谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對板栗粉面團理化特性的影響

李 濤，周 立，徐園杰，袁松凱，曹艷廣，郝建雄，劉俊果,*

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.石家莊市丸京干果有限公司，河北 石家莊 051230）

板栗，屬于殼斗科，是我國受歡迎的季節(jié)性堅果，在河北、山東等地廣泛種植。板栗品質(zhì)優(yōu)良，含有淀粉、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、抗壞血酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，其營養(yǎng)價值高，口感甘甜，具有巨大的經(jīng)濟效益，被譽為“木本谷物”[2]。乳糜瀉（coeliac disease，CD）又稱麩質(zhì)過敏癥，是指食用含有麩質(zhì)蛋白（谷蛋白）的食物而引發(fā)的自身免疫性疾病，它可引起小腸黏膜結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致營養(yǎng)吸收受損、腹瀉和體質(zhì)量減輕[3]。到目前為止，對CD患者的治療方法是嚴(yán)格遵循無麩質(zhì)飲食[4]，一般可以安全食用谷蛋白含量低于20 mg/kg的食品[5]。世界范圍內(nèi)大約有5%～10%的人口需要終生食用無麩質(zhì)食品[6]。但是無麩質(zhì)食物由于缺乏面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而存在品質(zhì)和加工性能較差的問題。板栗作為一種無麩質(zhì)且含有膳食纖維的食品，無法形成類似于小麥面團中的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其加工性能差。因此，為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的板栗食品，有必要對板栗面團進(jìn)行品質(zhì)改良。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（glutamine transaminase，TG）是一種能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)的酶[7]，負(fù)責(zé)與肽（?；w）結(jié)合的谷氨酰胺殘基γ-羧酰胺基和各種伯胺（酰基受體）之間?；ɑ蝓；糠郑┑霓D(zhuǎn)移，包括蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基[8]，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，改善食品的質(zhì)構(gòu)。TG在面團中可以促進(jìn)谷氨酰胺和賴氨酸殘基的分子間或分子內(nèi)交聯(lián)，形成高分子質(zhì)量的面筋[9]。陳圓圓等[10]將TG用于改善黑小麥面團的理化特性，發(fā)現(xiàn)TG添加量為1.1%時改善效果最佳，添加量過多會導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度交聯(lián)，淀粉顆粒暴露，面團強度和穩(wěn)定性下降。Huang Weining等[11]研究TG對燕麥面團流變學(xué)和熱機械特性的影響，結(jié)果表明TG對燕麥面團的吸水率、黏彈性和熱穩(wěn)定性有明顯的影響，TG處理后游離氨基的數(shù)量減少，證實了TG催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的作用。尹賀偉等[12]研究了TG對青稞面團質(zhì)構(gòu)特性和流變特性的影響，結(jié)果表明TG的添加可以增加青稞面團的硬度、彈性等質(zhì)構(gòu)特性，提供青稞面團延伸所需要的黏結(jié)力，使青稞面團內(nèi)部結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，同時，TG的添加使青稞面團抵抗外界形變的能力變強，恢復(fù)力變好，青稞粉凝膠的強度降低。而TG對板栗的作用鮮見報道。

因此本實驗著重探討TG對板栗粉面團物理特性包括糊化特性、質(zhì)構(gòu)特性、流變學(xué)特性的影響，并從化學(xué)性質(zhì)游離巰基含量的變化以及微觀結(jié)構(gòu)的角度給予解釋，旨在為開發(fā)板栗食品、提高其食用品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗仁：遷西板栗 市售。

1.2 儀器與設(shè)備

HAAKE Mars 40型高級旋轉(zhuǎn)流變儀 賽默飛世爾科技有限公司；TA.XT plus型質(zhì)構(gòu)儀 廈門超技儀器設(shè)備有限公司；RVA-Tec Master型快速黏度分析儀 瑞典波通儀器公司；FD-1A-50型真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；QL-901型渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；752型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；H-1650型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；S-4800型高分辨率掃描電鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗面團的制備

