利用生物信息學(xué)方法分析青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥理作用機(jī)制

張卉青，韋卓純，林 繪，方澤慧，張 越，仲 春，黃衛(wèi)娟

（1.東莞市濱海灣中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科，廣東 東莞 523900；2.青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，山東 青島 266200；3.上海市北蔡社區(qū)衛(wèi)生院藥劑科，上海 200000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的特發(fā)性炎癥性腸病，其發(fā)病機(jī)制受多種因素影響，包括飲食、環(huán)境、遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)失調(diào)等[1-4]。目前臨床上尚無徹底治愈UC 的方法，西醫(yī)治療以控制急性發(fā)作、黏膜修復(fù)、維持緩解、減少復(fù)發(fā)、預(yù)防并發(fā)癥發(fā)生為主，治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、生物制劑等[5]。中醫(yī)將UC 歸為中醫(yī)學(xué)“腸澼”“痢疾”“便血”等病范疇，通過辨證施治給予口服中藥治療或中藥灌腸治療[6，7]。中藥青黛具有清熱、解毒、涼血、定驚的功效，歷代醫(yī)家多用其治療瘡瘍癤毒、驚厥躁動、吐血便血等癥?，F(xiàn)代臨床將其用于促進(jìn)皮膚黏膜愈合、潰瘍性結(jié)腸炎、白血病等[8-10]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探索青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥理作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 青黛相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫獲得青黛的化學(xué)組分，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）及類藥性（drug-likeness，DL）藥物代謝動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行活性成分初步篩選，以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報道補(bǔ)充未檢測到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）對化合物的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 UC 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選以“Ulcerative Colitis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/home/）中獲取UC 相關(guān)靶點(diǎn)，并以DrugBank 數(shù)據(jù)庫（http://www.godrugbank.com）中臨床一線治療藥物的靶點(diǎn)為補(bǔ)充。合并3 個數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值最終得到UC 潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 青黛成分-UC 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R 語言將青黛成分相關(guān)靶點(diǎn)與UC 靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖，獲取兩者共有靶點(diǎn)，即青黛治療UC 的潛在作用靶點(diǎn)。將獲得的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)平臺（http://cn.string-db.org/），生物類型設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互作閾值設(shè)定為“Highest confidence”（＞0.9），其余選項(xiàng)設(shè)為默認(rèn)值，得到蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 共有靶點(diǎn)GO 功能與KEGG 通路富集分析 GO對基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述，將基因功能分為3 個部分：細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）。KEGG 是一個整合基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。將獲取的共有靶點(diǎn)輸入Metascape 數(shù)據(jù)平臺（http://metascape.org/gp/index.html），設(shè)置P＜0.01，進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，對結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到青黛治療UC 的生物功能和信號通路。

1.5 藥物成分-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape3.7.1 構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoScape3.7.1 內(nèi)置工具包分析成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（closenness）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 青黛及UC 靶點(diǎn)的獲取 以“青黛”為關(guān)鍵詞檢索并設(shè)置篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18 后，最終得到其活性成分9 個（表1）。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選得到青黛有效成分的潛在作用靶點(diǎn)64 個。運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫設(shè)定Score≥2 倍中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為UC 的潛在靶點(diǎn)，結(jié)合DisGeNET，DRUGBANK數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充，合并刪除重復(fù)值后，得到1599 個UC相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 青黛主要成分

2.2 青黛-UC 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲取的青黛靶點(diǎn)及UC 治療靶點(diǎn)取交集作韋恩圖（圖1），得到青黛-UC 共同靶點(diǎn)32 個。將32 個共靶點(diǎn)提交至String數(shù)據(jù)庫平臺，得到青黛-UC 共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖1 青黛-UC 韋恩圖

2.3 靶點(diǎn)功能與通路富集 應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對青黛-UC 相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號通路分析，并對結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果顯示青黛與UC 共同靶點(diǎn)在CC 中主要富集條目為細(xì)胞膜的膜閥（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）和膜區(qū)（membrane region）（圖3A）；共同靶點(diǎn)在BP 中主要富集條目為脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、對細(xì)菌源性分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin）、有毒物質(zhì)反應(yīng)（response to toxic substance）等（圖3B）。共同靶點(diǎn)在MF 中主要富集條目為細(xì)胞因子受體（cytokine receptor binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（DNA-binding transcription factor binding）、血紅素結(jié)合（Heme binding）等（圖3C）。青黛治療UC 主要參與的信號通路包括脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（hepatitis B）、EB 病毒感染（epstein-bar virus infection）等疾病相關(guān)信號通路（圖3D），靶點(diǎn)通路富集結(jié)果見表2。

