200 mg時DHS的萃取效率最佳。

圖1 各因素對DHS萃取效率的影響Fig.1 Effect of various factors on the extraction efficiency of DHS

溫度也是影響茶葉香氣的揮發(fā)及提取效率的一個關鍵因素[24]?；谧罴巡枞~用量，本實驗依次探究了不同捕集溫度及孵化溫度及對DHS萃取效率的影響。當捕集溫度為70 ℃時，總峰面積及化合物數(shù)量均顯著優(yōu)于其他溫度（P＜0.05，圖1B）；隨著孵化溫度的提高，總峰面積呈顯著下降趨勢，而化合物數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在75 ℃時最多，綜合考慮實驗結果，當孵化溫度為70 ℃時，萃取效率最高（圖1C）。

由于DHS萃取的核心操作原理是利用氣體動態(tài)吹掃樣品，從而使樣品中的揮發(fā)性物質被氣流源源不斷地帶入至具有吸附劑的捕集裝置中，因此吹掃的氣體總流量也是DHS的重要參數(shù)[25]。基于已經優(yōu)化好的上述參數(shù)，設置了300～600 mL的吹掃總量，考察相應的萃取效率。如圖1D所示，吹掃總流量對化合物的總峰面積具有一定顯著影響，對化合物數(shù)量無顯著影響（P＞0.05）。當吹掃總流量為350 mL時，總峰面積最高；當吹掃總流量為400 mL時，化合物數(shù)目略高于其他流量。綜合分析得出，DHS萃取方法的最佳吹掃總流量為350 mL。

當吹掃總流量固定后，DHS的吹掃速率決定了萃取時間，而萃取時間在一定程度上與茶葉香氣總量呈正比[26]。對DHS的吹掃速率進行優(yōu)化，結果如圖1E所示，隨著吹掃速率的不斷增加，總峰面積和化合物數(shù)量呈先降低后升高的趨勢。當吹掃速率為10 mL/min時，DHS萃取效率最高，對應的萃取時間為35 min。最后探究最優(yōu)干燥速率，如圖1F所示，隨著干燥速率的增加，總峰面積顯著降低。而干燥速率在10～50 mL/min時，化合物數(shù)量無顯著變化，當干燥速率升至75 mL/min時，化合物數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。因此，DHS萃取方法的最優(yōu)干燥速率為10 mL/min。

綜上，當茶葉用量為200 mg、捕集溫度為70 ℃、孵化溫度為70 ℃、吹掃總流量為350 mL、吹掃速率為10 mL/min、干燥速率為10 mL/min時，烘青綠茶揮發(fā)性成分的萃取效率最高，為DHS-TD/GC-MS的最優(yōu)實驗條件。

2.2 不同品種烘青綠茶的感官審評結果

為探究茶樹品種對茶葉揮發(fā)性成分的影響，選取3 個代表性茶樹品種（龍井43、中茶108、福鼎大白茶），以統(tǒng)一加工工藝制備成烘青綠茶，并通過感官審評衡量茶葉品質。3 個不同品種的烘青綠茶的感官審評結果如表1所示，可以發(fā)現(xiàn)，各項指標得分均在85.0～93.5之間，達到了優(yōu)良綠茶感官審評的標準，其中龍井43總體得分最高（90.9 分）。從香氣得分來看，3 個品種的烘青綠茶得分介于92.5～93.5之間，主要呈現(xiàn)“清香”“花香”“栗香”等香氣特征，具有較好的烘青綠茶的代表性。這3 種烘青綠茶香氣特征描述略有不同，龍井43、中茶108主要體現(xiàn)“清香”“花香”特征，但中茶108的“花香”更為明顯，而福鼎大白茶則略有“栗香”，這說明茶葉品種對烘青綠茶的香氣品質有著顯著影響，不同品種的烘青綠茶其化學成分的種類及含量存在差異，因此這也為后續(xù)GC-O實驗的開展奠定了良好的基礎。

表1 3 個不同品種烘青綠茶的感官審評結果Table 1 Sensory evaluation results of baked green teas made from three different varieties

2.3 不同品種烘青綠茶中的揮發(fā)性成分輪廓分析

采用優(yōu)化過的DHS-TD/GC-MS方法對3 個不同品種烘青綠茶的揮發(fā)性成分進行提取分析，并通過譜庫檢索、結構分析、RI驗證等方式進行定性，最終共鑒定出不同品種的烘青綠茶中的揮發(fā)性物質74 種，其中龍井43烘青綠茶74 種，中茶108烘青綠茶71 種，福鼎大白茶烘青綠茶74 種。根據(jù)揮發(fā)性化合物的化學結構可分為醇類19 種、烯類19 種、酯類11 種、醛類10 種、酮類9 種、芳香族化合物5 種以及含氮化合物1 種。采用峰面積歸一化法對這些物質進行相對定量分析。

