不同松花粉提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)大鼠卵巢損傷的保護(hù)作用

劉其聳，陳 陽(yáng)，楊長(zhǎng)軍，何毓婕，陳秋銘，何志勇，王召君，陳 潔，曾茂茂,*

（1.煙臺(tái)理工學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 264006；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

卵巢是雌性動(dòng)物卵泡發(fā)育，黃體形成、退化和排卵以及類固醇激素合成的生殖器官，其分泌的性腺類固醇激素、前列腺素等多種激素和生長(zhǎng)因子控制著機(jī)體的發(fā)育和生理活動(dòng)[1]。醫(yī)療相關(guān)卵巢損傷主要是指手術(shù)或放化療對(duì)卵巢結(jié)構(gòu)和功能所造成的損傷，可見(jiàn)于婦科良惡性腫瘤的治療過(guò)程中[2]。環(huán)磷酰胺是臨床上最常用的藥物之一，對(duì)多種腫瘤及自身免疫性疾病具有良好的治療效果，但其作為烷化劑是公認(rèn)的對(duì)卵巢損傷最大的化療藥物，會(huì)導(dǎo)致用藥患者卵巢功能損傷、生育能力下降，還可能影響終身健康[3]。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷機(jī)制相關(guān)的信息很少，目前多將其歸因于氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[4]。一些天然產(chǎn)物被證明可對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢損傷起到有效的保護(hù)作用[5]，具體效果取決于所含有效單體成分的種類與含量。由于具有良好的抗氧化特性[4]，已有較多的植物單體成分被證實(shí)具有卵巢保護(hù)的功效，如白藜蘆醇[6]、槲皮素[7]、鹽酸益母草堿[8]、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯[9]、淫羊藿苷[10]、輔酶Q10[11]和人參皂苷Rb1[12]等諸多黃酮、多酚和三萜類小分子化合物，更大分子質(zhì)量的富硒蛋清肽（分子質(zhì)量為200～1 000 Da的組分占比達(dá)98.33%）[13]、殼寡糖（水溶，分子質(zhì)量≤2 000 Da）[14]，以及來(lái)源于動(dòng)植物的魷魚(yú)墨多糖[15]、透明質(zhì)酸[16]、巖藻聚糖硫酸酯[17]等大分子。對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷具有保護(hù)作用的物質(zhì)在分子質(zhì)量及溶解性上具有較大差異，這可能與疾病發(fā)生涉及機(jī)體內(nèi)的多個(gè)通路及靶點(diǎn)有關(guān)[18]。

松花粉是松科植物馬尾松、油松或其同屬植物的雄性生殖細(xì)胞，是一種藥食同源的原料，目前已在扶正化瘀片（膠囊）、清肺止咳散和哮喘丸等中成藥中廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，松花粉中含有維生素、酚酸、黃酮、萜類、生物堿、有機(jī)酸、氨基酸及其衍生物、脂類、糖及醇類和核苷酸及其衍生物等小分子物質(zhì)[19]，以及多糖[20]和蛋白質(zhì)[21]等大分子物質(zhì)。松花粉的乙醇提取物和水提物都具有較好的抗氧化活性[22]，并可改善機(jī)體的炎癥癥狀[23]，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[24]。本課題組的前期研究證實(shí)松花粉可以有效保護(hù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢損傷[25]，并通過(guò)廣泛靶向代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)松花粉可以通過(guò)影響α-亞麻酸代謝、VB6代謝、嘌呤代謝、賴氨酸降解和糖酵解/糖異生途徑促進(jìn)肝臟代謝由紊亂向正常水平回歸[18]，這可能是松花粉“從肝論治卵巢早衰”干預(yù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷的機(jī)制之一[26]。中藥強(qiáng)調(diào)多組分多靶點(diǎn)協(xié)同作用，但因中藥成分多樣、與機(jī)體相互作用非常復(fù)雜，直接揭示其混合組分在分子水平上的作用機(jī)制非常困難。通過(guò)按照分子質(zhì)量大小和化合物溶解性差異等理化性質(zhì)對(duì)松花粉組分進(jìn)行分離，進(jìn)而驗(yàn)證各組分對(duì)卵巢的保護(hù)效果，結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析可以篩選效應(yīng)組分以及確定其相應(yīng)的主要干預(yù)途徑。

