不同方法提取的羊棲菜多糖理化性質(zhì)及益生活性

孔秋紅，張瑞芬，曾新安，張名位，馬永軒,3，游麗君

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）（3.廣州力衡臨床營養(yǎng)品有限公司，廣東廣州 510610）

羊棲菜（Sargassum fusiforme）是我國東南沿海地區(qū)廣泛分布的褐藻之一，在我國作為經(jīng)濟(jì)藻類種植已有多年歷史。研究報(bào)道，羊棲菜具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，主要含有多糖、蛋白質(zhì)、維生素和一些微量礦物質(zhì)成分，對(duì)人體健康可產(chǎn)生多種有益的影響[1]。其中，多糖一直是藻類活性成分研究熱點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、抗炎[3]、降血糖、降血脂[4]、抗光老化[5]等作用。但是由于多糖是一類大分子聚合物，近年來許多研究表明其被攝入人和動(dòng)物體內(nèi)后主要通過調(diào)節(jié)腸道菌群，發(fā)揮 “ 益生元 ” 作用促進(jìn)機(jī)體健康[6]。益生元是一類在腸道中能夠選擇性地刺激腸道益生菌生長的活性物質(zhì)[7]。而乳桿菌是能夠?qū)δc道健康產(chǎn)生有益影響的一類益生菌，它們?cè)谀c道內(nèi)可以利用未消化的大分子碳水化合物產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物（如短鏈脂肪酸），對(duì)腸道健康具有重要的作用[8]。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖能夠調(diào)節(jié)腸道中的微生物群并且增加有益菌群的生長，其作為益生元補(bǔ)充劑具有巨大的潛力[9]：飼料中添加褐藻多糖喂食大鼠一周能夠提高老鼠的腸道健康，增加腸道內(nèi)有益菌如產(chǎn)丁酸菌Faecalibacterium prausnitzii的豐度[10]；海帶多糖膳食補(bǔ)充也對(duì)大鼠的腸道內(nèi)有益菌群具有很好的益生作用，并且可以減少大鼠的肥胖現(xiàn)象[11]。目前關(guān)于羊棲菜多糖的益生活性尚未見報(bào)道。

不同的提取方法得到的多糖具有不同的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。大量研究發(fā)現(xiàn)，多糖的益生活性與其單糖組成和分子量等性質(zhì)密切相關(guān)[12-16]。因此，不同的提取工藝對(duì)多糖的理化性質(zhì)與益生活性之間關(guān)系的影響不容忽視。傳統(tǒng)的植物多糖提取方法主要是熱水提取法，該方法簡便易行但提取效率較低。在該法的基礎(chǔ)上增加物理場(chǎng)（如超聲、脈沖電場(chǎng)和微波等）或酶法輔助提取可大大提高多糖的提取率，提高原料利用率。超聲輔助水提法可以通過超聲氣泡的破裂產(chǎn)生空化效應(yīng)，釋放出大量的能量，從而提高多糖提取率[17]；脈沖電場(chǎng)輔助水提法是一種非熱處理新技術(shù)，可產(chǎn)生脈沖波使細(xì)胞瞬間破壁，造成細(xì)胞膜的電位發(fā)生混亂，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，這種方法具有能耗低、作用均勻、處理時(shí)間短和較大程度上保留產(chǎn)品活性等優(yōu)點(diǎn)[18]；生物酶處理能夠以較溫和的方式促進(jìn)植物細(xì)胞的破裂，使細(xì)胞內(nèi)容物更加充分地溶出，從而提高目標(biāo)活性物質(zhì)的提取效率，同時(shí)具有生物相容性好、催化效率高、無毒、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[19]。已有研究報(bào)道，超聲和酶處理能提高一些多糖的益生活性[12,13]。而目前關(guān)于不同提取工藝對(duì)羊棲菜多糖益生活性的影響還未見報(bào)道。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以熱水提取、纖維素酶輔助水提取、超聲輔助水提取和脈沖電場(chǎng)輔助水提取四種方法制備羊棲菜多糖，比較其產(chǎn)物的得率、分子量、單糖組成、流變性質(zhì)及對(duì)乳桿菌的促增殖活性，為羊棲菜多糖的高效制備及潛在的益生活性研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料與試劑：羊棲菜，購自浙江溫州；乳桿菌粉，購自北京川秀科技有限公司；C109262纖維素酶（10,000 U/g），購自上海阿拉丁生化科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、濃硫酸、檸檬酸三銨、七水硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉，均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚，購自廣州市化學(xué)試劑廠；酵母提取物、蛋白胨、牛肉浸粉，均購自麥克林（上海）公司；吐溫80，購自廣州東巨公司；單糖標(biāo)品（巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖），購自美國Sigma公司。