相對定量分析結果表明，3 個品種的烘青綠茶的揮發(fā)性化合物種類相同，但在相對含量分布上具有一定差異。如圖2、表2所示，在3 種綠茶中，醇類化合物均占有最高比例，介于40%～43%之間，其中香葉醇均具有最高相對含量，介于9.36%～14.76%之間。醛類在龍井43及中茶108中的相對含量僅次于醇類，比例達20%及以上，顯著高于其他種類化合物，而在福鼎大白中含量與其他化合物類別差異不顯著；庚醛在3 種茶葉中均為醛類物質中相對含量最高的化合物，但含量差別迥異，介于3.63%～8.88%之間，在中茶108中最高，福鼎大白茶中最低。酯類和烯類化合物在3 種綠茶中的相對含量均大于等于10%，其中酯類在中茶108烘青綠茶中的相對含量占比最高（19%）；棕櫚酸甲酯（2.56%～7.53%）、檸檬烯（4.83%～6.34%）分別是酯類和烯類中相對含量最高的化合物。福鼎大白茶中酮類化合物的相對含量顯著高于其余兩個綠茶，其中苯乙酮（5.81%）和環(huán)己酮（3.28%）的相對含量最高，前者在中茶108綠茶中也為相對含量最高的酮類物質，但其相對含量僅為0.71%；而龍井43綠茶所含酮類化合物中相對含量最高的異亞丙基丙酮（1.53%）在其他兩種綠茶中相對含量較低。芳香族化合物中鄰異丙基甲苯在3 種綠茶中的相對含量也相對較高，介于1.27%～3.49%之間。此外，唯一的含氮化合物二丁基甲酰胺在福鼎大白茶中的相對含量顯著高于其他兩種茶，達8.50%。

表2 不同品種的烘青綠茶香氣的關鍵差異性成分含量Table 2 Contents of key differential aroma components in different baked green teas

圖2 龍井43（A）、中茶108（B）和福鼎大白茶（C）中的揮發(fā)性化合物含量比較Fig.2 Comparison of volatile compounds in LJ43 (A),ZC108 (B),and FDDB (C) tea samples

2.4 不同品種烘青綠茶中的關鍵差異性揮發(fā)性成分分析

為研究不同品種烘青綠茶間的香氣組成差異，基于上述揮發(fā)性成分的定量離子峰面積進行多元統(tǒng)計分析。PCA結果顯示，在得分圖中3 個不同品種的烘青綠茶樣品可以較好地被區(qū)分，其中中茶108及龍井43樣品較為接近，主要分布在第二、三象限，而福鼎大白茶分布在第四象限（圖3A），這表明3 種茶葉在香氣組成上具有較為明顯的差異，但前兩者化學物質基礎相對接近。接下來，采用有監(jiān)督的PLS-DA模型對揮發(fā)性成分進行進一步分析，獲得了理想的區(qū)分效果和理想的擬合參數(shù)（＝0.991，Q2＝0.927），3 種茶葉的樣品散點分別分布在第一（龍井43）、第三（福鼎大白茶）及第四（中茶108）象限（圖3B），分析結果表明，共有41 種揮發(fā)性成分的變量重要性因子（variable important for the projection，VIP）值＞1，可能是3 種烘青綠茶的潛在關鍵差異性揮發(fā)性成分。然而，上述PLS-DA模型的交叉驗證結果顯示雖然Q2與Y軸的截距小于0（-0.159），但R2與Y軸的截距較大（0.884）（圖3C，n＝200），存在一定的過擬合現(xiàn)象。為了排除干擾，進一步采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗對潛在的41 種關鍵差異性揮發(fā)性物質進行分析，共篩選出18 種化合物的含量在3 種綠茶中存在顯著性差異（P＜0.05），包括異亞丙基丙酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、3-蒥烯、2-乙基-1-己醇、苯乙酮、芳樟醇、二丁基甲酰胺、古巴烯、β-蓽澄茄油烯、3,5-杜松二烯、γ-衣蘭油烯、蓽澄茄醇、δ-杜松烯、菖蒲烯、蓽澄茄油烯及表蓽澄茄油烯醇。