圖3 青黛-UC 共靶點(diǎn)富集分析

表2 青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)通路富集結(jié)果（前20 位）

2.4 藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape 3.7.2 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖4），運(yùn)用CytoScape 3.7.2 內(nèi)置的Network Analyzer 分析青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及靶點(diǎn)見表3、表4。

圖4 藥物成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表3 青黛主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表4 共靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)參數(shù)特征

3 討論

UC 是一種病因不明，主要累及直結(jié)腸黏膜，表現(xiàn)為以結(jié)直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)樘卣鞯穆苑翘禺愋阅c道炎癥性疾病[11]。隨著近年來人民生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，UC 的發(fā)病率逐年增高[12]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[13，14]，我國南方（廣東省中山市）發(fā)病率為2.05/10 萬，北方（黑龍江省大慶市）發(fā)病率為1.64 萬/10 萬。以往研究表明[1-4]，UC的發(fā)病機(jī)制主要涉及環(huán)境、免疫、遺傳因素、腸道粘膜屏障破壞、感染、腸道菌群失調(diào)等。其中，免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞（CD4+T 細(xì)胞、Th17 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）、炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL）、TLR4/NF-κB 信號通路等均參與UC 的發(fā)病過程。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法得到青黛治療UC 的主要活性成分、主要作用靶點(diǎn)及參與調(diào)控的信號通路。通過GO 及KEGG 富集分析，結(jié)果表明青黛治療UC 的主要靶點(diǎn)為RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等。RELA 是NF-κB 家族的重要成員之一，NF-κB 調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡相關(guān)基因表達(dá)，涉及腫瘤、炎癥、免疫反應(yīng)等眾多生理和病理活動。RELA/p65 翻譯修飾后能夠精細(xì)地調(diào)控NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活[15-17]。IKBKB（又名IKKβ）是IKK 復(fù)合物重要的催化亞基，它與催化亞基IKKα 以及IKKγ 共同構(gòu)成IKK 復(fù)合物。IKK 復(fù)合物的磷酸化可以激活NF-κB，使得NF-κB 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列基因表達(dá)[18]。TNF-α 是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠與多種細(xì)胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體中炎癥介質(zhì)的釋放。研究表明[19]，TNF-α 水平的上調(diào)與UC 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）是4 種p38 MAPK之一，可以通過紫外線照射、炎性細(xì)胞因子刺激等激活，在細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程[20]。有研究表明[21-23]，雷公藤多苷、參苓白術(shù)散、葛根芩連湯等多種中藥制劑能夠通過調(diào)p38 MAPK 信號通路治療UC。Caspase 家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其激活或超常表達(dá)均引起細(xì)胞凋亡。有研究表明[24]，青黛可以通過調(diào)節(jié)粘膜炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的表達(dá)，減輕DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜損傷程度，減輕上皮細(xì)胞變性/壞死。青黛還可以顯著降低DSS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤和TNF-α、IL-1β、IL-6 和MCP-1 表達(dá)，同時顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6 和COX-2 的表達(dá)，抑制IKaB-α 降解和NF-κB p65 核易位[25]。

本研究結(jié)果表明，中藥青黛的有效活性成分為雙靛藍(lán)（bisindigotin）、靛苷（indican）、10h-吲哚-[3,2-b]-喹啉（10h-indolo,[3,2-b],quinoline）、異靛藍(lán)（Isoindigo）、靛藍(lán)（Indigo）、6-(3-氧吲哚啉-2-亞基）吲哚并[2,1-b]喹唑啉-12-酮（6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one）及靛玉紅（indirubin）。通過成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，有效成分靛玉紅在與靶點(diǎn)、通路的連接度、介度及緊密度中均具有突出優(yōu)勢，其可能為青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵成分。靛玉紅作為青黛的有效成分，已被證實(shí)其具有抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[26，27]。體外研究表明[28-30]，靛玉紅對脂多糖誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞具有一定的體外抗炎作用，其作用機(jī)制可能為下調(diào)IL-6/TNF-α 的表達(dá)。另研究表明[31]，靛玉紅可以通過降低TGF-β1 水平，上調(diào)INF mRNA 表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥的效果，從而改善三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的癥狀、結(jié)腸病理狀態(tài)。且高劑量的靛玉紅通過降低TNF-α、IFN-γ 含量，增加緊密連接蛋白ZO-1 表達(dá)而發(fā)揮其改善腸上皮屏障功能，消除腸道炎癥[32]。

綜上所述，青黛治療UC 的主要活性成分為靛玉紅，主要通過調(diào)節(jié)RELA、TNF、IKBKB、CASP3、MAPK14、CASP8 等靶點(diǎn)，抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，改善腸道上皮細(xì)胞功能，從而達(dá)到治療UC 的目的。