參考Gharst等[13]的方法并稍作修改。將板栗仁切片粗粉碎后進(jìn)行冷凍干燥，干燥完全后取出充分研磨粉碎制得板栗粉。取3 g板栗粉中分別添加0、0.9、1.8、2.7、3.6 U/g（按板栗全粉質(zhì)量計）TG，渦旋混勻制備成混合粉。緩慢加入板栗粉70%的40 ℃溫水，攪拌和面5 min，取出面團用保鮮膜包裹靜置60 min，待測。

1.3.2 板栗面團質(zhì)構(gòu)特性的測定

取靜置好的板栗面團搓成圓球狀，上質(zhì)構(gòu)儀對面團進(jìn)行測試，每組樣品測試3 個面團。測定參數(shù)：探頭P/5，測前、測中、測后速率分別為2.0、1.0 mm/s和1.0 mm/s，壓縮形變比例為30%，觸發(fā)力為3 g，2 次壓縮時間間隔5.0 s，測定其硬度、彈性、咀嚼性和回復(fù)性等質(zhì)構(gòu)特性并進(jìn)行評價。

1.3.3 板栗面團動態(tài)流變特性的測定

一是創(chuàng)立 “政產(chǎn)學(xué)研用媒”人才培養(yǎng)模式。特別是各高校、培訓(xùn)單位等應(yīng)根據(jù)旅游電子商務(wù)專業(yè)特性，采用“政產(chǎn)學(xué)研用媒”融合互動模式，開設(shè)特色課程，建立實訓(xùn)教學(xué)體系，實施進(jìn)階式的應(yīng)用型人才培養(yǎng)模式改革。二是實踐培訓(xùn)和理論教育兩手抓。扶貧先扶志，更要扶智。各高校、各級培訓(xùn)機構(gòu)應(yīng)借助自身師資力量與實踐資源優(yōu)勢，對鄉(xiāng)村旅游電商實踐培訓(xùn)和理論教育兩手抓，構(gòu)建“專家指導(dǎo)云”和“兼職教師信息庫”，逐步形成基礎(chǔ)知識培訓(xùn)任務(wù)由鄉(xiāng)村兼職教師承擔(dān)、專業(yè)知識講座由高校教師講授的格局。根據(jù)不同鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)、旅游電子商務(wù)發(fā)展的特點和要求，創(chuàng)新鄉(xiāng)村旅游電商人才本地培養(yǎng)和委托培養(yǎng)的途徑。

參考Han Hu等[14]的方法并稍作修改。取3 g靜置好的板栗面團搓圓后放到流變儀測試圓盤中間進(jìn)行測定。測試探頭選取P 35/Ti，板間距設(shè)置為2 mm，刮掉多余樣品，在夾具邊緣涂少許甘油以防止面團邊緣的水分揮發(fā)。測試程序設(shè)置如下：頻率變化范圍為0.1～10.0 Hz，溫度為25 ℃，應(yīng)變?yōu)?.1%。最終根據(jù)所測數(shù)據(jù)繪出板栗面團的儲能模量G′、損耗模量G″及損耗因子tanδ隨頻率變化的曲線圖。

1.3.4 板栗面團蠕變-恢復(fù)特性測定

樣品制備同1.3.1節(jié)。測試探頭選取P 35/Ti，板間距為2 mm，刮掉多余樣品，在夾具邊緣涂少許甘油以防止面團邊緣的水分揮發(fā)。測定程序設(shè)置恒定應(yīng)力50 Pa，掃描時間150 s，之后移除應(yīng)力觀察樣品在300 s內(nèi)的應(yīng)力恢復(fù)情況。

1.3.5 混合粉糊化特性的測定

參考GB/T 24853—2010《小麥、黑麥及其粉類和淀粉糊化特性測定 快速粘度儀法》，每份樣品精確稱取3 g至干燥潔凈樣品筒，精確加入25 mL去離子水，用塑料攪拌槳快速攪拌分散，將樣品筒放入快速黏度分析儀中檢測其成糊特性。