本研究分析松花粉水提物、水提大分子化合物（＞5 kDa）、乙醇提物和乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）4 種松花粉提取物的總糖、粗多糖、總酚和總黃酮等組成，并探討各提取物對(duì)攝入環(huán)磷酰胺大鼠的卵巢保護(hù)作用，包括卵巢形態(tài)、抗氧化能力、細(xì)胞凋亡能力和抗炎能力等，進(jìn)一步通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析對(duì)松花粉的效應(yīng)組分進(jìn)行篩選，旨在對(duì)后續(xù)準(zhǔn)確解析松花粉內(nèi)對(duì)于卵巢損傷具有保護(hù)作用的藥效物質(zhì)及其體內(nèi)作用機(jī)制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SD大鼠（雌性，10 周齡，體質(zhì)量約250 g），由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001）。

破壁云南松花粉 新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司；環(huán)磷酰胺一水合物 上海源葉生物科技有限公司；補(bǔ)佳樂(lè)戊酸雌二醇片 拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

甲醛溶液、甲醇、福林-酚試劑 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-4試劑盒，總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力測(cè)定試劑盒，脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒，一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，伊紅-蘇木素（hematoxylin &eosin，H&E）染色試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ASP300S全自動(dòng)脫水機(jī)、EG1150H組織包埋機(jī)、RM2245轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、ST5010自動(dòng)載玻片染色機(jī)德國(guó)Leica儀器有限公司；Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、164-5050基礎(chǔ)電源電泳儀、165-8003小型垂直電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；iBright FL1500成像系統(tǒng)美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 松花粉提取物的制備

水提物的制備：稱取100 g破壁松花粉，溶于2 L超純水。在45 ℃超聲攪拌3 h，抽濾，重復(fù)3 次后合并濾液，凍干，得到松花粉水提物；水提大分子化合物的制備：水提物制備中合并的濾液使用5 kDa的膜超濾后保留截留液，凍干，得到水提大分子化合物（＞5 kDa）；乙醇提物的制備：取100 g破壁松花粉溶于2 L體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液。在45 ℃超聲攪拌3 h，抽濾，重復(fù)3 次后合并濾液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)全部乙醇，凍干，得到松花粉乙醇提物；乙醇提小分子化合物的制備：松花粉醇提物制備中合并的濾液使用5 kDa的膜超濾后保留透過(guò)液并再次超濾。第2次的透過(guò)液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干，得到乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）。

1.3.2 松花粉提取物總糖、粗多糖、總酚和總黃酮含量的測(cè)定

采用GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測(cè)定》[27]中的苯酚-硫酸法對(duì)松花粉中總糖含量進(jìn)行測(cè)定。采用袁桂香等[28]的水提醇沉法提取多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖含量。依據(jù)梅進(jìn)等[29]的方法測(cè)定松花粉中總酚含量。依據(jù)黃雪秋等[30]的方法測(cè)定松花粉中總黃酮含量。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，除空白對(duì)照組8 只之外，其余進(jìn)行環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷，空白對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水。取造模成功的56 只大鼠隨機(jī)分為7 組，每組8 只，灌胃方式如表1所示，連續(xù)灌胃28 d。末次給藥后，大鼠禁食12 h后使用異氟烷吸入麻醉。迅速取出卵巢，剔除所有脂肪后稱質(zhì)量，計(jì)算卵巢指數(shù)。稱質(zhì)量后的卵巢一半用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，一半置于液氮中存于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 大鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

4%多聚甲醛溶液中的卵巢使用梯度酒精脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，H&E染色后，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察并拍照記錄，觀察內(nèi)容包括卵巢的始基卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡、閉鎖卵泡、黃體數(shù)的差異，以及卵巢皮質(zhì)、髓質(zhì)、顆粒細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)等其他病理改變。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠卵巢炎癥因子和抗氧化能力

采用商業(yè)化試劑盒測(cè)定卵巢中的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-4水平，以及SOD、GSH-Px、CAT的活力、T-AOC水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3.6 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞TUNEL檢測(cè)

采用商業(yè)化試劑盒測(cè)定卵泡周圍顆粒細(xì)胞的凋亡水平，具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。操作完成后于熒光顯微鏡下拍攝清晰照片用于凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)和凋亡指數(shù)計(jì)算，計(jì)算公式如下：

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）檢測(cè)大鼠卵巢凋亡蛋白表達(dá)

