ctDNA 啟動(dòng)子區(qū)甲基化在食管鱗癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

楊志珍，談艷芳

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610000；2.德陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 德陽(yáng) 618000）

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌的一個(gè)主要亞型，約占食管癌的90%，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第六[1-3]。ESCC 是由鱗狀上皮細(xì)胞分化的高度惡性上皮腫瘤，極具侵襲性，5 年存活率僅約30%[3]。液體活檢最初主要指循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析，現(xiàn)在擴(kuò)展到分析腫瘤在體液（主要是血液）中釋放的腫瘤成分，其中就包括腫瘤循環(huán)DNA（circulating tumorDNA，ctDNA）[4，5]。游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是存在于體液中的細(xì)胞外DNA，來(lái)源于正常細(xì)胞和凋亡、壞死的腫瘤細(xì)胞；而ctDNA 是其中的一部分，約占所有cfDNA 的0.01%～1%，其含量與腫瘤的類型、腫瘤負(fù)荷、疾病進(jìn)展程度相關(guān)[6]，既攜帶腫瘤細(xì)胞的基本遺傳信息，又?jǐn)y帶基因突變后的信息，包含點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增甚至基因拷貝數(shù)變異[7]。ctDNA 可來(lái)源于壞死的腫瘤細(xì)胞、凋亡的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[8]。表觀遺傳學(xué)異常是ESCC 形成的重要原因，特別是DNA 甲基化異常與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。DNA 甲基化異常會(huì)導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，使其成為食管鱗癌進(jìn)展的重要調(diào)控因子。有研究報(bào)道[9]，相對(duì)血清，血漿中ctDNA 甲基化水平能更準(zhǔn)確地反映機(jī)體ctDNA 甲基化的真實(shí)水平。多項(xiàng)研究表明[10-12]，ctDNA 甲基化是當(dāng)前非侵入性診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)力學(xué)的理想生物標(biāo)志物。然而，ctDNA 甲基化在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的研究報(bào)道較少。為了獲得關(guān)于ctDNA 甲基化的定量和定性信息，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了廣泛的方法。高通量測(cè)序（或下一代測(cè)序）技術(shù)通過(guò)一次對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA 片段進(jìn)行大規(guī)模的平行反應(yīng)而顯著提高了測(cè)序能力[13]。酶促甲基化測(cè)序（EM-Seq）作為針對(duì)5-甲基胞嘧啶（5-mC）的抗體富集甲基化DNA 序列的大規(guī)模純化技術(shù)，已經(jīng)成為比以往更快地鑒定甲基化CpG 富集序列的有利工具[14]。有研究表明[15，16]，啟動(dòng)子區(qū)基因甲基化水平隨著腫瘤進(jìn)展呈現(xiàn)逐漸升高的狀態(tài)。本研究利用EM-Seq 技術(shù)探討食管鱗癌中ctDNA 啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平狀態(tài)，結(jié)合相關(guān)富集通路，篩選出前4位高甲基化水平基因，或可作為食管鱗癌診斷生物標(biāo)志物，將為臨床上ESCC 的診斷帶來(lái)DNA 甲基化的新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2022 年8 月-2023 年1 月于德陽(yáng)市人民醫(yī)院初診食管鱗癌患者和健康體檢者的外周血樣本各4 份，入選人員年齡48～70 歲，平均年齡（55.50±7.10）歲。所有入選患者確診依據(jù)《食管癌診療指南（2022 年版）》[17]、《食管癌TNM分期（第8 版）》[18]和病理診斷。將初次診斷為食管鱗癌且未接受任何治療及發(fā)生淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者作為食管鱗癌診斷組（2 男2 女，代號(hào)S1、S2、S3、S4)，將體檢各項(xiàng)指標(biāo)正常且無(wú)任何器質(zhì)性病變的體檢者作為健康對(duì)照組（2 男2 女，代號(hào)J1、J2、J3、J4）。立即對(duì)收集到外周血樣本進(jìn)行血漿分離，2000 g離心10 min，分離得到血漿5 ml，轉(zhuǎn)移到凍存管，-80 ℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)ctDNA 分離。本研究已獲得德陽(yáng)市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的檢測(cè)與測(cè)序 采用High Pure Viral 核酸試劑盒從存儲(chǔ)的血漿中抽提ctDNA。用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 降解程度以及是否有RNA 污染。用Nanodrop 檢測(cè)DNA 的純度（OD260/280 比值），用Qubit 對(duì)DNA 濃度進(jìn)行精確定量，將大于3 ng 且沒(méi)有過(guò)度基因組DNA 污染的ctDNA 用于文庫(kù)構(gòu)建。使用methylation-insensitive restriction enzyme，MspI 對(duì)DNA 樣品進(jìn)行酶切處理，然后進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾，并連接上所有胞嘧啶均經(jīng)過(guò)甲基化修飾的測(cè)序接頭，切膠選擇插入片段長(zhǎng)度在150～300 bp 范圍的DNA 片段。隨后進(jìn)行Bisulfite 處理（采用EZ DNA Methylation Gold Kit，Zymo Research）。經(jīng)過(guò)處理后，未發(fā)生甲基化的C 變成U（PCR 擴(kuò)增后變?yōu)門），而甲基化的C 保持不變，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到最終的DNA 文庫(kù)。使用Qubit3.0 進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1 ng/μl，進(jìn)行EM-Seq 測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 文庫(kù)構(gòu)建流程圖

