基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討小承氣湯治療慢性腎臟病的有效成分和作用機(jī)制

宋志欣，孫尚萍，廖書恒，甘元偉

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000；2.遵義市中醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義 563000）

近年來慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患病率呈明顯上升趨勢，影響著全球8%～10%的人口，美國每年產(chǎn)生約480 億美元的醫(yī)療費(fèi)用[1]。我國18 歲以上人群CKD 患病率約為10.8%，在20年間,全球CKD 相關(guān)的死亡數(shù)量上升82.3%[2]。CKD的治療強(qiáng)調(diào)積極治療原發(fā)病，避免和糾正腎功能惡化的危險因素，防止發(fā)展至終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）[3]。目前臨床主要治療方法是腎臟替代治療，當(dāng)患者處于圍透析期時，由于疾病負(fù)擔(dān)重、并發(fā)癥多、影響疾病進(jìn)展的因素復(fù)雜，導(dǎo)致死亡風(fēng)險增高[4]。腎移植是目前最佳的腎臟替代療法，但因腎源的稀缺和昂貴的醫(yī)療費(fèi)用，以及腎移植后相關(guān)的排斥反應(yīng)、免疫抑制劑治療、感染等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[5]。故探索新的治療方法來延緩CKD的進(jìn)展，提高患者生存期和生存質(zhì)量具有重要意義。小承氣湯是古代經(jīng)典名方，配伍精煉主治明確，常被作為主方進(jìn)行加減運(yùn)用，可治療急性呼吸窘迫綜合征[6]、改善脾虛小鼠的胃腸動力不足[7]。研究表明[8，9]，小承氣湯加減灌腸聯(lián)合血液透析可改善腎功能、糾正電解質(zhì)紊亂、降低炎癥因子水平。另有研究根據(jù)CKD 濕毒、濁毒的特點(diǎn)，認(rèn)為運(yùn)用小承氣加減可通腑利濕泄?jié)醄9]。且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究小承氣湯治療粘連性腸梗阻的機(jī)制中發(fā)現(xiàn)[10]，其可能與抗癌、炎癥性腸病等通路有關(guān)。為了揭示小承湯治療CKD 的潛在作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以挖掘小承氣湯治療CKD 的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯藥物組分挖掘、篩選、潛在成分靶點(diǎn)預(yù)測 Herb（http://herb.ac.cn）數(shù)據(jù)庫提取大黃、枳實(shí)、厚樸的成分，化合物符合Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 中2 種及以上的類藥性原則，則具有較好的成藥潛力[11]；腸胃吸收（gatrointestinal absortion，GI absortion）結(jié)果為“High”，則該化合物具有較好的口服生物利用度。將有效活性成分Smile式導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫，活性成分取“probability”值大于0 作為潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 “中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖”的構(gòu)建 Cytoscape3.9.2 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，并依據(jù)中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)中的degree 值，選出核心成分。

1.3 CKD 疾病靶點(diǎn)的篩選及靶點(diǎn)圖的制作 以“Chronic kidney diseases”為關(guān)鍵詞在DrugBank（https://www.disgenet.org）搜索CKD 的疾病潛在靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與成分靶點(diǎn)取交集，運(yùn)用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es）繪制韋恩圖。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String（https://cn.string-db.org/），進(jìn)行蛋白互作（protein protein interaction，PPI）分析，將物種類型選擇為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest co-nfidence＞0.4”。結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.2 中進(jìn)行可視化分析，CytoNCA 插件篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 KEGG 通路富集及GO 功能分析 交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov），選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)置P＜0.01，GO 功能分析選取細(xì)胞組分（cellular Component，CC）、生物過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF），分別選前10 個條目，微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）繪制小承氣湯治療CKD 所參與的主要信號通路和CC、BP、MF 氣泡圖。

