小鼠卵巢組織冷凍保存和自體移植技術(shù)的研究

李茗薇，黃 茹，嚴青秀，李可悅，王麗瀅，王 飛

（1.安徽理工大學第一附屬醫(yī)院/淮南市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 淮南 232007；2.安徽理工大學醫(yī)學院，安徽 淮南 232063）

我國每年新發(fā)惡性腫瘤數(shù)超400 萬，但隨著抗腫瘤治療的不斷發(fā)展，惡性腫瘤患者的生存率也在不斷提高，越來越多女性在腫瘤治愈后有了更加迫切的生育需求，特別是對于年輕女性患者來說，70%以上有期待生育的愿望[1，2]，因此惡性腫瘤患者的生育力保護愈加受到重視。生育力保護的技術(shù)主要包括卵母細胞凍存、胚胎凍存和卵巢組織凍存移植。目前，卵母細胞凍存與胚胎凍存技術(shù)已趨于成熟，但對適用人群有諸多限制，而卵巢組織凍存移植技術(shù)為保護生育力開辟了一條新途徑，也是急需治療的惡性腫瘤患者保存生育力的最佳選項[3，4]。冷凍保存技術(shù)不僅可以節(jié)約超促排卵的高昂費用，同時還可以儲備大量原始卵泡。由于卵巢組織內(nèi)包含著多種類型的細胞，并有著獨特和復雜的結(jié)構(gòu)，原始卵泡和初級卵泡被大量單層顆粒細胞所圍繞，因此其凍融是一項困難的任務。卵巢組織常用的冷凍方法有玻璃化冷凍法和程序化冷凍法兩類[4，5]。本研究采用程序化冷凍法，通過對小鼠卵巢組織進行體外冷凍保存和原位移植技術(shù)，建立小鼠生育力保護和內(nèi)分泌重構(gòu)的模型，進一步驗證卵巢冷凍保存技術(shù)和原位移植技術(shù)的安全性和有效性，為保護女性生育能力提供臨床基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8 周齡SPF 級C57BL/6J 成熟雌鼠30 只，體重16.6～18.8 g，均由安徽理工大學實驗動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)溫度為（21±2）℃，相對濕度30%～70%，光照明暗交替周期為12 h/d。本實驗方案由安徽理工大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并通過動物實驗倫理審查。將小鼠隨機分為3 組：研究A 組10 只、研究B 組10 只和對照組10 只。

1.2 實驗試劑與設備 試劑：3%水合氯醛、M2 培養(yǎng)基、HAS（人血清白蛋白）、DMSO、PBS、4%的多聚甲醛、瑞氏染液。冷凍基礎液為含20%HAS 的M2 培養(yǎng)基。冷凍保護液為用冷凍基礎液配制的1.5M 的DMSO（即1 mlDMSO，基礎液定容至10 ml）。設備：顯微剪、平臺鑷、手術(shù)直剪、帶線縫合針、持針器、1 ml 注射器、1.8 ml 冷凍管、35 mm 一次性培養(yǎng)皿、程序降溫盒、解剖鏡。

1.3 方法 研究組小鼠進行卵巢體外冷凍保存、復蘇和自體原位移植手術(shù)。將小鼠麻醉后完整取出其右側(cè)卵巢，將冷凍復蘇后的卵巢組織移植于小鼠左側(cè)卵巢原位。對照組小鼠卵巢不進行冷凍復蘇而直接行原位移植手術(shù)，術(shù)后精心飼養(yǎng)。移植術(shù)后第5 天起每日對3 組小鼠進行陰道細胞學檢測，觀察動情周期。術(shù)后第10 天研究A 組小鼠、對照組小鼠與同品系雄鼠進行合籠，觀察產(chǎn)仔情況。合籠后第25 天，處死合籠小鼠，取出移植卵巢組織，進行組織形態(tài)學觀察，判斷移植后卵巢的功能恢復情況。研究B 組小鼠在移植第15 天取卵巢進行組織學觀察。

1.3.1 冷凍保存 將取出的新鮮卵巢組織在冷凍基礎液中緩沖，再將卵巢組織轉(zhuǎn)移至裝有冷凍保護液的1.8 ml 冷凍管中，4 ℃平衡30 min，使冷凍保護液完全滲透整個卵巢。-20 ℃放置20 min，使內(nèi)容物結(jié)晶。將冷凍管迅速放入程序降溫盒中，-80 ℃冰箱梯度降溫保存7 d。

