基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的金匱腎氣丸治療阿爾茨海默病機(jī)制研究

羅燕燕，季文瑩，孫 倩，馬琴國，張柏桃，王婷婷

（1.甘肅省中醫(yī)院藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省中醫(yī)院心功能檢查科，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是首次被德國精神病學(xué)家和神經(jīng)發(fā)病學(xué)家Alzheimer Alois發(fā)現(xiàn)并命名。AD 又稱老年癡呆，多發(fā)于65 歲以上人群，是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，以記憶力逐漸減退、認(rèn)知功能發(fā)生障礙、行為異常和社交障礙為臨床表現(xiàn)[1，2]。據(jù)報道[3]，至2050 年，全世界范圍內(nèi)AD 患者從當(dāng)前的360 萬將增至3 倍。隨著不斷深入研究，AD 的發(fā)病機(jī)制逐漸明了，主要包括：膽堿能神經(jīng)元假說、Aβ（β-淀粉樣蛋白）毒性假說、Tau 蛋白假說、炎癥假說、胰島素假說、氧化不平衡假說和基因突變假說等[4，5]，但其易受自然環(huán)境因素，比如：過渡金屬元素、空氣污染，人文環(huán)境因素，遺傳等多因素，具有難治愈性。雖然卡巴拉汀、加蘭他敏及多奈哌齊等乙酰膽堿酯酶拮抗劑的出現(xiàn)填補(bǔ)了治療AD 無效的空白，但此類藥物僅可以適度改善患者的癥狀，均達(dá)不到治愈病情的效果，且易產(chǎn)生耐藥性及副作用[4]。因此尋找毒副作用較小、能夠發(fā)揮多層次、多靶點的藥物也是當(dāng)務(wù)之急，而中醫(yī)藥的整體性和多成分性的特點與AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性、綜合性的特征相吻合。淫羊藿苷、梔子苷、五味子藤莖提取物、積雪草乙醇提取物、荔枝核皂苷、枸杞子、六味地黃丸、滋養(yǎng)心臟湯、天麻鉤藤飲、還腦益聰方、開心散、六位地黃湯經(jīng)實驗證實均對AD 有一定療效[6]。因此開展對中藥及其復(fù)方的研究治療AD 具有廣闊的研究前景。

金匱腎氣出自漢代醫(yī)圣張仲景的《金匱要略》，由桂枝、附子、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉組成[7]，在1998 年出版的《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品準(zhǔn)則·中藥成方制劑》中收錄的中成藥金匱腎氣丸增加了牛膝（去頭）和車前子[8]，其具有“溫補(bǔ)腎陽，化氣行水”之功效，臨床常用于治療肢體浮腫、腎陽不足、生殖功能減退、腰膝酸軟等疾病?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，其可通過調(diào)節(jié)AD 患者的神經(jīng)系統(tǒng)及其機(jī)體激素水平[9]來發(fā)揮治療AD 的作用，但其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制仍不完全清楚。本研究通過構(gòu)建“活性成分-靶點”多層次網(wǎng)絡(luò)，利用網(wǎng)絡(luò)分析并闡述金匱腎氣丸對AD 的干預(yù)及影響，從而更好地了解對金匱腎氣丸對AD 的治療作用。

1 資料與方法

1.1 金匱腎氣丸中化合物及靶點收集 借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺（TCMSP，http://old.tcmsp-e.com/index.php），分別以金匱腎氣丸全方的“熟地黃”“山藥”“牛膝”“車前子”“桂枝”“附子”“山茱萸”“牡丹皮”“茯苓”“澤瀉”為關(guān)鍵詞搜索化合物成分及其靶點，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 為條件篩選活性成分。

1.2 AD 靶點集的獲取及金匱腎氣丸治療AD 的潛在作用靶點預(yù)測 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/），以“Alzheimer's Disease”作為關(guān)鍵詞，獲得疾病靶點集。利用R 軟件，將疾病靶點集與藥物靶點進(jìn)行映射，提取二者交集靶點。

1.3 韋恩分析和蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過R 軟件中的“VennDiagram packages”分析活性成分靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)的篩選結(jié)果，獲得治療AD 的靶標(biāo)蛋白基因，將其輸入到String 數(shù)據(jù)庫（http://cn.string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 金匱腎氣丸治療AD 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析 利用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建“組分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)”，以更直觀地分析用于疾病的藥物（化合物）的治療機(jī)制。

