發(fā)酵型枸杞酒關(guān)鍵香氣物質(zhì)分析

劉雅冉，李俊龍，谷佩珊，李若彤，朱保慶，張柏林,*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京 100176）

枸杞，是茄科（Solanaceae）、枸杞屬（Lycium）植物，人們?nèi)粘Ｊ褂煤退幱玫蔫坭阶哟蠖嗍菍幭蔫坭剑↙ycium barbarumL.）的果實(shí)，寧夏枸杞也是唯一載入《中華人民共和國藥典》（2020年版）的品種。自古以來，枸杞作為一種傳統(tǒng)的中藥材使用了數(shù)千年，被認(rèn)為具有延年益壽的功效。目前，從枸杞屬植物的不同部位中分離鑒定出的化學(xué)組分超過355 種[1]，包括多糖、類胡蘿卜素等多種活性成分[2]，具有多種保健功效，如抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。枸杞在儲(chǔ)存過程中容易變質(zhì)，發(fā)酵枸杞酒是一種既能保持枸杞營養(yǎng)價(jià)值，又能延長保質(zhì)期的常見方法。目前對(duì)枸杞酒釀造的相關(guān)研究多集中在發(fā)酵工藝的研究，包括原料的選擇[4]、發(fā)酵工藝條件的調(diào)整[5-7]、陳釀條件的調(diào)整[8]。

香氣是影響果酒產(chǎn)品和風(fēng)格的重要因素，在一定程度上決定了產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)值和消費(fèi)者的購買意愿。以往有關(guān)枸杞酒香氣物質(zhì)的研究大都通過香氣活度值（odor activity values，OAV）確定主要呈香組分，已經(jīng)鑒定過枸杞酒中主要的香氣化合物包括酯類、醇類、酸類、醛類、揮發(fā)性酚類、類異戊二烯化合物[4-6,8]。然而，隨著氣相色譜-質(zhì)譜嗅聞法（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）的發(fā)展，OAV與GC-MS-O分析技術(shù)結(jié)合廣泛用于解析果酒關(guān)鍵特征香氣組分的鑒定，更加能夠靶向性的挖掘果酒中潛在的香氣組分，解析香氣組分對(duì)果酒整體香氣貢獻(xiàn)的大小。同時(shí)，聯(lián)合香氣重構(gòu)技術(shù)進(jìn)一步明確果酒的關(guān)鍵呈香物質(zhì)，目前，該方法已廣泛應(yīng)用在櫻桃酒[9]、黑加侖酒[10]、葡萄酒[11]等多種果酒中關(guān)鍵呈香物質(zhì)的鑒定中。然而，在有關(guān)枸杞酒呈香組分的研究中，鮮少使用GC-MS-O分析技術(shù)明確枸杞酒的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。

目前，氣相色譜-四極桿質(zhì)譜（GC-quadrupole-MS，GC-qMS）是廣泛應(yīng)用于香氣組分定性定量的分析手段。但是，果酒中部分痕量揮發(fā)性香氣組分對(duì)果酒香氣也具有重要貢獻(xiàn)，它們的含量和閾值均相對(duì)較低，使用GCqMS無法對(duì)這些痕量揮發(fā)性香氣組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量。氣相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（gas chromatographyorbitrap-mass spectrometry，GC-Orbitrap-MS）技術(shù)其分辨率可達(dá)到60000（m/z210，半峰全寬），質(zhì)量精度可以達(dá)到10-6，靈敏度可以達(dá)到飛秒級(jí)，具有很高的分辨率和靈敏度[12-13]，在酒精飲料的揮發(fā)性組分鑒定分析中具有廣闊的應(yīng)用場(chǎng)景。目前，GC-Orbitrap-MS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在果酒[14-17]、辣椒[18]等食品的揮發(fā)性組分檢測(cè)分析中。

因此，本研究嘗試以商業(yè)化的枸杞酒（干果枸杞酒和鮮果枸杞酒）為材料，利用GC-MS-O聯(lián)合GC-qMS和GC-Orbitrap-MS技術(shù)系統(tǒng)剖析枸杞酒中香氣組成成分，并結(jié)合香氣重構(gòu)技術(shù)鑒定枸杞酒的關(guān)鍵呈香組分，旨在明確構(gòu)成枸杞酒典型香氣的主要呈香組分和風(fēng)味輪廓。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的枸杞酒來自于寧夏銀川森淼枸杞科技開發(fā)有限公司于2018年釀造的鮮果枸杞酒和干果枸杞酒，均使用Saccharomyces cerevisiaeRed fruit進(jìn)行發(fā)酵。收集樣品后，置于4 ℃條件下保存。