主要儀器：FW135粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；XDW-661振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；SY-E-500脈沖電場(chǎng)提取設(shè)備，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院自行研制；JY NⅡ 細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝有限公司；Hei-VAP Value Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidoph公司；DU 730型核酸蛋白分析儀，美國Beckman Coulter公司；LC-20A高效凝膠滲透色譜儀，日本島津株式會(huì)社；ICS5000離子色譜儀，美國Dionex公司；AR-1500 ex流變儀，美國TA公司；Alpha 1-2 LD Plus冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.2 方法

1.2.1 羊棲菜預(yù)處理

將購自江浙沿海的羊棲菜洗凈曬干，用普通粉碎機(jī)將其進(jìn)行粉碎并過40目篩，再利用超微粉碎機(jī)繼續(xù)處理5 min，最后以1:4（W/V）的料液比加入95%乙醇回流3 h進(jìn)行脫脂脫色，棄去乙醇，再重復(fù)以上步驟加入乙醇繼續(xù)回流1 h兩次，棄去乙醇，50 ℃低溫烘干得到羊棲菜超微粉，置于常溫干燥避光的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羊棲菜多糖的提取

1.2.2.1 熱水提取

參考季德勝[5]的方法，略做修改。稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理得到的羊棲菜超微粉，以1:50（W/V）的料液比加入去離子水，100 ℃下提取4 h，提取完成后將溶液以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上清液，真空旋蒸濃縮至原體積的1/4，加入無水乙醇至濃度為80%置于4 ℃冰箱醇沉12 h，8000 r/min離心10 min，收集沉淀，待乙醇揮發(fā)，加水復(fù)溶，真空凍干得熱水提羊棲菜多糖H-SFP。

1.2.2.2 纖維素酶輔助熱水提取

稱取羊棲菜超微粉，先以料液比1:30（W/V）的比例加入去離子水，再往羊棲菜水溶液中加入最終溶液質(zhì)量0.1%的纖維素酶，攪拌均勻，將其置于50 ℃水浴下反應(yīng)4 h。滅酶后再加入去離子水使終料液比達(dá)到1:50（W/V），將其置于100 ℃水浴提取4 h。后續(xù)步驟如1.2.2.1，得到酶助輔水提羊棲菜多糖E-SFP。

1.2.2.3 超聲輔助熱水提取

稱取羊棲菜超微粉，以1:50（W/V）的料液比加入去離子水，置于細(xì)胞超聲破碎儀中，400 W功率下超聲40 min，反應(yīng)完成后再在100 ℃的水浴條件下提取4 h。后續(xù)步驟如1.2.2.1，得到超聲輔助水提羊棲菜多糖U-SFP。

1.2.2.4 脈沖電場(chǎng)輔助熱水提取

稱取羊棲菜超微粉，以1:50（W/V）的料液比加入去離子水，倒入反應(yīng)槽中，設(shè)置電場(chǎng)強(qiáng)度為3.6 kV/cm，脈沖次數(shù)50次。反應(yīng)完成后在100 ℃的水浴條件下提取4 h。后續(xù)步驟如1.2.2.1，得到脈沖電場(chǎng)輔助水提羊棲菜多糖P-SFP。