1.5 GO 分析和KEGG 分析 Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫（http://geneontology.org/）包括分子功能（MF）、生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC），可用于識別高通量基因組的生物學(xué)機(jī)制或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。本研究利用R軟件中的“ClusterProfiler”軟件包進(jìn)行GO 和KEGG分析。GO 和KEGG 富集分析結(jié)果中，Y 軸代表途徑名稱，X 軸代表富集因子（目標(biāo)基因中屬于該途徑的基因數(shù)量/背景基因集中所有途徑基因的數(shù)量）。氣泡大小表示屬于目標(biāo)基因中途徑的基因數(shù)量。研究將閾值設(shè)置為P＜0.05。最后，再將KEGG 結(jié)果利用Cytoscape 構(gòu)建KEGG 網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點的大小代表富級的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸及四逆散活性成分及靶點預(yù)測TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到金匱腎氣丸131 個活性化合物，如谷甾醇（sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、玉蘭脂素B（Denudatin B）、海風(fēng)藤酮（Kadsurenone）、漢辛酚（hancinol）、亞麻酸乙酯（Ethyl linolenate）、丁子香萜（Mairin）、山奈酚（kaempferol）、兒茶素（catechin）、澤瀉醇B（alisol B）、澤瀉醇C（alisol C）、黃連素（berberine）、黃連堿（coptisine）、漢黃芩素（wogonin）、二氫楊梅素（Dihydrotricetin）、羥基蕪花素（Hydroxygenkwanin）、遠(yuǎn)華蟾毒精（Telocinobufagin）、四氫雞腳木堿（Tetrahydroalstonine）、惰堿（gnavine）、菊石堿（jesaconitine）等，共得216 個化學(xué)成分靶點。

2.2 AD 蛋白基因靶點預(yù)測 利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到8718 個AD 相關(guān)蛋白基因。

2.3 韋恩分析與PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將216 個靶點與AD靶點進(jìn)行韋恩分析，得176 個個共同靶點。其后將176 個共同靶點輸入到String 分析并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖1）。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，以最低要求互動得分（minimum required interaction score）大于0.9 為篩選條件，節(jié)點代表由單個蛋白質(zhì)編碼基因位點產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)存在關(guān)聯(lián)，得到金匱腎氣丸蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖涉及175 個節(jié)點，567 條邊，該網(wǎng)絡(luò)的平均度值為6.48，其后利用Cytoscape 軟件的NetworkAnalyzer 功能分析網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，依據(jù)拓?fù)鋮?shù)連接度（degree）、介度（betweeness）和緊密度（closeness）對化合物或靶點的重要性進(jìn)行評估，度值越大表明參與生物功能越多，如HSP90AA1、MAPK1、AKT1、JUN、RELA、FOS、ESR1、MAPK14、MYC 等靶標(biāo)，見圖2。

圖1 韋恩分析

圖2 PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析

2.4 金匱腎氣丸活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析 用Cytoscape 軟件構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖3。結(jié)果表明，金匱腎氣丸活性成分有谷甾醇、豆甾醇、玉蘭脂素B、海風(fēng)藤酮、漢辛酚、亞麻酸乙酯、丁子香萜、山奈酚、澤瀉醇C、黃連素、黃連堿、漢黃芩素、二氫楊梅素、羥基蕪花素、遠(yuǎn)華蟾毒精、四氫雞腳木堿、惰堿、菊石堿等，化學(xué)成分靶點有NOS2、PTGS1、PTGS2、DPP4、HSP90AA1、PRSS1、NCOA2、NCOA1、CALM1、HTR、ACHE、PGR NCOA2、NR3C2、PGR、NCOA2、AR、PPARG、DPP4、RXRA 等，活性化合物可以作用于多個靶點，多個生物活性化合物也可以作用于一個靶點。

圖3 化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析

2.5 GO 分析和KEGG 分析 對排在前10 的富集條目通過進(jìn)行展示，見圖4，金匱腎氣丸共富集到176個生物過程，主要參與對藥物的反應(yīng)（Reactions to drugs）、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、細(xì)菌起源分子的反應(yīng)，膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、酰胺結(jié)合（amide binding）等。KEGG 通路富集分析到163 個條目，提示靶點主要與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（Prostate cancer）等相關(guān)，見圖5。上述分析結(jié)果表明，金匱腎氣丸的主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝途徑中，“多成分、多靶點、多途徑”的相互調(diào)節(jié)是治療AD 機(jī)制。