葡萄糖（分析純）、氫氧化鈉、酒石酸、氯化鈉、無水硫酸鈉 北京化學(xué)試劑公司；甲醇（色譜級(jí)）、乙醇、二氯甲烷 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；香氣標(biāo)準(zhǔn)品和正構(gòu)烷烴 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置 德國Glasbl?serei Bahr公司；DC-12型氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；CTC CombiPAL autosampler多功能自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC Analytic公司；DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國J&W Scientific公司；ODP2嗅辨儀瑞士Brechbühler公司；Trace 1300氣相色譜儀、Q-exact Orbitrap質(zhì)譜儀、TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）-溶劑輔助蒸發(fā)（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）-GC-MS-O分析

1.3.1.1 LLE-SAFE方法提取香氣物質(zhì)

用于GC-MS-O分析的樣品，使用LLE和SAFE提取濃縮揮發(fā)性香氣化合物[11]。具體操作步驟如下：在燒杯中先加入150 mL樣品，隨后加入80 mL二氯甲烷作為萃取劑，并加入NaCl至飽和，在磁力攪拌器上攪拌萃取10 min后，倒入分液漏斗中，取下層有機(jī)相，再用40 mL萃取劑重復(fù)萃取樣品兩次，最后合并3 次萃取的有機(jī)相和水相，用于后續(xù)SAFE實(shí)驗(yàn)。在搭好SAFE裝置之后，恒溫水浴鍋和超級(jí)恒溫水槽的溫度設(shè)置為35 ℃，在兩個(gè)冷肼中加入液氮，待系統(tǒng)的真空度達(dá)到1×10-4MPa時(shí)，緩慢地打開液漏斗旋塞，控制樣品液的流速，直至萃取完成。待SAFE裝置收集瓶中的提取液在室溫下自然融化后，加入1.5 g無水硫酸鈉干燥，將其過濾后采用氮吹將有機(jī)相濃縮至1 mL，用于后續(xù)GC-MS-O樣品的分析。

1.3.1.2 GC-MS-O分析

采用香氣提取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法對(duì)枸杞酒的關(guān)鍵香氣組分進(jìn)行鑒定。首先，由4 名具有半年以上培訓(xùn)經(jīng)驗(yàn)的聞香員對(duì)上述LLE-SAFE后的濃縮液進(jìn)行嗅聞辨析，確定香氣區(qū)域；然后將上述濃縮液按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的比例逐步稀釋，將每個(gè)稀釋后樣品注入1 μL進(jìn)樣口，由2 名具有半年以上培訓(xùn)經(jīng)驗(yàn)的聞香員在嗅聞口進(jìn)行嗅聞，直到聞香員嗅聞不到香氣為止，則保留該稀釋因子值作為香氣稀釋因子（flavor dilution，F(xiàn)D）值。

GC-MS-O分析參考Fang Yu等[19]的方法進(jìn)行分析。使用GC-MS聯(lián)用儀結(jié)合ODP2嗅聞儀進(jìn)行分析，具體條件如下：樣品以1 μL的進(jìn)樣量注入進(jìn)樣口，采用不分流的進(jìn)樣模式，使用氦氣作為載氣（純度＞99.999%），流速1 mL/min。經(jīng)過色譜柱的分離后，樣品以1∶1的比例分別進(jìn)入到嗅聞儀和質(zhì)譜中進(jìn)行檢測(cè)。色譜的升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min升溫至230 ℃，最后保持10 min。進(jìn)樣口和輔助加熱器的溫度250 ℃，質(zhì)譜使用電子電離，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～350。

1.3.2 香氣物質(zhì)定性與定量分析

采用GC-Orbitrap-MS和GC-qMS兩種分析方法進(jìn)行。

1.3.2.1 GC-Orbitrap-MS方法

采用頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）法對(duì)香氣化合物進(jìn)行富集提取[15]，HS-SPME的具體條件如下：在15 mL頂空進(jìn)樣瓶中加入1.00 g NaCl，再加入5 mL樣品，3 種內(nèi)標(biāo)化合物各10 μL（1.077 g/L 4-甲基-2-戊醇、0.590 g/L薄荷醇、0.133 g/L對(duì)氟苯甲醛），并用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊；然后，在加熱臺(tái)上60 ℃攪拌30 min，然后使用活化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入小瓶的頂部空間，吸附30 min進(jìn)行萃取；萃取后，取出萃取頭，立即插入GC進(jìn)樣口在250 ℃條件下解吸10 min。HS-SPME在TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器上進(jìn)行。