1.2.2 測(cè)序結(jié)果評(píng)估及數(shù)據(jù)處理 使用Illumina HiSeq 2500 測(cè)序儀構(gòu)建Cluster 生成和第一向測(cè)序引物雜交。將帶著Cluster 的flow cell 上機(jī)測(cè)序，選擇Paired-end 程序，進(jìn)行雙端高通量測(cè)序，使用Illumina 公司提供的數(shù)據(jù)收集軟件進(jìn)行測(cè)序過(guò)程的控制并實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。使用FastQC 對(duì)測(cè)序序列質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估原理：應(yīng)用測(cè)序質(zhì)量Q值進(jìn)行評(píng)估，Q值與測(cè)序錯(cuò)誤E 值之間關(guān)系為：Q=-10log10E。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是各樣本獲得約20 G 的測(cè)序數(shù)據(jù)，測(cè)序讀長(zhǎng)150 bp，單堿基質(zhì)量＞20 的比例≥90%。為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，首先，對(duì)下機(jī)的raw reads 利用fastqc 進(jìn)行質(zhì)控，隨后cutadapt 過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到clean reads。對(duì)raw reads 截去低質(zhì)量reads，得到的高質(zhì)量Reads 或堿基，稱為clean data。

1.2.3 基因比對(duì)及甲基化水平獲取分析 使用bwameth.py[19]（bwa-mem2 version 0.2.5）將樣本clean data 和參考基因組hg38（人）進(jìn)行比對(duì)。隨后采用MethylDackel 軟件進(jìn)行CpG 甲基化位點(diǎn)檢測(cè)。計(jì)算其甲基化水平，公式為：ML=mC/（mC+umC）。其中ML 為甲基化水平，mC 和umC 分別代表甲基化C和未甲基化C 的個(gè)數(shù)。使用20 Kbp/bin 分序列環(huán)境計(jì)算各個(gè)bin 內(nèi)甲基化水平。通過(guò)MethylDackel 工具提取每個(gè)樣本甲基化情況，利用DSS R 包篩選閾值為Cutoff 10%和P＜0.05 進(jìn)行組間差異甲基化區(qū)域分析。使用ChIPseeker 軟件對(duì)其進(jìn)行功能區(qū)域注釋，當(dāng)差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）與特定基因功能元件有重疊時(shí)，將相應(yīng)的基因挑選出來(lái)，稱為DMR 相關(guān)基因。對(duì)Promoter 上基因集行GO、KEGG、Reactome 富集分析。甲基化分析流程圖見(jiàn)圖2。

圖2 甲基化分析流程圖

2 結(jié)果

2.1 甲基化水平分析圖表

2.1.1 各位點(diǎn)甲基化水平 對(duì)于鑒定出的甲基化位點(diǎn)，計(jì)算其甲基化水平，統(tǒng)計(jì)各個(gè)序列環(huán)境（CG、CHG、CHH，H 代表A 或者T）下C 位點(diǎn)的甲基化水平，見(jiàn)表1。

表1 各序列C 位點(diǎn)的甲基化水平

2.1.2 各樣本甲基化水平的關(guān)系 對(duì)各樣本間使用20 Kbp/bin 分序列環(huán)境計(jì)算各個(gè)bin 內(nèi)甲基化水平后做Pearson 相關(guān)性分析，顯示相關(guān)系數(shù)約在1左右，表明樣本之間甲基化模式的相似度較高，見(jiàn)圖3。

圖3 樣本甲基化相關(guān)性分析圖

2.1.3 甲基化主成分分析 對(duì)各樣本間進(jìn)行甲基化主成分分析（PCA），橫坐標(biāo)表示第一主成分的分量，縱坐標(biāo)表示第二主成分的分量。圖中橢圓表示樣本聚集中心，圖中點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離反應(yīng)樣本間相似性或者差異性。圖中可見(jiàn)健康對(duì)照組與食管鱗癌診斷組數(shù)據(jù)擬合性較高，同時(shí)相同分組間樣本差異較小體現(xiàn)了數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，見(jiàn)圖4 。