冷凍的卵巢在冰上剪切后，于RIPA裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）中充分勻漿，靜置30 min，以14 000 r/min離心10 min。以蛋白濃度最低的樣品為基準(zhǔn)進(jìn)行凝膠電泳，并使用半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。PVDF膜置于封閉液中，室溫封閉2 h。封閉后PVDF膜用TBST洗滌3 次，加入不同的一抗（表2），4 ℃孵育過(guò)夜。一抗孵育后，用Tris含吐溫-20緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3 次，每次20 min，然后二抗室溫孵育1 h。用TBST洗滌3 次，每次20 min，然后將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑均勻滴在PVDF薄膜上，用化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度并拍照。

表2 WB抗體信息Table 2 Information about antibodies used for WB

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 松花粉4 種不同提取物的成分分析

松花粉4 種提取物中的總糖、粗多糖、總酚和總黃酮含量如表3所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，水提物中的糖類物質(zhì)的含量較醇提物更高，而酚類及黃酮類物質(zhì)則相反，在乙醇提物中含量更高（P＜0.05）。通過(guò)使用5 kDa的膜超濾后的水提大分子化合物中含有更多的糖類，且粗多糖相對(duì)總糖占比由22.59%增加至28.65%，總黃酮流失更為嚴(yán)重；乙醇提小分子化合物中總酚、總黃酮含量有所富集，總糖含量下降最為顯著。以往研究中證實(shí)植物多糖及多酚、黃酮類物質(zhì)都可以對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢損傷起到保護(hù)作用[7,17]，本研究制備所得的4 種提取物在這些主要活性成分含量上差異顯著（P＜0.05），通過(guò)驗(yàn)證4 種提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷的保護(hù)效果，可以為后續(xù)篩選松花粉中確切具有卵巢保護(hù)作用的單一組分糖類抑或是多酚黃酮類的藥效物質(zhì)提供指導(dǎo)，并可通過(guò)不同組分作用途徑的差異為更加科學(xué)的食品或藥品復(fù)配提供理論依據(jù)。

表3 松花粉4 種提取物的功效成分含量Table 3 Contents of four functional components in pine pollen extracts mg/g

2.2 松花粉提取物對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢形態(tài)的影響

經(jīng)各松花粉提取物灌胃后，與模型組相比，乙醇提物組、乙醇提小分子化合物組和水提大分子化合物組均對(duì)卵巢指數(shù)有顯著提升，而原粉組和水提物組沒(méi)有顯著提升。從卵巢形態(tài)的結(jié)果來(lái)看，模型組較空白組的始基卵泡差異不明顯，初級(jí)、次級(jí)和成熟卵泡及黃體數(shù)量下降顯著，閉鎖卵泡則顯著增加（圖1），符合以往文獻(xiàn)報(bào)道中環(huán)磷酰胺破壞發(fā)育中卵泡這一現(xiàn)象[31]。相比于模型組，陽(yáng)性組的始基卵泡和閉鎖卵泡數(shù)量大量下降，初級(jí)卵泡變化不明顯，次級(jí)和成熟卵泡及黃體數(shù)量一定程度上恢復(fù)。原粉組黃體數(shù)量比陽(yáng)性組少，低于空白組，水提物組具有與原粉組類似的結(jié)果。乙醇提物組的初級(jí)和次級(jí)卵泡數(shù)量顯著下降，而成熟卵泡明顯增加，閉鎖卵泡數(shù)量最少。除黃體和閉鎖卵泡兩項(xiàng)，水提大分子化合物組與水提物組結(jié)果相似，水提大分子化合物組增加了黃體數(shù)量，但對(duì)于減少閉鎖卵泡的效果最差。乙醇提小分子化合物組對(duì)減少閉鎖卵泡的效果僅次于乙醇提物組，成熟卵泡數(shù)量與空白對(duì)照組持平，但初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡數(shù)量比空白對(duì)照組少。結(jié)果表明，各松花粉提取物均對(duì)卵巢形態(tài)改善具有正面作用，但對(duì)卵巢各組織結(jié)構(gòu)的改善效果具有差異?；谒嵛锖鸵掖继嵛镏卸嗵呛托》肿涌寡趸衔锝M成的差異，可以認(rèn)為松花粉對(duì)卵巢形態(tài)的影響是多組分多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，探究各組分的作用機(jī)理有助于通過(guò)對(duì)其進(jìn)行合理組合，以發(fā)揮更全面和顯著的保護(hù)卵巢效果。

圖1 SD大鼠卵巢組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.1 Histopathological sections of SD rat ovaries