1.6 分子對接驗(yàn)證 根據(jù)以上研究結(jié)果，CytoNCA 插件選出排名前3 的核心基因作為受體與排名前3 的核心成分作為配體進(jìn)行分子對接，分析受體與配體的結(jié)合能和相互作用模式。Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載配體的2D 結(jié)構(gòu)，Chem3D 軟件最小化，使配體處于最低勢能；在Uniport（https://www.uniprot.org/）獲取受體3D 結(jié)構(gòu)，使用Pymol 軟件去水、去殘余配體。AutoDockTools1.5.6把蛋白質(zhì)去水、加氫選為受體，小分子加氫設(shè)為配體，檢測扭轉(zhuǎn)中心及扭轉(zhuǎn)鍵，文件設(shè)置為對接格式，AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接。Discovery Studio 2021 Clien 軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分大黃57 種、枳實(shí)48 種、厚樸62 種活性成分，對應(yīng)靶點(diǎn)共704 個，根據(jù)中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有效成分的count 值得到排名前3 的活性成分見表1。

表1 排名前3 核心成分

2.2 中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖 將篩選后3 味中藥活性成分和對應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，構(gòu)建藥物、活性成分、靶點(diǎn)作用關(guān)系，將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.2 軟件建立中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，CytoNCA 插件計算每個節(jié)點(diǎn)degree 值，該網(wǎng)絡(luò)共有711 個節(jié)點(diǎn)，3180 條網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “藥物-疾病”靶點(diǎn)圖 CKD 靶點(diǎn)基因1074 個，交集靶點(diǎn)共169 個，見圖2。

圖2 “疾病-藥物”靶點(diǎn)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫后得到PPI 網(wǎng)絡(luò)文件。該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)169 個，邊數(shù)2331，平均節(jié)點(diǎn)度27.6，平均局部聚類系數(shù)0.565，P＜0.05。另將String 數(shù)據(jù)庫中得到的文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.2 中進(jìn)行可視化分析，見圖3。

圖3 PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化

2.5 KEGG 通路富集及GO 功能分析 KEGG 分析顯示，脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、PI3-Akt 信號通路、NF-κB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-7、胰島素抵抗、Toll 樣受體信號通路、趨化因子信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、甲狀旁腺激素的合成及分泌等可能參與了小承氣湯治療CKD 的過程，見圖4；GO 分析顯示，BP 有RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、對細(xì)胞凋亡的負(fù)面監(jiān)管、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化炎癥反應(yīng)等；MF 有蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚體活性等；CC 有質(zhì)膜、胞漿、細(xì)胞外區(qū)等，見圖5。

圖4 KEGG 通路富集分析

圖5 GO 功能分析

2.6 分子對接 對排名前3 的核心基因和核心成分進(jìn)行分子對接，結(jié)合能＜-5 kcal/mol 表示對接成功[12]，結(jié)合能越低，受體與配體的親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定[13]。VEGFA 與magnolignan a 結(jié)合能最低，結(jié)合高度穩(wěn)定。受體與配體結(jié)合能見表2，分子對接可視化圖見圖6。

圖6 VEGFA 與Magnolignan-a 對接圖

表2 受體與配體結(jié)合能

3 討論

根據(jù)CKD 的臨床表現(xiàn)，祖國醫(yī)學(xué)將其歸屬于“關(guān)格”“癃閉”“水腫”“溺毒”“腎勞”等范疇。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)將其統(tǒng)稱為腎衰病，指因腎臟疾病日久、病情遷延所致腎氣漸衰，氣化失司，開闔失常，濕濁、溺毒不得下泄，以少尿甚或無尿，或以精神萎靡，面色無華，惡心納差，肢體浮腫為主要癥見的一類病證[14]。清代李用粹《證治匯補(bǔ)》提出關(guān)格的病機(jī)為“濁邪壅塞三焦，正氣不得升降……陰陽閉絕”[15]。CKD 本虛多考慮為肺、脾、腎三臟的虛損，標(biāo)實(shí)是指濕濁、水濕、氣滯、瘀血等病理產(chǎn)物[16]。王自敏教授將CKD 中醫(yī)病機(jī)概括為“虛、濁、瘀、毒”[17]。脾腎虧虛，脾失輸布，水濕運(yùn)化失權(quán)，水濕內(nèi)停，蘊(yùn)結(jié)生熱，以致濕熱內(nèi)蘊(yùn)；肺失宣降，通調(diào)水道失職而加重濕邪的停滯，濕邪久停成濁而為濁毒之患，濁毒為穢濁之性，困阻中焦，氣機(jī)痞塞，濁陰不降，濁毒上泛而見惡心、嘔吐、口粘，甚至口臭或有尿味[18]。