GC-Orbitrap-MS方法參考Liu Yaran等[15]的方法進(jìn)行分析。采用Trace 1300氣相色譜儀和Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀對(duì)香氣化合物進(jìn)行分析檢測(cè)，使用DB-WAX色譜柱，設(shè)定GC-Orbitrap-MS的條件如下：載氣流速為1.2 mL/min的高純氦氣（純度＞99.999%），升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min升溫至180 ℃，最后以3 ℃/min從180 ℃升溫至250 ℃并保持10 min，總時(shí)間為64 min；離子源溫度為280 ℃，電子電離，電離能為70 eV，質(zhì)譜接口溫度為230 ℃，掃描范圍為m/z33～300。

利用Liu Yaran等[15]建立的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)痕量香氣化合物進(jìn)行定性定量分析。

1.3.2.2 GC-qMS方法

利用HS-SPME法提取鑒定其他香氣化合物[20]。HS-SPME使用CTC CombiPAL autosampler多功能自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)性香氣組分進(jìn)行分析：在20 mL自動(dòng)頂空進(jìn)樣瓶中，加入1 g NaCl、5 mL樣品和10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2戊醇，1.0086 g/L），然后用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，樣品在恒溫加熱臺(tái)上平衡30 min，隨后將萃取頭插入頂空中萃取30 min，使用DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取。隨后將萃取頭插入到氣相色譜儀的進(jìn)樣口中，進(jìn)樣口溫度是250 ℃，解吸8 min。GC-qMS使用7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行分析，使用HP-INNOWAX色譜柱對(duì)化合物進(jìn)行分離，使用氦氣作為載氣（純度＞99.999%），流速設(shè)置為1 mL/min，采用不分流進(jìn)樣模式。色譜的升溫程序如下：初始溫度為50 ℃，保持1 min，隨后以3 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口和輔助加熱器的溫度是250 ℃，質(zhì)譜使用電子電離源電離（70 eV），離子源溫度是230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～350。

參考Liu Yaran等[20]的方法對(duì)香氣化合物進(jìn)行定性定量分析。在12%（V/V）的乙醇水溶液中加入6 g/L葡萄糖、2 g/L酒石酸，用NaOH將pH值調(diào)至4，然后將所有標(biāo)準(zhǔn)品母液混合，并將混合液用混合基質(zhì)稀釋成連續(xù)的12 個(gè)濃度水平，建立香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)香氣化合物定量分析。

1.3.3 香氣重構(gòu)實(shí)驗(yàn)

選用OAV＞1或者FD＞32的香氣物質(zhì)用于香氣重構(gòu)分析。根據(jù)枸杞酒的理化指標(biāo)配制模擬酒溶液，模擬酒溶液包含6 g/L酒石酸和2 g/L葡萄糖，使用NaOH調(diào)整pH值至4，用純水定容，添加各類香氣物質(zhì)。