1.3.6 游離巰基的測定

參考Yang Yuling[15]和Beveridge[16]等的方法并稍作修改測游離巰基的含量。將按1.3.1節(jié)制備好的面團真空冷凍干燥36 h，研磨粉碎后取100 mg的凍干樣品粉末，加入10 mL的緩沖液（10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、8 mol/L尿素、5 mol/L鹽酸胍、1.5 g/100 mL EDTA），調(diào)節(jié)pH值至8.0，充分混合60 min，將200 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)試劑（0.1 g/100 mL）與5 mL樣品溶液混合30 min，以5000 r/min離心10 min，使用紫外分光光度儀在412 nm處測定上清液的吸光度，以不加5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)的試劑為空白對照，按下式計算游離巰基含量：

式中：73.53為5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)試劑在pH 8.0時的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；A412nm為412 nm處的吸光度；D為稀釋因子，為5.02；ρ為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察

將按1.3.1節(jié)制備好的面團先放冰箱凍12 h，取出后真空冷凍干燥24 h，將凍干面團掰成小塊，斷面向上用導(dǎo)電膠固定在操作臺上，真空鍍金處理后置于掃描電鏡觀察艙內(nèi)，觀察樣品斷面的表面結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計整理，用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG對板栗面團質(zhì)構(gòu)特性的影響

硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性可以直觀體現(xiàn)板栗面團的質(zhì)構(gòu)特性。其中硬度是最直觀的指標(biāo)，彈性可以反映面團壓縮后復(fù)原的程度及強弱，黏聚性可以反映面團分子間結(jié)合力的大小[17]，咀嚼性跟咀嚼時間和咀嚼次數(shù)相關(guān)，回復(fù)性可以反映面團形變后恢復(fù)的能力[18]。

如表1所示，隨著TG添加量的增加，板栗面團的硬度不斷增加，彈性、黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)TG添加量達(dá)到2.7 U/g時，板栗面團的彈性、黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性都達(dá)到最大，可能是由于TG的加入使得板栗面團的淀粉面筋結(jié)構(gòu)變的緊密，面團結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后彈性相對增強，從而其咀嚼性和回復(fù)性都有顯著增加。當(dāng)TG添加量達(dá)到3.6 U/g時，其彈性、黏聚性、咀嚼性和回復(fù)性都有降低的趨勢，可能由于面筋網(wǎng)絡(luò)過度緊密，板栗面團內(nèi)部的淀粉和纖維暴露導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不連續(xù)或不均勻。

表1 TG添加量對板栗面團質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of TG addition on the texture characteristics of chestnut dough

2.2 TG對板栗面團流變特性的影響

由圖1a和1b可知，不同TG添加量的板栗面團G′和G″均隨掃描頻率的增加而增大，即所有樣品的G′和G″均表現(xiàn)出頻率依賴性。隨頻率的增加，所有面團樣品的G′始終高于G″，表明面團具有固體類彈性性質(zhì)[19]。隨TG添加量的增大，G′和G″均呈先升后降的趨勢，在TG添加量為2.7 U/g時板栗粉面團具有最高的G′和G″，這表明TG可明顯提高板栗粉面團黏彈性，可能是因為TG促進(jìn)板栗粉面團中蛋白質(zhì)分子交聯(lián)聚集，增強面團強度，改善面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在一定程度上減小了板栗面團中纖維對蛋白質(zhì)交聯(lián)的干擾作用，但當(dāng)TG添加過量時會導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度交聯(lián)聚集，部分淀粉顆粒被迫暴露，不利于面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和緊密性，黏彈性會有所下降。

圖1 不同TG添加量的板栗面團頻率掃描曲線Fig.1 Effect of TG addition on the rheological properties of chestnut dough

tanδ越大表明材料的黏性越大，tanδ越小表明樣品彈性越大，且可以反映面團整體彈性和強度的增加[20]。由圖1c可知，所有面團樣品均tanδ＜1，表明板栗面團表現(xiàn)出半固體偏彈性的性質(zhì)。且隨頻率的增加，所有面團樣品的tanδ均先減小后趨于穩(wěn)定，可能是在達(dá)到一定頻率后，面團中的蛋白交聯(lián)聚集形成緊密的面筋結(jié)構(gòu)，逐漸減小纖維對面團強度的影響，從而使其黏彈性趨于穩(wěn)定。與TG添加量0 U/g相比，添加量為2.7 U/g時tanδ值達(dá)到最小，說明此添加量下面團的彈性性質(zhì)最優(yōu)。因此選擇合適的TG的添加量可以增強板栗面團的穩(wěn)定性。