圖3 不同品種烘青綠茶的PCA（A）、PLS-DA（B）得分圖及其驗證模型（C）Fig.3 PCA score plot (A),PLS-DA score plot (B) and permutation test plot (C) of baked green tea samples from different cultivars

為了更加形象直觀地呈現(xiàn)各揮發(fā)性香氣化合物在各茶葉樣本中的含量分布情況，采用層序聚類分析法對這18 種關鍵差異性揮發(fā)性的含量分布進行分析，結果如圖4所示。熱圖中方塊顏色越接近黃色說明化合物含量越高，而越接近藍色說明化合物含量越低，黑色為各樣品中相應化合物的含量中位數(shù)。根據(jù)分布趨勢，可將化合物分為3 類：1）異亞丙基丙酮及芳樟醇在龍井43烘青綠茶中的含量顯著高于其他兩類茶；2）2-乙基-1-己醇、蓽澄茄醇、γ-衣蘭油烯、3-蒥烯、二丁基甲酰胺、菖蒲烯、β-蓽澄茄油烯、3,5-杜松二烯、δ-杜松烯、蓽澄茄油烯在福鼎大白茶的分布最為豐富，在龍井43中也具有較高含量，而中茶108烘青綠茶中含量顯著較低；3）6-甲基-5-庚烯-2-酮、辛醛、環(huán)己酮、苯乙酮、古巴烯、表蓽澄茄油烯醇僅在福鼎大白茶中具有最高含量，而在其余兩種烘青綠茶中的含量顯著低于前者。以上化合物的鑒定為不同品種烘青綠茶的品質判別提供了新的技術思路，也為高香綠茶的香氣品質形成機理研究奠定了理論基礎。

圖4 不同品種烘青綠茶間關鍵差異性揮發(fā)性化合物的含量分布熱圖Fig.4 Heatmap of the contents of key differential volatile components among baked green tea samples from different cultivars

2.5 不同品種烘青綠茶中的嗅感物質分析

為查明各烘青綠茶中對香氣品質形成具有直接貢獻的嗅感物質組成，進一步采用DHS-TD/GC-O-MS對烘青綠茶的香氣提取物進行分析，如表3所示，從3 種茶葉樣品中共鑒定出28 種嗅感物質，其中龍井43中28 種，中茶108中26 種，福鼎大白茶中28 種。

表3 3 種烘青綠茶中嗅感物質的氣味特征及強度Table 3 Odor descriptions and aroma intensities of odorants in three types of baked green tea

如表3所示，上述28 種嗅感物質根據(jù)氣味屬性可以分為青香、清新、花果香、草本香、木香、甜香及其他。其中青香、清新型化合物有9 種，數(shù)目最多；花果香和草本香、木香化合物數(shù)目次之，均為8 種；而甜香及其他化合物數(shù)目最少，只有1～2 種。在AI總和方面，3 種綠茶呈現(xiàn)出龍井43（68.59）＞福鼎大白茶（65.26）＞中茶108（50.50）的排列順序。3 種綠茶中不同香氣屬性的分布情況如圖5所示，它們的香氣輪廓相似度較高，均呈現(xiàn)出花果香屬性最高（18.00～23.75），青香、清新屬性次之（13.58～21.25）的分布趨勢，且兩種屬性中均是在龍井43中最高，中茶108最低。草本香、木香屬性在福鼎大白茶中的貢獻最為突出（18.09），在龍井43綠茶中該數(shù)值也較為接近（17.17），在中茶108中顯著低于其他兩種茶葉（13.17）。由于甜香及其他屬性的化合物個數(shù)較少，導致其AI數(shù)值均低于10，其中甜香屬性呈現(xiàn)出福鼎大白茶＞中茶108＞龍井43的趨勢，而其他屬性呈現(xiàn)出龍井43＞中茶108＞福鼎大白茶的趨勢。

圖5 3 種烘青綠茶嗅感物質的氣味屬性雷達圖Fig.5 Radar map of odor attributes of odorants in three baked green tea samples

β-月桂烯（青氣、鐵銹）是龍井43和中茶108烘青綠茶中香氣強度最高的青香型化合物，但在前者中略高于后者。結合各茶樣的感官審評結果推測，該物質可能對龍井43及中茶108烘青綠茶的“清香”品質起到較大的促進作用。壬醛（清新、黃瓜、泥土）在龍井43中的香氣強度與β-月桂烯相同，在中茶108中的含量僅次于β-月桂烯。而福鼎大白茶烘青綠茶中，呈現(xiàn)青椒、辛辣、青氣特征的反式-3-己烯丁酸酯呈現(xiàn)最高的香氣強度，β-月桂烯次之。己醛（青葉香、青蘋果、青草氣）是3 種綠茶樣品中香氣強度均最低的具有青香特性的嗅感物質，AI值均低于2。此外，水楊酸甲酯（冬青油、薄荷）、香葉基丙酮（清新、新鮮、清香）等在龍井43和福鼎大白茶烘青綠茶中AI值尚可的嗅感物質在中茶108中未能被識別，這可能是導致中茶108綠茶“花香”屬性更為突出的間接原因。