1.3.4 香氣感官定量分析

定量描述性分析（quantitative descriptive analysis，QDA）品評(píng)小組的選拔及培訓(xùn)流程如圖1所示，面向北京林業(yè)大學(xué)生物學(xué)院招募約40 名評(píng)價(jià)員，根據(jù)GB/T 16291.11—2012《感官分析選拔、培訓(xùn)與管理評(píng)價(jià)員一般導(dǎo)則 第一部分：優(yōu)選評(píng)價(jià)員》對(duì)評(píng)價(jià)員進(jìn)行初步篩選，根據(jù)考核結(jié)果挑選10 名優(yōu)選評(píng)價(jià)員（2 男、8 女，年齡18～27 歲）進(jìn)行為期2 個(gè)月的定期培訓(xùn)（2 次/周，2 h/次）。培訓(xùn)內(nèi)容包括：香氣辨別訓(xùn)練、排序能力訓(xùn)練、參比樣培訓(xùn)訓(xùn)練、強(qiáng)度標(biāo)尺培訓(xùn)訓(xùn)練等。首先，10 名評(píng)價(jià)員進(jìn)行香氣辨別訓(xùn)練和排序能力訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后對(duì)評(píng)價(jià)員進(jìn)行測(cè)試，通過測(cè)試后開展后續(xù)培訓(xùn)。其次，將枸杞酒樣品提供給評(píng)價(jià)員，要求評(píng)價(jià)員對(duì)枸杞酒進(jìn)行獨(dú)立品評(píng)并記錄他們的描述詞。接下來，通過小組討論，確定枸杞酒的7 個(gè)香氣描述詞，包括枸杞香、杏桃香、蜂蜜香、焦糖香、甘草香、山楂香和甜瓜香。隨后，使用化合物標(biāo)準(zhǔn)品或者實(shí)物配制香氣參比樣，用于描述和評(píng)定每個(gè)香氣描述詞，經(jīng)過小組討論后，修正并挑選合適的香氣參比樣，最終的標(biāo)準(zhǔn)參比樣得到了評(píng)價(jià)小組所有成員的一致同意。將配制的香氣參比樣加入到真實(shí)枸杞酒酒樣中進(jìn)行訓(xùn)練，在訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行三點(diǎn)檢驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)員的能力進(jìn)行評(píng)估。最后，使用丁醇標(biāo)尺對(duì)評(píng)價(jià)員的強(qiáng)度打分進(jìn)行訓(xùn)練[21]，采用“0～9”丁醇標(biāo)尺對(duì)應(yīng)的濃度進(jìn)行評(píng)分，訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行排序檢驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)員的打分能力進(jìn)行評(píng)估。

圖1 QDA品評(píng)小組的選拔及培訓(xùn)流程Fig.1 Flow chart for the selection and training process of quantitative descriptive analysis panel

正式的QDA感官實(shí)驗(yàn)在品評(píng)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，每位評(píng)價(jià)員具有獨(dú)立的空間，環(huán)境溫度為25 ℃。枸杞酒和重構(gòu)液依次呈遞，每個(gè)樣品20 mL倒入透明的IOS品酒杯中，要求評(píng)價(jià)員按照“0～9”丁醇標(biāo)尺對(duì)枸杞酒的香氣屬性（枸杞香、杏桃香、蜂蜜香、焦糖香、甘草香、山楂香和甜瓜香）進(jìn)行打分。為避免感官疲勞，每個(gè)樣品之間休息2 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)樣品均進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定。枸杞酒中香氣物質(zhì)的單因素方差分析（ANOVA）使用R語言“agricolae”包完成，香氣物質(zhì)OAV的啞鈴圖使用“ggplot”包完成。香氣屬性強(qiáng)度的雷達(dá)圖使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于LLE-SAFE-GC-MS-O法鑒定的關(guān)鍵呈香物質(zhì)

為明確枸杞酒中的典型香氣組分，本研究采用AEDA-GC-MS-O技術(shù)鑒定兩種商業(yè)枸杞酒中的關(guān)鍵呈香物質(zhì)，結(jié)果詳見圖2。兩種枸杞酒（干果枸杞酒和鮮果枸杞酒）中共鑒定56 個(gè)香氣區(qū)域，其中43 個(gè)香氣區(qū)域能夠鑒定出香氣化合物，包括酯類、醇類、萜烯類、C13-降異戊二烯類、酸類、醛類、呋喃類、苯環(huán)類、揮發(fā)性酚類、吡咯類、內(nèi)酯類、硫化物類化合物，有13 個(gè)香氣區(qū)域無法鑒定具體化合物。在兩種枸杞酒中一致的有16 個(gè)香氣區(qū)域，主要是“甜香”“果香”“蜂蜜香”的香氣區(qū)域、還包括“醋香”“烤土豆香”“木香”“烘烤香”和“清香”，其中能夠鑒定出的化合物有乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、甲硫基丙醇、萘、苯甲醇、苯乙醇、2-乙酰吡咯、γ-十一內(nèi)酯、丁香酚和叔丁基對(duì)苯二酚。兩種枸杞酒的香氣區(qū)域存在一定差異，干果枸杞酒具有更多的“烘烤香”和“花香”等香氣區(qū)域，而鮮果枸杞酒中則包含更多的“清香”和“奶酪”的香氣區(qū)域。

圖2 干果枸杞酒和鮮果枸杞酒香氣化合物FD值的啞鈴圖Fig.2 Dumbbell plot of FD values of aroma compounds in goji berry wine made from dried or fresh goji berries