2.3 松花粉提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)卵巢損傷大鼠卵巢抗氧化能力的影響

如圖2所示，相較于空白對(duì)照組，模型組的卵巢T-AOC顯著下降了12.52%，GSH-Px、SOD和CAT活力顯著下降了50.05%、53.80%和63.75%，MDA水平顯著上升了103.38%（P＜0.05）。與模型組相比，除水提大分子化合物組外，其余各組的卵巢抗氧化能力均有顯著提升，其中提升最大的是乙醇提小分子化合物組，其次是乙醇提物，兩組分別將T-AOC、GSH-Px活力、SOD活力和CAT活力顯著提高了25.81%、16.03%，109.90%、104.31%，120.63%、91.62%和237.09%、138.42%，并將MDA水平顯著降低了48.43%、53.42%（P＜0.05）。乙醇提物提升機(jī)體抗氧化能力的效果也優(yōu)于水提物，并且乙醇提物和乙醇提小分子化合物的卵巢GSH-Px和CAT活力無(wú)顯著差異（P＞0.05）。水提大分子化合物組在各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)方面的表現(xiàn)不如水提物組，表明水提物對(duì)卵巢抗氧化方面的提升可能更多是受水溶性小分子化合物的影響。對(duì)于水溶性多糖大分子、醇溶性多酚和黃酮等小分子提升機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活力及降低MDA含量均有所報(bào)道[32]，但本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)模型組而言，松花粉水提大分子化合物提升機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活力及降低脂質(zhì)氧化不顯著（P＞0.05），表明松花粉多糖等水溶性大分子物質(zhì)與小分子化合物在通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢氧化應(yīng)激保護(hù)卵巢機(jī)制方面存在差異，這可能是松花粉多糖等水溶性大分子物質(zhì)無(wú)法進(jìn)入胞內(nèi)作用于相關(guān)靶點(diǎn)的原因。

圖2 SD大鼠卵巢T-AOC（A）、GSH-Px（B）、SOD（C）、CAT（D）、MDA（E）水平（n＝5）Fig.2 Levels of T-AOC (A),GSH-Px (B),SOD (C),CAT (D) and MDA (E) in SD rat ovaries (n=5)

2.4 松花粉提取物對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢抗炎能力的影響

TNF-α和IL-6被認(rèn)為是促炎因子[33]，而IL-4是抑炎因子[34]。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，模型組的TNF-α、IL-6和IL-4均顯著提升，分別提升了190.25%、106.60%和104.04%（P＜0.05），與以往報(bào)道中環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)效果相同[35]，表明環(huán)磷酰胺擾亂了大鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答系統(tǒng)。各松花粉提取物均能顯著回調(diào)炎癥因子水平（P＜0.05），且水提物和水提大分子化合物降低促炎因子的效果略好于乙醇提物及乙醇提小分子化合物，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，除了在回調(diào)TNF-α?xí)r水提物與水提大分子化合物的效果略好，可以認(rèn)為松花粉4 種提取物在通過(guò)抗炎機(jī)制保護(hù)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢損傷方面具有相似效果。

圖3 SD大鼠卵巢TNF-α（A）、IL-4（B）和IL-6（C）水平（n＝6）Fig.3 Levels of TNF-α (A),IL-4 (B) and IL-6 (C) in SD rat ovaries (n=6)

2.5 松花粉4 種不同提取物對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢抗細(xì)胞凋亡能力的影響

如表4所示，模型組的卵泡顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)為（83.40±5.37）%，遠(yuǎn)高于其余各組（P＜0.05）。松花粉原粉、水提物、乙醇提物、水提大分子化合物、乙醇提小分子化合物分別將凋亡指數(shù)顯著降低了50.71%、62.04%、48.29%、55.42%和51.66%，表明松花粉各組分都對(duì)調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有積極影響。相比水提物組，水提大分子化合物組凋亡指數(shù)升高了11.78%（P＜0.05）；相比醇提物組，醇提小分子化合物組的凋亡指數(shù)下降了6.91%（P＜0.05），表明小于5 kDa的小分子化合物能有效減少顆粒細(xì)胞的凋亡。水提物細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于醇提物，這可能與有效小分子化合物水溶性高于醇溶性，因而在水提物中的含量高于在醇提物中的含量有關(guān)。程妮等[36]研究證明松花粉水提取物和乙醇提取物中均檢出原兒茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸4 種酚酸類物質(zhì)，且在水提取物中的含量均比乙醇提取物中含量高，其中咖啡酸[37]已被證明可以減少卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