在龍井43中，呈現(xiàn)花果香的化合物的香氣強度整體上顯著高于其他兩個品種。對龍井43花果香貢獻最大的是香葉醇（花香、玫瑰，3.50），該物質也是所有鑒定出來的嗅感物質中香氣強度最高的化合物，其次是苯乙醛（玫瑰香、蜜香，3.25）和芳樟醇（花香、清新，3.25），貢獻最小的是癸醛（花香、甜香，2.50）和苯甲酸異丁酯（玫瑰、濃膩，2.50）。對中茶108綠茶花果香屬性貢獻最大的嗅感物質是苯乙醛（3.00）和香葉醇（3.00），苯甲酸異丁酯、反式β-紫羅蘭酮（紫羅蘭、粉質花香、幽雅果香，2.50）次之，貢獻度最小的是3-十一烷酮（鳶尾花香、清香，1.25）。對福鼎大白茶花果香屬性貢獻度最大的嗅感物質是芳樟醇（3.25），辛醛（檸檬果香、花香、花蜜香）、苯乙醛、香葉醇次之，強度均為3.00，而貢獻度最低的是也是3-十一烷酮。雖然龍井43及中茶108烘青綠茶的總體香氣均呈現(xiàn)“花香”特性，但綜合GC-O-MS嗅聞結果可知，龍井43綠茶中的青香屬性物質也較為突出，可能與“花香”物質存在一定的香氣互作效應，從而導致其“花香”特性低于中茶108烘青綠茶。

草本香、木香氣味特征的化合物的香氣強度普遍弱于前兩種香氣屬性，其中順式呋喃型芳樟醇氧化物（草本、泥土，2.75）和β-環(huán)檸檬醛（草藥、草本，2.75）對龍井43烘青綠茶的草本香貢獻最明顯，反式吡喃型芳樟醇氧化物（草本、泥土）在中茶108和福鼎大白茶的草本香化合物中均具有最高的香氣強度值，分別為2.00和2.75。龍井43烘青綠茶中大部分草本香嗅感物質的AI值大于等于2.00，僅α-杜松醇的AI值為1.67；福鼎大白茶中草本類嗅感物質的香氣強度也普遍大于等于2.00，但β-環(huán)檸檬醛、雪松醇例外；相反，在中茶108烘青綠茶中僅反式吡喃型芳樟醇氧化物AI值達到2.00，其余嗅感物質的AI值介于1.50～1.75。

在3 個品種的綠茶樣品中共鑒定出的2 種具有甜香屬性的嗅感物質均為酯類，其中甲基苯甲酸甲酯在龍井43、中茶108和福鼎大白茶中均具有較強的香氣強度，是對甜香貢獻較大的物質。此外，在3 個品種的烘青綠茶中還鑒定出了具有熟香、油脂氣味的庚醛，且該物質在龍井43中的AI值（2.75）顯著高于另外兩種茶。

2.6 不同品種烘青綠茶中的關鍵差異性嗅感物質鑒定

綜合多元統(tǒng)計分析和嗅聞分析結果可知，芳樟醇、菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛醛是2 種分析結果中共同存在的化合物，可能是不同品種烘青綠茶中的潛在關鍵差異性嗅感物質。為了進一步探究不同品種烘青綠茶中關鍵差異性嗅感物質的含量與香氣強度之間的關系，將3 種烘青綠茶中上述化合物的定量離子峰面積與AI值進行了比對，結果如圖6所示。各化合物在不同茶樣中的含量及香氣強度基本呈現(xiàn)一致的分布趨勢，且它們在龍井43和福鼎大白茶中的含量及AI值均顯著高于中茶108。芳樟醇在龍井43和福鼎大白茶烘青綠茶中的香氣強度值相同，但其含量在龍井43綠茶中顯著高于另外2 種茶，被認為是龍井43中的特征性嗅感物質。菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮的峰面積和AI值均呈現(xiàn)出一致的“福鼎大白茶＞龍井43＞中茶108”分布趨勢；而辛醛的AI值在福鼎大白茶和龍井43中相同，但含量前者顯著高于后者，考慮是由于辛醛的氣味閾值較低[27]導致嗅聞的強度值普遍較高從而無法體現(xiàn)差異。因此，以上4 種化合物被認為是福鼎大白茶烘青綠茶中的特征性嗅感物質。由于感官審評結果中，福鼎大白茶烘青綠茶體現(xiàn)出了其他兩種綠茶未呈現(xiàn)的“栗香”，因此它們也可能是導致該香型的關鍵嗅感物質。