為評(píng)價(jià)GC-MS-O鑒定到的香氣物質(zhì)對(duì)兩款枸杞酒感官貢獻(xiàn)的重要性，計(jì)算了每個(gè)香氣區(qū)域的FD值。研究發(fā)現(xiàn)，干果枸杞酒中共有22 個(gè)香氣區(qū)域的FD≥64，其中有6 個(gè)香氣區(qū)域的FD值達(dá)到512，包括“菠蘿香”“果香”（2-甲基丁酸乙酯）、“溶劑香”“甜香”“菠蘿香”“奶酪香”（異戊醇）、“醋酸香”（乙酸）、“蜂蜜香”（愈創(chuàng)木酚）、“甜香”“蜂蜜香”“果香”（苯甲醇）、“花香”“玫瑰香”“冰激凌香”（δ-壬內(nèi)酯）。鮮果枸杞酒中共有18 個(gè)香氣區(qū)域的FD≥64，僅有4 個(gè)香氣區(qū)域的FD值達(dá)到512，分別是“烤土豆香”（甲硫基丙醇）、“蜂蜜香”“甜香”“果香”（苯甲醇）、“蜂蜜香”（苯乙醇）和“蜂蜜香”“奶酪香”（辛酸）。

枸杞酒中能夠貢獻(xiàn)“果香”香氣屬性的化合物主要是酯類化合物，特別是乙酯類化合物，包括乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯丙酸乙酯。這些化合物中2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯的FD值能達(dá)到256，說明這些化合物對(duì)枸杞酒的香氣都具有重要的貢獻(xiàn)作用除此之外，2,3-丁二醇在干果枸杞酒中的FD值達(dá)到256，是干果枸杞酒重要的香氣物質(zhì)。在鮮果枸杞酒中γ-十一內(nèi)酯和γ-十二內(nèi)酯均表現(xiàn)出“果香”的香氣屬性，γ-十一內(nèi)酯具有“果香”“蜂蜜香”“冰激凌香”的香氣，γ-十二內(nèi)酯表現(xiàn)出“杏桃香”的香氣屬性，這兩個(gè)化合物的FD值均達(dá)到256，是鮮果枸杞酒的重要香氣物質(zhì)。

兩款枸杞酒中鑒定的貢獻(xiàn)“甜香”“蜂蜜香”“焦糖香”和“干果香”的物質(zhì)包括揮發(fā)性酚類（愈創(chuàng)木酚和丁香酚）、內(nèi)酯類化合物（δ-壬內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯和δ-十二內(nèi)酯）、醇類化合物（異戊醇、2-乙基-1-己醇、苯甲醇和苯乙醇）、癸酸乙酯、苯甲醛、2-吡咯、辛酸。干果枸杞酒中有8 個(gè)“甜香”“蜂蜜香”“焦糖香”和“干果香”的香氣區(qū)域FD值達(dá)到256及以上，能夠鑒定出的化合物包括2 種酚類化合物（愈創(chuàng)木酚和丁香酚）、3 種醇類化合物（異戊醇、苯甲醇和苯乙醇）、2-吡咯和δ-壬內(nèi)酯。鮮果枸杞酒中僅有5 個(gè)“甜香”“蜂蜜香”“焦糖香”和“干果香”的香氣區(qū)域達(dá)到256及以上，包括3 種醇類化合物（異戊醇、苯乙醇和苯甲醇）、辛酸和γ-十一內(nèi)酯。以往的研究中，使用GC-MS-O技術(shù)常常能在不同果酒中鑒定到愈創(chuàng)木酚、丁香酚這類揮發(fā)性酚類化合物，許多學(xué)者認(rèn)為，這些酚類化合物大都來源于橡木制品[22]。盡管在一些未經(jīng)過橡木處理的果酒中也曾鑒定到揮發(fā)性酚類化合物，但其FD值并不高，未被認(rèn)為是果酒中關(guān)鍵的香氣貢獻(xiàn)物質(zhì)[23-24]。由于本研究所使用的兩款商業(yè)枸杞酒在釀造過程中并未使用橡木制品進(jìn)行處理，因此可以推測(cè)枸杞酒中的揮發(fā)性酚類化合物可能來源于枸杞原料或者是微生物代謝產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，內(nèi)酯類化合物在釀造過程中的化學(xué)或生物合成基質(zhì)尚不清晰，少部分可能來源于原料，但大部分在酒精發(fā)酵階段形成[25-27]。目前為止，枸杞原料中尚未報(bào)道含有內(nèi)酯類化合物[28-29]，因此枸杞酒中這些內(nèi)酯類化合物的產(chǎn)生途徑還有待進(jìn)一步研究證明。