1.3.2 復蘇和自體原位移植 從-80 ℃冰箱中取出冷凍管，室溫靜置1 min，迅速放入37 ℃水浴鍋中1～2 min 解凍。解凍后將卵巢轉(zhuǎn)移到冷凍基礎液中緩沖，移植手術(shù)開始前將卵巢轉(zhuǎn)移到放有PBS 的35 mm 小培養(yǎng)皿中等待移植。以小鼠右側(cè)切口為對照，在對稱部位開口將左側(cè)卵巢完整取出。取卵巢時，沿卵巢外緣小心地剪開卵巢包膜的1/2，不要將包膜中間剪破，沿著開口翻開包膜。用顯微剪剪斷卵巢蒂（確保卵巢完全摘除，無殘留），摘除左側(cè)卵巢。將解凍后的卵巢植入左側(cè)卵巢原位，卵巢包膜下翻，覆蓋剛植入的卵巢。后將子宮與輸卵管輕輕塞入腹腔原位后，縫合肌肉與皮膚。

1.3.3 小鼠陰道脫落細胞檢測 從移植術(shù)后第5 天起，對3 組小鼠每日下午4∶00 時進行陰道脫落細胞涂片，觀察其動情周期。用移液槍吸取20 μl 生理鹽水于小鼠陰道內(nèi)反復抽吸5 次，涂片并自然干燥，瑞氏染液染色后光鏡下觀察，判斷其動情周期分期。

1.3.4 卵巢組織切片制作 凍融的卵巢組織放入4%的多聚甲醛固定24 h。之后依次放入75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中分別脫水30、20、8 min。再放入二甲苯中透明15 min。最后浸蠟將組織包埋，制成石蠟組織塊。切片前先將組織塊放入-20 ℃冰箱冷凍5 min。厚度以5～7 μm 為宜。將切下的組織片置于43 ℃溫水中，直至組織片完全展開將其用載玻片撈出。攤片1 h，用吹風機熱風對準玻片上的卵巢組織，將其周圍的蠟吹散。烘片5 h，將卵巢組織固定在玻璃片上，最后進行蘇木素-伊紅染色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠陰道脫落細胞學觀察 對照組全部小鼠陰道細胞呈持續(xù)規(guī)律的動情周期性變化（圖1），平均周期持續(xù)天數(shù)為4～5 d。研究A 組10 只小鼠中8 只出現(xiàn)動情周期，研究B 組10 只小鼠中7 只出現(xiàn)動情周期。對照組小鼠首次恢復動情周期時間稍早于研究組小鼠，但對照組及研究組小鼠動情周期持續(xù)天數(shù)無差異。

圖1 小鼠正常動情周期變化

2.2 移植后卵巢形態(tài)學觀察 新鮮卵巢呈蠶豆形，肉色，表面有豐富的血管通過。凍融后卵巢形狀無變化，白里透粉色。移植后卵巢形狀不規(guī)則，肉眼可見大部分長成淡黃色圓形或橢圓體，表面有重建的血管通過，這為卵巢恢復功能創(chuàng)造了條件（圖2）。移植后，小鼠卵巢體積部分發(fā)生變化。10%的卵巢消失、40%的卵巢萎縮、50%的卵巢體積無變化。消失的卵巢可能由于包膜碎裂，無法將其固定于卵巢原位，在小鼠活動過程中，卵巢從原位滑脫所致。而血供不足則可能是導致卵巢萎縮的原因。在操作過程中，冷凍與復蘇過程操作不當會引起卵巢發(fā)生部分或整體壞死。整個實驗里，幾乎一半的卵巢都有壞死的部分。

圖2 卵巢組織形態(tài)學觀察

2.3 卵巢組織學觀察 正常卵巢卵泡豐富，同時可見各個時期的卵泡出現(xiàn)。凍存過程操作不當則會導致卵巢壞死（圖3）。研究組卵巢在移植后第15 天，卵巢切片可見大量原始卵泡，無次級卵泡與成熟卵泡。移植后第35 天，卵泡數(shù)減少，原始卵泡難尋，可見次級卵泡、成熟卵泡以及黃體。這些結(jié)果直接表明成熟卵泡是由原始細胞發(fā)育而來，并且這些卵泡可以實現(xiàn)自發(fā)排卵。成熟卵泡的出現(xiàn)表明實驗的成功，能夠為小鼠保存生育力。但是移植體上的卵泡密度均低于正常卵巢，并且許多卵泡的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，卵泡內(nèi)卵母細胞發(fā)生了退化。

圖3 卵巢組織切片觀察

2.4 產(chǎn)仔情況 研究A 組小鼠在移植后第10 天與同品系雄鼠合籠，在合籠第22 天，共有2 只鼠懷孕并分別產(chǎn)下3 只和1 只小鼠。而對照組小鼠懷孕能產(chǎn)6～10 只小鼠。