圖6 不同品種烘青綠茶中的關鍵差異性嗅感物質含量及AI的變化趨勢Fig.6 Trends in the contents and aroma intensities of key differential olfactory substances in roasted green teas made from different cultivars

由于本研究中不同品種的烘青綠茶是在一致條件下制備，因此以上關鍵嗅感物質的含量及AI值差異可能主要來源于品種本身的物質基礎差異。芳樟醇是茶葉中常見且最重要的香氣物質之一，主要以游離態(tài)和糖苷鍵合態(tài)的形式存在，游離態(tài)芳樟醇從鮮葉到攤放的過程中含量急劇升高，經高溫殺青后大量揮發(fā)，在成品綠茶中的含量顯著低于鮮葉[28]，糖苷鍵合態(tài)的芳樟醇主要以櫻草糖苷和葡萄糖苷最為常見，主要在采摘后水解酶活性尚未完全喪失的階段（如綠茶攤放、紅茶萎調及發(fā)酵等過程）經酶促反應轉化為游離態(tài)[29]。芳樟醇幾乎在所有種類的茶葉中均可被檢測到，而在龍井43炒青綠茶[30]及中茶108烘青綠茶中[31]均被報道為關鍵嗅感物質。菖蒲烯、δ-杜松烯是茶葉中常見的倍半萜類物質，含量上遠低于芳樟醇，其形成主要來源于茶樹中萜烯類化合物的生物合成途徑[32]，雖然在茶葉中經常被檢測出，但罕被報道為關鍵香氣物質。6-甲基-5-庚烯-2-酮是類胡蘿卜素衍生的香氣物質，主要來源于酶促降解途徑和非酶促氧化途徑，綠茶中酶促降解主要發(fā)生在攤放階段，而非酶促氧化途徑主要是自氧化反應及熱降解反應，往往發(fā)生在殺青、揉捻及干燥等過程中[33]。辛醛主要來源于脂肪酸途徑，其前體可能是α-亞麻酸、亞油酸等，在脂氧合酶及脂氫過氧化物裂解酶的作用下經多級裂解后生成，在各種茶葉中均可被檢測到[34]。

3 結論

本研究建立了烘青綠茶揮發(fā)性成分的最優(yōu)DHS-TD/GC-MS分析方法，當茶葉用量為200 mg、捕集溫度為70 ℃、孵化溫度為70 ℃、吹掃總流量為350 mL、吹掃速率為10 mL/min、干燥速率為10 mL/min時，揮發(fā)性成分的萃取效果最佳。繼而對3 種不同品種烘青綠茶的香氣成分進行分析，共鑒定出74 種化合物，包括醇類19 種、烯類19 種、酯類11 種、醛類10 種、酮類9 種、芳香族化合物5 種以及含氮化合物1 種。多元統(tǒng)計分析結果表明，3 個不同品種烘青綠茶中存在18 種關鍵差異性揮發(fā)性成分，如異亞丙基丙酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮等。進一步的DHS-TD/GC-O-MS分析結果表明，3 種烘青綠茶中存在28 種嗅感物質，如香葉醇、β-月桂烯、苯乙醛、反式-3-己烯丁酸酯等，主要呈現(xiàn)青香、清新、花果香、草本香、木香、甜香等氣味屬性，其中花果香屬性的香氣強度總和最高，青香、清新屬性次之。綜合多元統(tǒng)計分析及嗅聞分析結果發(fā)現(xiàn)，芳樟醇、菖蒲烯、δ-杜松烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮和辛醛是3 個不同品種烘青綠茶間的關鍵差異性嗅感物質，芳樟醇在龍井43烘青綠茶中貢獻顯著，而后四者對福鼎大白茶烘青綠茶的香氣品質形成貢獻顯著。后續(xù)將根據(jù)上述研究結果，對不同品種烘青綠茶的關鍵嗅感物質的形成機制進行研究，以期為高香綠茶品種選育、綠茶香氣品質的提升與調控奠定理論基礎。