基于生物信息學(xué)分析二仙湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎合并骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制

汪 青，黃昊強(qiáng)，陳 勇，徐 鋒，彭志堅(jiān)

（昆山市中醫(yī)醫(yī)院骨科，江蘇 昆山 215300）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）及膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）都是年齡相關(guān)的退行性骨骼疾病，兩者在流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制及病理變化等諸多方面有共同點(diǎn)[1]。中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)多途徑的特點(diǎn)，在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥共病治療上具有一定的價(jià)值。二仙湯由上海中醫(yī)藥大學(xué)張伯納教授創(chuàng)制，臨床用于骨質(zhì)疏松癥具有不錯(cuò)的療效；然而該方對(duì)于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥共病治療是否有作用，仍不清楚。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，篩選出二仙湯、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松癥共同的靶點(diǎn)并進(jìn)行分析，旨在為二仙湯臨床治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎與骨質(zhì)疏松癥共病提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

分別以骨質(zhì)疏松癥及膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎作為關(guān)鍵詞，在疾病數(shù)據(jù)庫[Disgenet（https://www.disgenet.org/home/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Genecards（https://www.genecards.org/）]中篩選靶點(diǎn)，其中Disgenet 評(píng)分≥0.1，Genecards 篩選相關(guān)度≥5。在中藥數(shù)據(jù)庫平臺(tái)（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選二仙湯六味中藥（仙茅、仙靈脾、巴戟天、當(dāng)歸、知母、黃柏）的有效化合物，通過Netinfer 平臺(tái)（http://lmmd.ecust.edu.cn/netinfer/）預(yù)測(cè)二仙湯的靶標(biāo)。使用Venny2.1.0 進(jìn)行交集，獲得二仙湯治療OP 合并KOA 的靶點(diǎn)，通過String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.stringdb.org/）制作靶點(diǎn)間相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入cytoscape3.7.2。使用R 語言進(jìn)行GO 生物過程富集分析以及KEGG 通路富集分析，并進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯治療KOA 合并OP 的靶點(diǎn) 通過疾病數(shù)據(jù)庫查詢，共獲得OP 相關(guān)基因共533 個(gè)，KOA 相關(guān)基因共302 個(gè)。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，共獲得二仙湯有效化合物共104 個(gè)，使用Netinfer 平臺(tái)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)共278 個(gè)，取3 者的交集生成韋恩圖，映射出共同靶點(diǎn)14 個(gè)，即二仙湯治療KOA 合并OP 的靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 二仙湯治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎合并骨質(zhì)疏松癥的共同靶點(diǎn)

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因 共同的14 個(gè)基因靶標(biāo)經(jīng)String 數(shù)據(jù)庫在0.4 信度下構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖2，網(wǎng)絡(luò)共有14 個(gè)節(jié)點(diǎn)，具有52 條相互作用關(guān)系，導(dǎo)入cytoscape 軟件并進(jìn)行分析，按照degree 值大小順序，靶標(biāo)有：CXCL8、PTGS2、MMP9、ACE、MMP2、ESR1、MMP3、MMP1、IL2、PPARG、ESR2、VDR、COMT、MMP8，見圖3。

圖2 共同靶點(diǎn)相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（置信度為0.4）

圖3 核心靶點(diǎn)圖（靶點(diǎn)大小為degree 值）

2.3 GO 及KEGG 富集分析 使用R 語言clusterProfiler 包進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析。GO 生物學(xué)過程主要集中在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等，KEGG 主要富集在IL-17、雌激素等，結(jié)果以氣泡圖的形式展示見圖4、圖5。使用cytoscape 軟件繪制二仙湯治療OP 合并KOA 的基因靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互作用圖見圖6，IL-17 信號(hào)通道見圖7，雌激素信號(hào)通路見圖8。