“清香”“木香”也是兩種商業(yè)枸杞酒中的香氣屬性，鑒定出的化合物包括異丁醇、異松油烯、乳酸乙酯、1-甲氧基-2-丁醇和萘。兩種枸杞酒中鑒定出4 個(gè)“烘烤香”“煙熏香”“草本香”的香氣區(qū)域，其中能夠鑒定出2 種揮發(fā)性酚類化合物4-烷丙基苯酚和叔丁基對(duì)苯二酚。枸杞酒中的“溶劑味”是異戊醇和丙酸貢獻(xiàn)的，其中異戊醇在干果枸杞酒和鮮果枸杞酒中FD值分別是512和256，丙酸在鮮果枸杞酒中的FD值是128，但對(duì)干果枸杞酒的香氣沒有貢獻(xiàn)。除此之外，乙酸（醋酸香）也是兩種枸杞酒的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，在干果枸杞酒和鮮果枸杞酒中的FD值分別是512和256。甲硫基丙醇常貢獻(xiàn)“烤土豆香”的香氣屬性[30]，在兩種枸杞酒中的FD值均達(dá)到256及以上。據(jù)報(bào)道，在果酒釀造過程中，酵母能夠利用蛋氨酸產(chǎn)生甲硫基丙醇[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，具有“烤土豆香”的化合物能夠增加冰葡萄酒中的“杏桃”“焦糖”和“熱帶水果”的香氣屬性[24]，因此可以推測(cè)本研究中的甲硫基丙醇可能通過香氣物質(zhì)的交互作用增強(qiáng)枸杞酒中的“果香”和“焦糖香”的香氣屬性。

2.2 基于OAV分析鑒定關(guān)鍵呈香物質(zhì)

通過上述的LLE-SAFE-GC-MS-O技術(shù)鑒定兩種商業(yè)枸杞酒的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，但該技術(shù)無法評(píng)估枸杞酒基質(zhì)對(duì)香氣物質(zhì)呈香的影響，進(jìn)一步利用HS-SPME技術(shù)聯(lián)合GC-qMS和GC-Orbitrap-MS技術(shù)完成重要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的定量分析，并計(jì)算相應(yīng)的OAV。如表1所示，兩種商業(yè)枸杞酒中共檢測(cè)到173 種香氣化合物，其中使用GC-Orbitrap-MS檢測(cè)到24 種化合物，使用GC-qMS檢測(cè)到149 種香氣化合物。通過查閱化合物的香氣閾值并計(jì)算OAV[30]，共有29 種香氣化合物能夠達(dá)到香氣閾值（圖3），包括酯類、醇類、類異戊二烯、酸類、揮發(fā)性酚類、內(nèi)酯類、吡嗪類、硫化物。其中，干果枸杞酒中有27 種香氣化合物的OAV＞1，鮮果枸杞酒中有23 種香氣化合物的OAV＞1。

表1 枸杞酒中香氣物質(zhì)的含量Table 1 Concentrations of aroma compounds in goji berry wine

圖3 干果枸杞酒和鮮果枸杞酒香氣化合物OAV啞鈴圖Fig.3 Dumbbell plot of odor activity values of aroma compounds in goji berry wine made from dried or fresh goji berries

在乙醇發(fā)酵過程中，酯類化合物是酵母代謝的重要產(chǎn)物之一，能夠賦予果酒“果香”“甜香”等愉悅的香氣屬性[32]。在本研究的兩種商業(yè)枸杞酒中，能夠達(dá)到香氣閾值種類最多的化合物是酯類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，共有12 種酯類化合物的OAV在兩種枸杞酒中均大于1。在酯類化合物中，如圖3所示，OAV最高的化合物是3 個(gè)乙酯類化合物，分別是辛酸乙酯、2-己烯酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯。其中，辛酸乙酯的OAV最高，在干果枸杞酒和鮮果枸杞酒中分別是307和275，2-己烯酸乙酯在鮮果枸杞酒中的OAV較高（OAV＝219），2-甲基丁酸乙酯在干果枸杞酒中的OAV較高（OAV＝83）。乙酯類化合物大多數(shù)是在發(fā)酵過程中通過羧酸類的酶促或非酶促酯化反應(yīng)形成的[33]，是果酒中常見的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。除此之外，肉桂酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乳酸異戊酯和癸酸乙酯在兩種商業(yè)枸杞酒中的OAV也均大于1。肉桂酸乙酯和乳酸異戊酯在兩種枸杞酒中OAV具有差異（圖3），肉桂酸乙酯在鮮果枸杞酒中OAV較大，而乳酸異戊酯在干果枸杞酒中OAV較大。酯類化合物，特別是乙酯類化合物，是枸杞酒中的重要組分。在以往枸杞酒的研究中，乙酯類化合物也具有較高的OAV[4-6,8]，與本研究的結(jié)果基本一致。酯類化合物大多貢獻(xiàn)“果香”和“甜香”香氣屬性，賦予果酒令人愉悅的香氣。