1.2.3 多糖得率的測(cè)定

以苯酚-硫酸法[20]測(cè)定總糖含量。

多糖的得率按以下公式計(jì)算：

多糖得率/%=總糖含量×凍干產(chǎn)物質(zhì)量/羊棲菜原料質(zhì)量×100%

1.2.4 多糖分子量的測(cè)定

通過高效凝膠滲透色譜儀測(cè)定多糖的平均分子量，多糖的處理方法如下：稱取2 mg多糖溶于1 mL 0.02 MK2HPO4緩沖液，過0.22 μm無菌水相濾膜，備用。色譜條件參數(shù)設(shè)置為：色譜柱TSK G-5000PWXL（7.8×300 mm）和TSK G-3000PWXL（7.8×300 mm），柱溫35 ℃，檢測(cè)器為Waters 2414示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相0.02 M K2HPO4緩沖液，流速0.6 mL/min。以不同分子量（5.2、11.6、14.8、23.8、48.6、273、410、668 ku）的葡聚糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。多糖樣品的分子量根據(jù)其洗脫出峰時(shí)間對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

1.2.5 單糖組成的測(cè)定

產(chǎn)物的單糖組成通過離子色譜方法測(cè)定，多糖預(yù)處理方法參照Chen等[21]的方法。色譜條件為：色譜柱CarboPac PA20色譜柱，柱溫30 ℃，檢測(cè)器為IC系統(tǒng)，流動(dòng)相為H2O/NaOH，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。以不同濃度的單糖溶液（葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的單糖組成根據(jù)對(duì)應(yīng)峰面積對(duì)照單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算確定摩爾百分比。

1.2.6 流變特性

將不同提取方法得到的羊棲菜多糖樣品配制成濃度為30 mg/mL的溶液，充分溶解，于25 ℃室溫靜置12 h，利用AR-1500 ex流變儀測(cè)定其表觀黏度（直徑為40 mm的鋁板，Gap值為0.500 mm），測(cè)試溫度為25.0 ℃，剪切速率0.01～200 s-1，采用TA Orchestrator-7采集數(shù)據(jù)。

1.2.7 多糖對(duì)乳桿菌促增殖作用研究

1.2.7.1 菌的準(zhǔn)備

將保存于-40 ℃的混合乳桿菌粉（內(nèi)含保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌）稀釋于適量0.9%無菌生理鹽水中制成菌懸液，取200 μL菌懸液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。取活化好的菌液繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液3500 r/min離心10 min，棄去上清液，用0.9%無菌生理鹽水洗滌沉淀兩次，最后加入10 mL生理鹽水重懸菌體制成菌懸液備用。

1.2.7.2 MRS培養(yǎng)基的制備

無碳源MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、檸檬酸三銨2.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、無水乙酸鈉5.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO40.05 g/L和吐溫801.0 g/L。

為評(píng)價(jià)不同提取工藝得到的羊棲菜多糖對(duì)乳桿菌的益生活性，分別按10.0 g/L（1.0%W/V）的量稱取H-SFP、E-SFP、U-SFP、P-SFP樣品作為唯一碳源加入到上述培養(yǎng)基中，每個(gè)樣品做3次平行。此外，以在培養(yǎng)基中加入等量低聚半乳糖GOS作為陽性對(duì)照，以不加糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照。調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基最終pH 6.2±0.2。隨后將培養(yǎng)基置于高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。

1.2.7.3 促增殖作用的測(cè)定

按照4%（V/V）的接種量將1.2.7.1制備好的菌懸液接種至以不同多糖樣品為碳源的培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧培養(yǎng)。在發(fā)酵24 h、48 h時(shí)分別取樣離心（5000 r/min，10 min），加入適量生理鹽水把培養(yǎng)基洗掉，最后用等量生理鹽水重懸，以生理鹽水為空白，在600 nm處測(cè)各組OD值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。采用比濁度法，以O(shè)D600值（即溶液中菌的總菌數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)比較各多糖對(duì)益生菌的增殖作用。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析（one-way ANOVA），采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 羊棲菜多糖的得率