圖4 樣本間甲基化情況PCA 分析結(jié)果圖

2.2 差異甲基化基因篩選及富集通路分析 通過(guò)兩組間差異甲基化水平比較分析，最終得到差異甲基化區(qū)基因共9354 個(gè)，其中有1136 個(gè)位于Promoter 上。Promoter 區(qū)診斷組甲基化水平高于健康對(duì)照組甲基化水平的基因有553 個(gè)。結(jié)合GO、KEGG、Reactome 功能富集與食管鱗癌相關(guān)的排名前4 位基因分別為AXIN1、EPS15、CACTIN、E2F1，基因所在染色體位置見(jiàn)表2，基因相關(guān)富集通路見(jiàn)表3。

表2 基因所在染色體位置

表3 基因相關(guān)富集通路

3 討論

ctDNA 甲基化檢測(cè)在ESCC 檢測(cè)中前景廣闊。本研究使用了高通量EM-Seq 對(duì)4 對(duì)ESCC 樣本和健康樣本的全基因組ctDNA 甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。EM-Seq 鑒定出的DMR 幾乎跨越了整個(gè)基因組，具有足夠的深度和高分辨率，且DMR 的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)方法檢測(cè)到的數(shù)量，表明該方法代表了用于ctDNA 甲基化組研究的有效方法[20]。本研究中，通過(guò)EM-Seq 共鑒定了9354 個(gè)差異表達(dá)基因，其中位于啟動(dòng)子區(qū)診斷組甲基化水平高于健康對(duì)照組甲基化水平的基因有553 個(gè)。通路分析突出了許多與ESCC 癌變密切相關(guān)的通路，如DNA 損傷修復(fù)、Wnt 信號(hào)通路、EGFR 信號(hào)通路和NF-kB 信號(hào)通路，為理解ESCC 發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的線索。

鑒于ctDNA 甲基化在啟動(dòng)子區(qū)的影響，結(jié)合富集分析和通路分析，DMR 在與DNA 損傷修復(fù)、Wnt信號(hào)通路、EGFR 信號(hào)通路和NF-kB 信號(hào)通路和許多生物學(xué)通路相關(guān)的基因中被鑒定出來(lái)，這些基因與癌變密切相關(guān)。因此，本研究選擇了診斷組甲基化水平高于健康對(duì)照組甲基化水平前4 位基因進(jìn)行進(jìn)一步研究：AXIN1、EPS15、CACTIN、E2F1。AXIN1 是一種多結(jié)構(gòu)域的支架蛋白，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌變等，AXIN1通過(guò)Wnt 信號(hào)通路促使腫瘤進(jìn)展在胃癌中尚有報(bào)道[21]。AXIN1 可能通過(guò)Wnt 信號(hào)通路促使了食管鱗癌的發(fā)生。EPS15 是表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的一種蛋白酪氨酸激酶底物，參與EGFR 的內(nèi)吞和分泌，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的多功能銜接蛋白下調(diào)生長(zhǎng)因子信號(hào)的傳導(dǎo)，對(duì)一些腫瘤患者的發(fā)生等產(chǎn)生影響[22]。EPS15 在部分腫瘤細(xì)胞及組織中表達(dá)異常，與腫瘤的形成與發(fā)展可能相關(guān)[23]。CACTIN是剪接體復(fù)合物C 的組分，參與細(xì)胞遷移、調(diào)控固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，有助于調(diào)節(jié)NF-KB 靶基因的轉(zhuǎn)錄活化，在胃癌細(xì)胞中尚有研究[24，25]。E2F1 為轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在細(xì)胞周期進(jìn)展、DNA 復(fù)制、DNA 修復(fù)、細(xì)胞分化、增殖與凋亡等細(xì)胞過(guò)程中起調(diào)控作用，E2F1 可促腫瘤發(fā)生或促凋亡，是許多人類癌癥中突變的主要腫瘤抑制因子[26]。本研究中E2F1 可能通過(guò)DNA 的損傷修復(fù)調(diào)節(jié)食管鱗癌進(jìn)展。

綜上所述，全基因組ctDNA 啟動(dòng)子區(qū)的食管鱗癌基因AXIN1、EPS15、CACTIN 和E2F1 高甲基化水平可能參與了食管鱗癌的發(fā)病機(jī)制，可為篩選ESCC 診斷生物標(biāo)志物作參考。雖然本研究探討了食管鱗癌基因AXIN1、EPS15、CACTIN 和E2F1 高甲基化在食管鱗癌的診斷中的應(yīng)用價(jià)值，但還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其作為診斷標(biāo)志物的具體應(yīng)用價(jià)值，以及更多的細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步探索相關(guān)通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色。