醇類化合物作為酵母氨基酸代謝的副產(chǎn)物，常見于所有的乙醇發(fā)酵產(chǎn)品中[34]。醇類化合物的香氣閾值較高，往往能達(dá)到mg/L[35]，因此在兩種枸杞酒中，僅有4 種醇類化合物能夠達(dá)到相應(yīng)的香氣閾值。其中1-辛烯-3-醇在兩種枸杞酒中的OAV均大于1，能夠貢獻(xiàn)“果香”“草本香”的香氣屬性[36]。異丁醇、異戊醇和苯乙醇在干果枸杞酒中能夠達(dá)到香氣閾值，主要貢獻(xiàn)“花香”“清香”和“指甲油”的香氣屬性[36]。

具有“花香”“丁香”“糖果”香氣屬性的丁香酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚在兩種枸杞酒中均能夠達(dá)到香氣閾值，其中丁香酚在干果枸杞酒中的OAV較高，4-乙基愈創(chuàng)木酚在鮮果枸杞酒中的OAV較高，這類化合物可能是乙醇發(fā)酵過程中酚酸類化合物降解產(chǎn)生的[34]。內(nèi)酯類化合物具有“椰子香”的香氣屬性[36]，γ-辛內(nèi)酯在鮮果枸杞酒中達(dá)到香氣閾值，而γ-癸內(nèi)酯在干果枸杞酒中達(dá)到香氣閾值，賦予枸杞酒“果香”和“甜香”的香氣屬性。揮發(fā)性酚類化合物和苯環(huán)類化合物主要包括4-乙基愈創(chuàng)木酚、丁香酚、萘和苯乙醇，這些化合物主要貢獻(xiàn)的也是“果香”和“甜香”的香氣屬性，這些化合物大多也是在乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)生的[34]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞酒中含有高OAV的C13-降異戊二烯類化合物，包括β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮和α-紫羅蘭酮。這3 種C13-降異戊二烯類化合物在兩種枸杞酒中均能達(dá)到香氣閾值，其中β-大馬士酮和α-紫羅蘭酮在干果枸杞酒中的OAV較高，β-紫羅蘭酮在鮮果枸杞酒中的OAV較高。如圖3所示，β-大馬士酮的閾值相對(duì)較低，因此枸杞酒中該化合物的OAV遠(yuǎn)高于其他化合物，賦予枸杞酒“甜香”的香氣屬性。C13-降異戊二烯類化合物主要來源于類胡蘿卜素的降解[37]，其中一部分來源于類胡蘿卜素，如β-類胡蘿卜素和新黃質(zhì)的直接降解，還有一部分可能來源于以糖苷態(tài)形式存在的類胡蘿卜素，在發(fā)酵過程中釋放出結(jié)合態(tài)的C13-降異戊二烯類，然后在酶或者酸的水解作用下生成C13-降異戊二烯類。枸杞中含有豐富的類胡蘿卜素[2]，在發(fā)酵過程中可以降解產(chǎn)生大量的C13-降異戊二烯類。以往的研究結(jié)果也表明，C13-降異戊二烯類是枸杞酒的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[4,6]，這類化合物主要賦予枸杞酒“果香”的香氣屬性。

除上述化合物之外，甲硫基丙醇和辛酸在兩種枸杞酒中也均能達(dá)到香氣閾值，干果枸杞酒中兩種化合物的OAV分別是3和5，鮮果枸杞酒中兩種化合物的OAV分別是4和3。乙酸和2-異丁基-3-甲氧基吡嗪在干果枸杞酒中也能夠達(dá)到香氣閾值，OAV分別是1和4，分別貢獻(xiàn)枸杞酒“醋酸”和“青椒”的香氣屬性。