圖1 不同方法提取羊棲菜多糖的得率比較Fig.1 The yields of SFPs extracted by different methods

由于不同提取方法對(duì)細(xì)胞的破壁情況不同，導(dǎo)致多糖的溶出量也不同，因此多糖的得率也各有差異。如圖1所示，四種提取方法中，纖維素酶輔助提取所得的E-SFP得率最高（14.02%），其次為超聲輔助提取U-SFP（12.57%），再者為脈沖輔助提取P-SFP（10.38%），三種輔助提取的方法較之傳統(tǒng)的熱水提取方法都能顯著地提高羊棲菜多糖的得率（p＜0.05），其中纖維素酶輔助提取所得的E-SFP得率為單純熱水提取H-SFP得率的2倍左右。與傳統(tǒng)熱水提取方法相比，用纖維素酶輔助提取方法能較大程度地提高植物多糖的得率，這可能這是由于纖維素酶能特異地對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生破壁作用，還能對(duì)一些難溶或不溶性多糖進(jìn)行水解，促進(jìn)更多細(xì)胞壁多糖和胞內(nèi)多糖溶出，大大提高了羊棲菜多糖的得率。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，周峙苗[22]采用纖維素酶復(fù)合果膠酶（配方比為2:1，添加量12%）再結(jié)合熱水浸提兩次的方法得到羊棲菜多糖，得率達(dá)到14.88%，為熱水浸提多糖得率（6.85%）的2.17倍。Chen等[23]用不同方法提取竹筍多糖，傳統(tǒng)熱水提取所得多糖得率為7.2%，采用酶輔助提取所得多糖得率提高至8.3%，并表現(xiàn)出更好的益生活性。趙晨淏等[24]采用水提法、酶提法、酸提法、超聲法、堿提法5種方法提取龍眼多糖，結(jié)果顯示酶提法得到多糖的得率最高，為6.78%，是最低的堿提法所得多糖得率（1.84%）的3.68倍，并且酶提龍眼多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。因此，利用生物酶法輔助提取多糖不僅可以提高多糖的得率，而且可以較好地提高其生物活性。

2.2 分子量

如表1所示，H-SFP、E-SFP、U-SFP、P-SFP的平均分子量分別為201.32、244.30、218.08、228.52 ku，4個(gè)多糖的平均分子量差別不大，可能本實(shí)驗(yàn)采取的輔助提取的手段主要是破壞細(xì)胞壁，促進(jìn)了多糖特別是一些大分子多糖的溶出，并未對(duì)羊棲菜多糖的特殊結(jié)構(gòu)造成破壞。文獻(xiàn)也曾報(bào)道，Chi等[25]用纖維素酶輔助提取滸苔多糖，發(fā)現(xiàn)EAP的平均分子量比傳統(tǒng)熱水提取多糖HAP高361.5 ku。Hmelkov等[26]采用超聲提取的巖藻多糖F2的平均分子量跟傳統(tǒng)方法提取的多糖F1相比也并未下降，與本文研究結(jié)果相似。

表1 不同方法提取的羊棲菜多糖分子量和單糖組成摩爾百分比Table 1 The molecular weights and monosaccharide compositions of SFPs extracted by different processes

2.3 單糖組成

不同方法提取的羊棲菜多糖的單糖組成結(jié)果如表1所示，羊棲菜多糖主要是由巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖組成，其中，H-SFP的摩爾百分比55.28:1.71:31.59:6.69:4.82；E-SFP 為 47.08:19.57:23.79:5.77:3.78；U-SFP為55.39:1.17:29.99:9.71:3.74；P-SFP為60.00:1.16:27.57:7.44:3.83。結(jié)果表明不同提取方法所得羊棲菜多糖都主要由巖藻糖和半乳糖組成，與季德勝[5]、胡晨曦[1]、楊斯淇[4]等研究一致。有大量文獻(xiàn)表明，巖藻糖作為羊棲菜多糖的一個(gè)主要單糖組成成分，與羊棲菜多糖的活性密切相關(guān)[27]。另外，E-SFP與其他提取方法所得多糖相比，其葡萄糖組成含量高達(dá)19.57%，這可能是因?yàn)槔w維素酶能促進(jìn)細(xì)胞壁纖維溶出，而細(xì)胞壁纖維中的葡萄糖組成較多。

2.4 流變特性

不同提取方法所得羊棲菜多糖的流變特性如圖2所示，在0.01～200 s-1的剪切速率下，隨著剪切速率的增加，4個(gè)多糖的表觀粘度都呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為典型的假塑性特征，最終趨于平緩，表明這些多糖屬于非牛頓流體。在初始范圍內(nèi)的同一剪切速率下，四種多糖的粘度大小跟平均分子量大小排序一致，如在0.11 s-1剪切速率下，粘度由大到小依次為E-SFP＞P-SFP＞U-SFP＞H-SFP，表明分子量和粘度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。另外從變化曲線也可看出，4個(gè)多糖的粘度變化差異不大，與分子量結(jié)果之間的差異保持一致，說明輔助手段并未對(duì)多糖的糖苷鍵和活性基團(tuán)造成破壞。