圖5 KEGG 分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)融合，利用生物系統(tǒng)結(jié)合計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)分析以了解藥物活性成分、靶標(biāo)蛋白和疾病之間的潛在通路機(jī)制，這符合中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念，為中藥的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個全新的視角和解決對策。研究發(fā)現(xiàn)，AD 發(fā)病機(jī)制與膽堿能神經(jīng)元假說、Aβ（β-淀粉樣蛋白）毒性假說、Tau 蛋白假說、炎癥假說、胰島素假說、氧化不平衡假說和基因突變假說相關(guān)[4，5]，且具有難治愈性。當(dāng)前，乙酰膽堿酯酶拮抗劑雖填補(bǔ)了治療AD 無效空白，但此類藥物只能適度改善患者癥狀，但均達(dá)不到治愈病情的效果，且易產(chǎn)生耐藥性及副作用[4]。成分-靶點網(wǎng)絡(luò)顯示，去氧穿心蓮內(nèi)酯、水黃皮素、小檗堿、黃芩素、菠菜甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、白芥子苷等活性成分均可作用于HSP90AA1、MAPK1、AKT1、JUN、RELA、FOS、ESR1、MAPK14、MYC、EGFR、RXRA、IL6 等多個靶標(biāo)，涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等。研究也表明小檗堿可降低人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4 細(xì)胞及AD 兔模型中的β 淀粉樣蛋白含量，逆轉(zhuǎn)AD 轉(zhuǎn)基因小鼠模型中神經(jīng)元突觸中的Aβ 淀粉樣的病理狀態(tài)、神經(jīng)膠質(zhì)增生及海馬神經(jīng)變性[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)[11]，小檗堿可有效降低誘癌素A 誘導(dǎo)的Tau 蛋白的過磷酸化，而磷酸化的過度表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）破壞其調(diào)節(jié)軸突運(yùn)輸?shù)恼９δ?，并?dǎo)致可溶性Tau 蛋白和有毒物質(zhì)的形成。黃芩苷可影響抑郁癥病理生理學(xué)中腦結(jié)構(gòu)中神經(jīng)元活力和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)水平，通過調(diào)節(jié)Bax，Bcl-2 和裂解的caspase-3 的表達(dá)，激活A(yù)CE2/Ang-（1-7）/Mas 軸來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能紊亂和氧化應(yīng)激[12]。β-谷甾醇還可增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，在抗氧化酶合成時不產(chǎn)生急性、亞慢性毒性或異常，還可通過GABA/BDZR 機(jī)制降低過氧化氫酶活性表現(xiàn)出明顯的抗焦慮和抗驚厥作用[13]。

金匱腎氣丸作為溫補(bǔ)腎陽的經(jīng)典方劑之一，中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，五臟陽氣之根，中醫(yī)學(xué)中所論述的“腎藏精”“主骨生髓”“腎主水”“腎主納氣”等功能、而腎陽虛的動物會出現(xiàn)一些未老先衰的癥狀如體質(zhì)量下降、耐力低下、精神萎靡不振、反應(yīng)遲鈍等一系列癥狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)該方對AD 有一定療效，即“從腎論治”[14，15]。該方可通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)由氫化可的松建立腎陽虛模型大鼠血清中雌二醇（estrogen，E2）及T 的激素水平、干預(yù)期間神萎靡不振及反應(yīng)遲鈍等癥狀改善。與之類似，該方還可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸，逆轉(zhuǎn)“勞倦過度、房室不節(jié)”腎陽虛小鼠的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）含量的降低，促使皮質(zhì)類固醇激素激素水平正常化[16]。還可逆轉(zhuǎn)Aβ25～35 建立老年性癡呆大鼠模型皮質(zhì)內(nèi)支持感覺和運(yùn)動神經(jīng)元的存活等功能的NT-3 陽性神經(jīng)元數(shù)目減少，起到防治老年性癡呆作用[17-20]。

綜上所述，金匱腎氣丸治療AD 的機(jī)制可能與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化等相關(guān)信號通路相關(guān)。目前在治療AD 表現(xiàn)出一定的療效，但是通過具體哪些通路尚未完全明確，而且對AD 致病機(jī)制目前還不明確，后續(xù)將結(jié)合藥效及臨床研究對化合物、靶點和通路，進(jìn)行進(jìn)一步驗證。