表4 8 組大鼠顆粒細(xì)胞凋亡指數(shù)（n＝5）Table 4 Apoptosis index of granulosa cells in rats from eight groups (n =5)

2.6 4 種松花粉提取物對(duì)卵巢損傷大鼠卵巢凋亡蛋白表達(dá)的影響

在研究的5 種凋亡相關(guān)蛋白中，Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白[38]，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3是促凋亡蛋白，其中Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，僅存在于正在凋亡的細(xì)胞中[39]。如圖4所示，模型組較空白組的Bcl-2蛋白含量下降，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3含量均顯著上升。與模型組相比，松花粉原粉及4 種提取物組均顯著上調(diào)了Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)了Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)（P＜0.05）。研究認(rèn)為，Bcl-2與Bax的比值對(duì)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激后是否存活起關(guān)鍵作用[40]。本研究結(jié)果顯示，乙醇提物組與乙醇提小分子化合物組的Bcl-2/Bax值顯著高于水提物組和水提大分子化合物，而Cleaved Caspase-3的表達(dá)則顯著低于水提物組與水提大分子化合物組（P＜0.05），說(shuō)明乙醇提物與乙醇提小分子化合物調(diào)控卵巢抗凋亡蛋白表達(dá)能力最強(qiáng)，其次是水提物和大分子水提取物。卵巢凋亡蛋白表達(dá)與顆粒凋亡指數(shù)的結(jié)果存在差異，表明4 種松花粉提取物在通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少卵巢細(xì)胞凋亡的機(jī)制方面存在較大差異。

圖4 8 組大鼠卵巢凋亡蛋白表達(dá)（n＝3）Fig.4 Expression of apoptosis-related factors in rat ovaries from eight groups (n =3)

2.7 4 種松花粉提取物對(duì)卵巢損傷大鼠影響的聚類分析及相關(guān)性分析

圖5A顯示，模型組與其余組分為兩大簇，表明4 種提取物都可以一定程度上緩解卵巢損傷。其中，陽(yáng)性對(duì)照組與空白組分為一簇，與乙醇提小分子化合物和乙醇提物歸為一簇，與水提大分子化合物、松花粉原粉和水提物歸為一簇。聚類分析的結(jié)果證明了乙醇提小分子化合物和醇提物具有比松花粉原粉、水提物和水提大分子化合物更好的效果。圖5B的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，總酚和總黃酮與閉鎖卵泡間形成負(fù)相關(guān)，總糖和粗多糖并未表現(xiàn)出與閉鎖卵泡的任何相關(guān)性；此外，總酚和總黃酮在提升機(jī)體抗氧化力、降低脂質(zhì)氧化以及抑制促凋亡蛋白表達(dá)方面的效果好于總糖和粗多糖，這在一定程度上解釋了富集多酚和黃酮的乙醇提小分子物和乙醇提物具有更好卵巢保護(hù)作用的現(xiàn)象。但值得注意的是，糖類與TNF-α具有更強(qiáng)的負(fù)相關(guān)特性（P＜0.05），即清除促炎因子TNF-α可能是松花粉多糖發(fā)揮保護(hù)卵巢作用的途徑。

圖5 不同實(shí)驗(yàn)組別大鼠的聚類分析（A）與松花粉提取物和體內(nèi)指標(biāo)間的相關(guān)性分析（B）Fig.5 Cluster analysis of rats in different experimental groups (A) and correlation analysis between pine pollen extracts and physiological indices in rats (B)

3 結(jié)論

本研究分析了4 類松花粉提取物中的糖類、黃酮和多酚的含量，水提物及水提大分子化合物糖類含量較高，而乙醇提物及乙醇提小分子物則含黃酮和多酚較多，且經(jīng)過(guò)進(jìn)一步制備的水提大分子化合物和乙醇提小分子化合物進(jìn)一步提升了其中的主要活性物質(zhì)含量。松花粉的4 種提取物均在一定程度上減少了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢損傷，但醇提物及乙醇提小分子化合物通過(guò)減少閉鎖卵泡，提高卵巢抗氧化能力，調(diào)控卵巢凋亡細(xì)胞蛋白表達(dá)等保護(hù)卵巢，而松花粉多糖則通過(guò)清除促炎因子TNF-α保護(hù)卵巢。后期通過(guò)進(jìn)一步分離多酚黃酮類小分子藥效物質(zhì)及多糖類物質(zhì)，有利于制作組分明晰、作用途徑可控的松花粉產(chǎn)品。