圖2 不同方法提取的羊棲菜多糖的流變特性Fig.2 Rheological properties of SFPs extracted by different methods

2.5 對(duì)乳桿菌的促增殖作用

乳桿菌屬Lactobacillus是人體內(nèi)一類重要的益生菌，主要有嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌等，這些益生菌會(huì)利用腸道內(nèi)未消化的大分子碳水化合物代謝產(chǎn)生對(duì)人體健康有益的產(chǎn)物，比如短鏈脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸），這些酸性產(chǎn)物還會(huì)進(jìn)一步降低腸道內(nèi)的pH值，抑制腸道內(nèi)有害菌的生長[28]。低聚半乳糖GOS是目前公認(rèn)的益生元之一，因此選擇它作為實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照。

不同方法提取的羊棲菜多糖對(duì)乳桿菌體外增殖活性結(jié)果如圖3所示，發(fā)酵24 h后，空白組Blank在600 nm波長下的吸光值為0.22，H-SFP組、E-SFP組、U-SFP組、P-SFP組的OD600分別為0.37、0.40、0.35和0.34；發(fā)酵48 h后，Blank組的OD600值為0.28，而四個(gè)多糖組H-SFP、E-SFP、U-SFP和P-SFP的值分別達(dá)到了0.46、0.50、0.46和0.46。不管是發(fā)酵24 h還是48 h，4個(gè)多糖對(duì)乳桿菌的促增殖作用均明顯優(yōu)于未加碳源的空白組Blank（p＜0.05），其中促增殖效果最好的是E-SFP（與其它三個(gè)多糖組相比有顯著性差異）。Ajanth等[29]采用生物酶輔助提取方法分別得到三種印度食用海藻的多糖，體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)這三種多糖都能有效地促進(jìn)植物乳桿菌的增殖活性并能增加短鏈脂肪酸的含量。分析上述結(jié)果，表明四個(gè)方法所得羊棲菜多糖都能夠促進(jìn)乳桿菌的生長，具有潛在的益生活性。

圖3 不同方法提取的羊棲菜多糖對(duì)乳桿菌的促增殖作用Fig.3 Proliferation effects on Lactobacillusof SFPs extracted by different methods

3 結(jié)論

在本研究中，采用了4種工藝（傳統(tǒng)熱水提取法、纖維素酶輔助水提法、超聲輔助水提法、脈沖電場(chǎng)輔助水提法）制備羊棲菜多糖，研究了它們的得率、分子量、單糖組成、流變特性和對(duì)乳桿菌的促增殖作用。結(jié)果表明，纖維素酶輔助水提法制備的羊棲菜多糖E-SFP得率最高（14.02%），其次分別為U-SFP（12.57%）、P-SFP（10.38%）、H-SFP（7.07%）；分子量測(cè)定結(jié)果表明4個(gè)多糖的平均分子量在200～245 ku之間；離子色譜結(jié)果顯示4個(gè)多糖主要由巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖組成，其中巖藻糖和半乳糖是主要成分；4個(gè)多糖都是典型的非牛頓流體，且表觀粘度的大小與分子量呈現(xiàn)正相關(guān)；采用體外發(fā)酵法研究羊棲菜多糖對(duì)乳桿菌的促增殖作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組比較，4個(gè)多糖均能在一定程度上促進(jìn)乳桿菌的增殖，其中E-SFP的促增殖作用顯著高于其它三個(gè)多糖（p＜0.05）。綜上所述，采用纖維素酶輔助提取方法能有效地提高羊棲菜多糖的得率，并能較好地促進(jìn)乳桿菌的體外增殖活性。本研究結(jié)果為羊棲菜多糖的高效制備及其益生活性研究提供一定的參考依據(jù)，但是更多關(guān)于羊棲菜多糖的益生活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究。