2.3 香氣重構(gòu)分析

綜上所述，干果枸杞酒中共有22 種FD≥64的化合物、27 種OAV＞1的化合物，將這些化合物合并后，除乙酸外干果枸杞酒中共有35 種關(guān)鍵呈香組分，由于2-己烯酸乙酯、α-紫羅蘭酮、1,3-丙二醇二乙酸酯和叔丁基對(duì)苯二酚無法購買到香氣標(biāo)準(zhǔn)品，愈創(chuàng)木酚無法達(dá)到定量限，在干果重構(gòu)液中共加入30 種香氣物質(zhì)（表2）；鮮果枸杞酒中共有18 種FD≥64的化合物、23 種OAV＞1的化合物，合并后，除乙酸外鮮果枸杞酒中共有32 種關(guān)鍵呈香組分，由于2-己烯酸乙酯、α-紫羅蘭酮和叔丁基對(duì)苯二酚無法購買到香氣標(biāo)準(zhǔn)品，丙酸無法達(dá)到定量限，在鮮果重構(gòu)液中共加入28 種香氣物質(zhì)（表2）。

表2 重構(gòu)實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)香氣化合物的添加量Table 2 Concentrations of target aroma compounds included in aroma reconstitution test

為證實(shí)利用GC-MS-O和OAV鑒定到的香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)，使用上述枸杞酒中鑒定的FD≥64或OAV＞1的化合物配制重構(gòu)溶液。根據(jù)枸杞酒的理化指標(biāo)配制相應(yīng)的模擬溶液，并按照表2中的含量添加香氣物質(zhì)，配制成干果枸杞酒的重構(gòu)液和鮮果枸杞酒的重構(gòu)液。由前期建立的感官評(píng)價(jià)小組對(duì)枸杞酒的7 個(gè)香氣屬性“枸杞香”“甜瓜香”“山楂香”“杏桃香”“焦糖香”“蜂蜜香”和“甘草香”。圖4的結(jié)果顯示，兩款枸杞酒和相應(yīng)重構(gòu)液的“山楂香”“杏桃香”“焦糖香”“蜂蜜香”和“甘草香”香氣強(qiáng)度趨勢(shì)較為一致，兩種枸杞酒均表現(xiàn)出較強(qiáng)的“蜂蜜香”，干果枸杞酒的“焦糖香”更加突出，而鮮果枸杞酒的“杏桃香”香氣強(qiáng)度較高。此外，兩個(gè)枸杞酒的“枸杞香”和“甜瓜香”強(qiáng)度較高，但與重構(gòu)液的香氣強(qiáng)度表現(xiàn)不一致。此外，在13 個(gè)香氣區(qū)域無法進(jìn)行化合物的鑒定，其中包括了未知化合物1368、未知化合物1698和未知化合物1714等FD值超過128的關(guān)鍵化合物，而且在本研究中采用水醇溶液作為模擬基質(zhì)，這些可能導(dǎo)致枸杞酒與重構(gòu)溶液的香氣強(qiáng)度存在差異。針對(duì)這些未定性的痕量、低閾值的化合物，可能需要不同的儀器分析設(shè)備進(jìn)行定性定量分析。

圖4 枸杞酒及其相應(yīng)重構(gòu)溶液的定量感官分析Fig.4 Radar plots of aroma attributes in goji berry wine and aroma reconstitution samples

3 結(jié)論

本研究以商業(yè)化的枸杞酒為材料，利用GC-MS-O結(jié)合GC-qMS和GC-Orbitrap-MS聯(lián)用技術(shù)，系統(tǒng)剖析了枸杞酒中的關(guān)鍵呈香組分，研究表明：干果枸杞酒中FD≥64的關(guān)鍵呈香組分有22 種化合物，OAV＞1的香氣物質(zhì)有27 種；鮮果枸杞酒中的關(guān)鍵呈香組分有18 種化合物，OAV＞1的香氣物質(zhì)有23 種。通過香氣重構(gòu)技術(shù)和感官定量分析基本證實(shí)了干果枸杞酒和鮮果枸杞酒的關(guān)鍵呈香物質(zhì)分別是30 種和28 種，但是“枸杞香”和“甜瓜香”香氣強(qiáng)度顯著低于原酒，還有待進(jìn)一步研究。本研究的開展對(duì)枸杞酒中的關(guān)鍵呈香組分進(jìn)行了鑒定，同時(shí)解析了枸杞酒的香氣輪廓，為枸杞酒香氣品質(zhì)的提升提供了方向，同時(shí)有助于枸杞酒的真?zhèn)舞b別，為枸杞酒相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。