圖4 GO 富集分析結(jié)果

圖5 KEGG 富集分析結(jié)果

圖6 二仙湯治療OP 合并KOA 的基因靶點(diǎn)-信號(hào)通路相互作用圖

圖7 IL-17 信號(hào)通道

圖8 雌激素信號(hào)通路

3 討論

OP 合并KOA 在臨床上十分常見，兩者有一些共同的發(fā)病機(jī)制，包括炎癥、激素、腸道菌群及代謝等。對(duì)于OP 合并KOA，尚沒有特效藥物。中藥具有多靶點(diǎn)多途徑的特點(diǎn)，對(duì)于共病的治療可能具有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，探討二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥合并膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，二仙湯治療OP 合并KOA 的主要靶標(biāo)有CXCL8、PTGS2、MMP9、ACE、MMP2、ESR1、MMP3、MMP1、IL2、PPARG、ESR2、VDR、COMT、MMP8。這些靶標(biāo)大致可以歸類為白介素、雌激素受體、金屬基質(zhì)蛋白酶等。CXCL8，即白介素8（interleukin-8,IL-8），主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有吸引和激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[2]。MMP9、MMP3、MMP1、MMP8 均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其主要的生物學(xué)作用為降解細(xì)胞外基質(zhì)，在骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[3，4]。ESR1 及ESR2 為雌激素受體。雌激素通過與細(xì)胞中的雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用。KEGG 富集在IL-17、雌激素等信號(hào)通道。IL-17由CD+T 細(xì)胞分泌，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞合成分泌多種炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，IL-17 信號(hào)通道參與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等多種骨細(xì)胞的調(diào)控，與骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等多種炎癥性骨病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。雌激素信號(hào)通道能夠調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種骨細(xì)胞的增殖分化，參與骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等多種退行性骨病的病理過程。由此推測(cè)，二仙湯治療OP 合并KOA 的主要機(jī)制可能是調(diào)節(jié)炎癥因子、調(diào)節(jié)性激素水平等途徑。

炎癥是OP 及KOA 發(fā)病的共同病理因素[7]。炎癥因子促進(jìn)骨吸收主要的機(jī)制有炎癥因子促進(jìn)RANKL 的表達(dá)，進(jìn)而刺激破骨細(xì)胞增殖、分化，增強(qiáng)骨吸收能力。研究發(fā)現(xiàn)[8]，IL-8 能夠刺激破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)骨吸收；抑制間充質(zhì)干細(xì)胞活性及成骨分化能力，抑制成骨細(xì)胞功能。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的IL-8 水平升高，并與骨密度呈負(fù)相關(guān)[9]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[10]，血清IL-17 在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松人群中顯著高于對(duì)照組人群。同時(shí)，炎癥也在KOA 的發(fā)病及進(jìn)展起著關(guān)鍵作用。炎癥因子通過關(guān)節(jié)液等其他機(jī)制擴(kuò)散至軟骨中，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。血清及滑膜中IL-17 的水平與KOA 的嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。這些說明炎癥因子與OP 及KOA 的發(fā)生密切有關(guān)。大量的研究證實(shí)[12，13]，二仙湯復(fù)方具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。Wang N 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，二仙湯抑制去卵巢小鼠的炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞活性。楊文昌等[15]發(fā)現(xiàn)二仙湯能夠抑制膝關(guān)節(jié)炎的炎癥因子水平。另外，二仙湯單味中藥，仙茅、仙靈脾、巴戟天等均具有一定的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[16-18]。由此推測(cè)，調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)可能是二仙湯治療OP合并KOA 的一個(gè)機(jī)制。

雌激素水平下降是OP 及KOA 發(fā)生發(fā)展的另一個(gè)重要原因。雌激素與雌激素受體結(jié)合，通過多種途徑調(diào)控骨代謝。雌激素一方面誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，抑制破骨細(xì)胞數(shù)量及破骨細(xì)胞分化，另一方面促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)膠原合成及礦化。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠緩解軟骨細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激[19，20]，減少軟骨細(xì)胞損傷[21]。雌激素能夠抑制雌激素受體介導(dǎo)的滑膜細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡[22]。雌激素受體在骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中表達(dá)，其基因多態(tài)性與OP 及KOA 的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn)二仙湯具有雌激素樣作用。李翠云[24]應(yīng)用二仙湯治療卵巢早衰，結(jié)果表明二仙湯治療后，雌二醇水平升高。項(xiàng)曉覺等[25]的一項(xiàng)研究也表明，二仙湯治療后，雌二醇水平升高，卵泡刺激素水平下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二仙湯能夠調(diào)節(jié)雌激素受體[26]。因此，調(diào)節(jié)雌激素水平及雌激素受體可能是二仙湯治療OP 合并KOA 的另一個(gè)機(jī)制。

綜上所述，OP 合并KOA 在臨床比較常見，其治療方法各異，療效不確定。中藥二仙湯可能能夠通過調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)雌激素及雌激素受體水平，治療OP 及KOA 共病，這為二仙湯的臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。然而，本研究?jī)H從生物信息學(xué)的角度探討，仍存在較大的局限性。后續(xù)將開展臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以明確二仙湯在OP 及KOA 共病治療中的價(jià)值及作用機(jī)制。