國醫(yī)大師鄒燕勤認(rèn)為在腎衰病長期病變過程中，脾腎虧虛不斷加重濕熱、濁毒、瘀血等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生，三者作為致病因素又使脾腎虛損愈重，相互影響，形成惡性循環(huán)；且脾腎虛損為本，濕熱、濁毒、瘀血既是病理產(chǎn)物，又是致病因素，病久濕濁、瘀血相互膠結(jié)、纏綿難解，形成本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)互見的錯綜復(fù)雜的病理機(jī)制[19]。腎衰病的病因病機(jī)雖復(fù)雜，總屬濕濁毒內(nèi)蘊(yùn)、脾腎虧虛。段光堂教授認(rèn)為本虛為脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)為濕濁、濁毒、瘀血等濁邪阻滯，在治療上通腑泄?jié)?，化瘀通絡(luò)等祛邪法貫穿始終[20]。郭恩綿教授治療上以泄?jié)峤舛緸橄?，注重通腑泄?jié)峤舛?，扶正次之，?qiáng)調(diào)不可過度滋補(bǔ)，以防留邪之弊[21]。張寧教授主張?jiān)谘a(bǔ)益脾腎的同時，應(yīng)注重活血通絡(luò)，祛濕泄?jié)岱ǖ倪\(yùn)用[22]。根據(jù)CKD 濕濁毒的特點(diǎn)，臨床提出運(yùn)用小承氣加減降濁排毒。

本研究結(jié)果顯示，小承氣湯治療CKD 的主要成分可能為厚樸中的木蘭木脂素a、木蘭水楊素和大黃中的3，4，5 三羥基苯甲酸。厚樸可以通過阻止PI3K/Akt 信號通路，抑制炎性因子的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抗炎的作用[23]，并通過減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及抑制凋亡改善腎缺血再灌注[24]。內(nèi)毒素刺激的人腎小球系膜細(xì)胞模型中，厚樸通過抑制炎性因子水平，有效保護(hù)腎損傷[25]。TGF-β 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)生成腎纖維化，大黃通過抑制TGF-β 表達(dá)，降低尿素和肌酐[26]。在糖尿病腎病大鼠模型，p38 MAPK 信號通路被大黃抑制，纖維連接蛋白表達(dá)下調(diào)，并阻止了腎小球的纖維化[27]。此外，大黃通過下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的Toll 樣受體4 活化的表達(dá)，使TNF-α 與IL-6調(diào)整合成，保護(hù)腎臟細(xì)胞，減少腎臟纖維化[28]?？傊?，大黃和厚樸通過不同的通路保護(hù)腎臟，但目前對于相關(guān)成分的研究仍欠缺，故經(jīng)典名方小承氣湯治療CKD 的作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。

GO 分析顯示，基因表達(dá)的正調(diào)控、對細(xì)胞凋亡的負(fù)面監(jiān)管、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程參與疾病靶點(diǎn)和信號通路的作用過程。在腎缺血再灌注中，JAK2/STAT3 信號通路通過上調(diào)細(xì)胞間黏附分子和單核細(xì)胞趨化蛋白的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮與白細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致腎臟中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的積累[29，30]。腎炎模型大鼠腎組織中STAT3mRNA 表達(dá)明顯增強(qiáng)，下調(diào)腎炎大鼠STAT3 表達(dá)，下游產(chǎn)物的表達(dá)因此降低，繼而系膜增殖程度下降，平滑肌肌動蛋白表達(dá)減少[31]。纖維化啟動的重要因素是炎癥因子，持續(xù)的炎癥刺激，激發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤和腎小管上皮細(xì)胞活化[32，33]。蛋白質(zhì)磷酸化通過其下游目的蛋白特定的氨基酸位點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞分化、生長、凋亡和增殖等一系列復(fù)雜的生物過程[34]。