2.3 TG對板栗面團蠕變-恢復(fù)特性的影響

面團作為一種具有黏彈性的復(fù)雜軟固體，在壓力恒定的條件下，內(nèi)部的分子鏈發(fā)生鏈斷而產(chǎn)生一定的形變量發(fā)生蠕變，隨著恒定壓力的撤除，面團會發(fā)生瞬時彈性恢復(fù)及延遲彈性恢復(fù)。因此可通過動態(tài)流變儀的蠕變-恢復(fù)模式對其抗形變能力進(jìn)行表征，同時也可被用來表征面團和面筋的黏彈性[21]。從圖2可以看出，在蠕變階段（0～150 s），面團的剪切應(yīng)變都在不斷升高，在撤除剪切應(yīng)力后面團的剪切應(yīng)變值急劇下降后漸漸趨于穩(wěn)定。與未添加TG的面團相比，TG的添加明顯降低了板栗面團的形變。其中未添加TG的板栗面團形變最大，而添加量為2.7 U/g時的面團形變最小。該結(jié)果表明TG添加量為2.7 U/g時板栗面團的抗形變能力最強。在恢復(fù)階段，TG添加量在2.7 U/g時板栗面團松弛形變后最接近初始狀態(tài)，表明此添加量下板栗面團具有最好的蠕變恢復(fù)能力，同時也表明此添加量下板栗面團內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)更加緊密。上述結(jié)果與頻率掃描結(jié)果相一致，即TG添加量在2.7 U/g左右時可以很好地改善板栗面團的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

圖2 不同TG添加量下板栗面團的蠕變-恢復(fù)特性曲線Fig.2 Effect of TG addition on the creep-recovery curve of chestnut dough

2.4 TG對板栗粉糊化特性的影響

淀粉糊化是指淀粉與水形成的懸浮液在加熱的過程中，淀粉的結(jié)晶區(qū)域膠束中的氫鍵不斷被破壞，膠束結(jié)構(gòu)逐漸松散，縫隙逐漸擴大，水分子不斷浸入，導(dǎo)致淀粉顆粒發(fā)生不可逆的膨脹，最終淀粉懸浮液變成高黏度的糊漿形態(tài)[22]。

如表2所示，板栗和TG混合粉的峰值黏度、最低黏度和最終黏度隨著TG添加量的增加而增加。黏度的增加可能是因為TG的添加促進(jìn)了蛋白質(zhì)交聯(lián)緊密，導(dǎo)致面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)外易糊化的淀粉量增加[23]。衰減值可以作為淀粉顆粒在糊化過程中穩(wěn)定性和損傷程度的指標(biāo)，其值越低表明淀粉顆粒耐剪切性越強[24]。表2中衰減值隨著TG添加量的增加先降低后增加，表明適量TG的加入可以保護淀粉顆粒的完整性，但過量的TG會限制水向淀粉顆粒的擴散，溫度升高導(dǎo)致淀粉顆粒崩解，抗剪切力會隨之減弱。表2中峰值時間和糊化溫度變化不明顯，但都比未添加TG時的大，可能是由于淀粉顆粒與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)連接緊密或被包埋其中，增加了淀粉結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，淀粉糊化的速度減慢，從而達(dá)到峰值所需的時間略有增加[25]。

表2 TG添加量對板栗粉糊化特性的影響Table 2 Effect of TG addition on the gelatinization characteristics of chestnut powder