3 討論

育齡期的性腺毒性化療和盆腔照射會損害卵巢，導致卵巢儲備過早耗竭和內(nèi)分泌功能障礙，存在不孕的風險。因此，癌癥緩解后保留生育能力是這些女性面臨的一項關鍵挑戰(zhàn)。相較于胚胎凍存與卵母細胞凍存，卵巢組織冷凍保存發(fā)展歷史雖短，但有著獨特的優(yōu)勢。此項技術(shù)可以冷凍卵巢皮質(zhì)中未成熟的原始卵泡，原始卵泡數(shù)量多、體積小、缺乏透明帶及皮質(zhì)顆粒，更耐受凍存過程中造成的損傷，并且具有生存活力及發(fā)育能力[6，7]。成功的卵巢組織凍存技術(shù)，不僅可以為患者保存生育力，而且還能恢復患者的內(nèi)分泌功能[8]。據(jù)研究[9]，卵巢組織冷凍保存和原位移植后95%的患者內(nèi)分泌功能恢復。卵巢功能常在移植后60～240 d 恢復，功能的平均持續(xù)時間為4～5 年，最長維持時間可超過10 年[10]。2020 年美國生殖醫(yī)學會指出，卵巢組織冷凍保存不再是一種實驗性方法，而是一種能有效應用于于人類的合法技術(shù)。阮祥燕等[11]研究在2016 年也實現(xiàn)了該項技術(shù)的成功應用，并于2021 年達到成功妊娠的目標。

卵巢組織冷凍保存結(jié)合原位移植技術(shù)可以成功保存大量原始卵泡，并且在卵巢移植回體內(nèi)后原始卵泡可以繼續(xù)發(fā)育為成熟卵泡，實現(xiàn)了卵泡的自發(fā)排卵，小鼠的生育力因此得到保存。但不可避免的是，凍存后的卵巢活力不能恢復到原本水平，仍有部分卵泡在操作過程中丟失。Christianson MS 等[12]研究表明，卵巢組織冷凍保存后年輕女性癌癥患者的卵泡密度顯著降低，凍存后卵巢組織的卵泡密度是新鮮卵巢組織卵泡密度的89%。本研究結(jié)果顯示，在卵巢移植第15 天，卵巢內(nèi)僅剩原始卵泡，次級卵泡與成熟卵泡丟失，卵泡總數(shù)減少。合籠小鼠產(chǎn)仔數(shù)驟減，不足原本數(shù)目的一半，其中的原因除了卵泡數(shù)減少，還可能是卵巢排卵速度減慢共同導致的。

雖然卵巢組織冷凍保存取得了進展，但操作過程中卵巢組織的冷凍損傷與缺血再灌注損傷仍會影響生育力的恢復[13]。冷凍損傷主要包括冷凍保護液對卵巢的毒性作用以及冷凍過程中細胞中電解質(zhì)直接轉(zhuǎn)變?yōu)楸ЫY(jié)構(gòu)而導致細胞機械損傷[14，15]。針對冷凍損傷的措施是應用低濃度的冷凍保護液完全滲透卵巢組織，再通過一系列的逐步降溫過程使冷凍過程產(chǎn)生的冰晶數(shù)大大減少，同時解凍卵巢時應快速升溫，以避免在解凍循環(huán)中水的重結(jié)晶，三者相配合可有效減小冷凍對卵巢組織造成的損傷。而缺血再灌注損傷是影響生育力恢復最重要的因素。凍融后卵巢移植未行血管移植，本身無血供，新生血管的建立需要時間，卵巢復氧大概4～5 d[16]。在早期移植的48 h 內(nèi)，缺血再灌注產(chǎn)生的氧代謝物大約使70%的卵泡丟失[17]。卵泡的大量丟失導致移植物體積明顯縮小，也會影響卵泡的動態(tài)變化、激素環(huán)境和生育力恢復的潛能[18]。本研究將小鼠左側(cè)新鮮卵巢取出，在左側(cè)卵巢原位植入凍融后的右側(cè)卵巢，用包膜將其覆蓋，為移植卵巢提供即時血供。卵巢體外保存技術(shù)可以實現(xiàn)生殖能力的保存，但不能實現(xiàn)卵巢功能的完全恢復。除卵巢功能會影響小鼠受孕外，輸卵管異常也會致小鼠不孕。在移植過程中，若手術(shù)器械夾到輸卵管，會使輸卵管管腔狹窄或水腫，且手術(shù)操作不當也可致輸卵管黏連等。卵巢組織冷凍保存為生育力保護注入了新的生命力，但目前我國腫瘤患者生育力保存仍存在許多問題，如醫(yī)生和患者缺乏對生育力的保護意識；患者不信任新技術(shù)；缺少多學科專家對治療過程的討論等[19]。我國生育力保護起步較晚，開展受限，但發(fā)展?jié)摿薮?。為受益于更多女性，首先應加強醫(yī)生對生育力保存的了解，對于需要生育力保護的患者，應充分評估其生育力保護指征，選擇合適的治療方法，遵循規(guī)范化的同時給予個體化的治療方案。

綜上所述，小鼠卵巢組織冷凍保存和自體原位移植技術(shù)可行。相信隨著研究的不斷深入，冷凍移植技術(shù)會愈加完善，我國生殖醫(yī)學能得到較大發(fā)展，越來越多女性也會因此受益。