KEGG 通路富集分析顯示，小承氣湯治療CKD是多通路參與的過程?；|(zhì)金屬蛋白酶、血管生成素2 是動脈粥樣硬化相關(guān)生物標(biāo)志物，基質(zhì)金屬蛋白酶可干預(yù)腎纖維化從單核細(xì)胞浸潤到細(xì)胞增殖和瘢痕形成的所有階段?；|(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)家族蛋白酶參與的過程均會導(dǎo)致腎功能的進(jìn)行性下降[35]。CKD 患者血液循環(huán)中的血管生成素2 水平與C 反應(yīng)蛋白水平相關(guān)，血管生成素2 水平升高是CKD 患者遠(yuǎn)期死亡率的預(yù)測指標(biāo)[36]。而CKD 患者的尿毒癥環(huán)境、氧化應(yīng)激和促炎因子的失衡等共同作用促進(jìn)了動脈粥樣硬化[37]。PI3K-AKT 通路在腎組織調(diào)節(jié)自噬中發(fā)揮著不可或缺的作用[38]。PI3KAkt 通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路，與細(xì)胞增殖、遷移、生存、足細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)等廣泛的生理事件相關(guān)。Li D 等[39]研究表明，阻斷PI3K-Akt 通路有助于恢復(fù)足細(xì)胞粘附能力損傷和自噬活性。NF-κB 信號通路參與腎組織的炎癥反應(yīng)[40]。TNF-α、TGF-β1、IL 等炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，通過銜接蛋白最終激活I(lǐng)κB 激酶復(fù)合物，使IκB 磷酸化及降解，然后激活NF-κB，在核內(nèi)調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，活化的NF-κB 又可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)，如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、單核細(xì)胞趨化因子-1等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎臟損害及腎纖維化[41，42]。

PPI 結(jié)果顯示，小承氣湯治療CKD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)有AKT1、TNF、V-EGFA 等。AKT1 是蘇氨酸蛋白激酶，為細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、血管生成和代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子[43]。有研究證明[44]，在未行對側(cè)腎切除術(shù)的小鼠模型中，AKT1 基因缺失導(dǎo)致在急性腎損傷進(jìn)展過程中腎間質(zhì)纖維化和腎小管脫分化的衰減。TNF 途徑刺激細(xì)胞損傷和凋亡，來募集炎癥細(xì)胞，引起腎小管間質(zhì)變化[45]。VEGFA 通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、增殖和分化，在維持腎小球?yàn)V過屏障中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGFA 還通過增加血管通透性、白細(xì)胞黏附、細(xì)胞間黏附分子1 和血管細(xì)胞黏附分子1 的表達(dá)參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)在糖尿病腎病中[46]。

分子對接可預(yù)測蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合位點(diǎn)，并評估結(jié)合親和力，是藥物發(fā)現(xiàn)中常用的方法。本研究中分子對接結(jié)果顯示，VEGFA 和magnolignan a結(jié)合能最低。受體和配體相互作用的關(guān)鍵殘基顯示，受體GLN 上L 鏈的38 號位和THR 上L 鏈的85 號位通過常規(guī)氫鍵相互作用；受體PRO 上的H 鏈的41 號位和VAL 上的40 號位通過Pi-烷基相互作用；受體GLN 上H 鏈的39 號位通過碳?xì)滏I相互作用，故受體和配體因此而結(jié)合。

綜上所述，小承氣湯治療CKD 的作用機(jī)制具有多成分、多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。本研究初步探索了小承氣湯治療CKD 的理論依據(jù)，為今后研究小承氣湯治療CKD 的臨床觀察和動物物研究中提供了證據(jù)和思路。此研究的源自于各大數(shù)據(jù)庫，存在一定的空間和時間限制，故只能提供理論基礎(chǔ)，后期將進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。