2.5 TG對板栗面團游離巰基含量的影響

巰基是蛋白質(zhì)中最重要的功能性基團之一，同時也作為影響蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)[26]。TG的活性位點由3 個氨基酸組成：半胱氨酸、天冬酰胺和組氨酸，酶活性位點中的這種催化三元體與多肽鏈中結(jié)合的谷氨酰胺相互作用形成?；?酶復(fù)合物（也稱為酶-蛋白復(fù)合物）。?；?酶復(fù)合物形成并釋放游離氨后，會發(fā)生轉(zhuǎn)酰胺化反應(yīng)，通過與賴氨酸的ε-氨基結(jié)合形成共價異肽鍵，從而使多肽鏈中谷氨酰胺和賴氨酸殘基之間發(fā)生交聯(lián)[27]。半胱氨酸中含有巰基，在發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)之后，巰基之間的距離變近，易被氧化形成二硫鍵，二硫鍵使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固[28]。因此巰基含量的變化可以說明TG是否發(fā)生催化反應(yīng)。由圖3可知，隨著TG添加量的增加，板栗面團中游離巰基的含量明顯下降，表明TG的加入使板栗面團中的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚集，進(jìn)而使得游離在表面的巰基被包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部；另一方面表明，在TG的作用下，小分子蛋白交聯(lián)，形成了具有緊密網(wǎng)絡(luò)空間的大分子蛋白聚集體，水分子進(jìn)入此網(wǎng)絡(luò)空間與肽鏈發(fā)生結(jié)合，使得肽鏈間的巰基發(fā)生裂解后轉(zhuǎn)化為二硫鍵，從而導(dǎo)致巰基含量減少[29]。Ahn等[30]在TG改性小麥、大麥和大豆面粉及其混合物的研究中指出，TG處理后的樣品巰基數(shù)量明顯減少，推測是因為在TG作用過程中，含硫氨基酸相互接近氧化形成了二硫鍵。

圖3 不同TG添加量對板栗面團游離巰基含量的影響Fig.3 Effect of TG addition on the content of free sulfhydryl groups in chestnut dough

2.6 TG對板栗面團微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖4a所示，未添加TG的板栗面團有大量空洞且整體結(jié)構(gòu)疏松，很少有成片的面筋膜，這是由于板栗粉存在較多纖維，導(dǎo)致面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)無法形成，淀粉顆粒暴露。如圖4b所示，TG添加量在2.7 U/g條件下板栗面團的微觀結(jié)構(gòu)顯示有成片的面筋膜且空洞較少，結(jié)構(gòu)連續(xù)緊密且均勻，表明TG的添加使板栗面團中的蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集，纖維和淀粉顆粒與大分子蛋白質(zhì)連接緊密或被面筋網(wǎng)絡(luò)包裹其中，面團穩(wěn)定性增強。圖4c是TG添加量為3.6 U/g時的板栗面團微觀結(jié)構(gòu)，此添加量下空洞相比于2.7 U/g時的多一點，可能原因是TG添加過多導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度交聯(lián)聚集，淀粉顆粒被迫外露，面團整體穩(wěn)定性下降，加工性能變差。此結(jié)果與上述流變分析結(jié)果一致。王佳玉等[31]在研究不同TG添加量對全麥面團的微觀結(jié)構(gòu)的影響時也得出相似的結(jié)論。綜上來看，當(dāng)TG添加量在2.7 U/g附近時，板栗面團的微觀結(jié)構(gòu)較為緊密均勻。

圖4 TG對板栗面團微觀結(jié)構(gòu)的影響（×1000）Fig.4 Effect of TG on the microstructure of chestnut dough (×1000)

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，TG的添加可以促進(jìn)板栗面團蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，有利于改善板栗面團的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。適量添加TG可以增加板栗面團的黏度、硬度、彈性等特性，同時增大了面團的彈性模量和黏性模量，增強了抗外界形變能力。在化學(xué)性質(zhì)方面，TG的添加降低了板栗面團游離巰基的含量，側(cè)面說明TG可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的交聯(lián)，使面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加完整，但TG添加量過多會導(dǎo)致蛋白過度交聯(lián)，面團的綜合黏彈性下降，穩(wěn)定性也下降。因此，合理控制適量TG的添加量對提高板栗面團結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及加工性能至關(guān)重要。在本研究中，TG添加量為2.7 U/g時對板栗面團的理化性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)改善效果最明顯。本研究可為開發(fā)板栗粉食品提供一定的理論依據(jù)，同時也期望為無麩質(zhì)食品的開發(fā)、加工及改良提供一定的參考。