高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚

任興權(quán),趙俊,劉盼,霍文清

(酒泉市食品檢驗(yàn)檢測中心,甘肅 酒泉,735000)

洋蔥(AlliumcepaL.)是百合科、蔥屬多年生草本植物,原產(chǎn)中亞和地中海沿岸,現(xiàn)在世界各地都有種植[1]。中國洋蔥總產(chǎn)量位居世界前列,洋蔥的產(chǎn)量在我國各類蔬菜產(chǎn)量排名中位居第六,占據(jù)重要地位[2]。洋蔥是傳統(tǒng)的藥食兩用植物,營養(yǎng)成分豐富,含有槲皮素、黃酮[3]、有機(jī)硫化物[4]等多種對人體有益的活性功能性物質(zhì),驅(qū)散人體內(nèi)寒氣、預(yù)防季節(jié)性感冒、促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)而有利于消化,并且具有利尿等功效[5],同時(shí)洋蔥有抗氧化[6-11]、抗腫瘤[12]、降血糖血脂[13-14]、免疫力調(diào)節(jié)[15]、抑菌[16-17]等生理作用,是一種美味又健康的蔬菜。

硫化丙烯是洋蔥、蒜等植物的鱗莖中含有的揮發(fā)物,對病原菌和寄生蟲都有良好的殺滅作用,可預(yù)防感冒,減輕發(fā)燒、咳嗽、喉痛及鼻塞等感冒癥狀。除對人體有益外,硫化丙烯還能有效地抑制空氣中的多種病原菌傳播、浸染或殺死病原菌,使蔬菜植株的發(fā)病率明顯下降[18]。烯丙基硫醚存在于蔥類、大蒜等蔬菜及十字科植物果實(shí)中,是大蒜提取液中的主要成分,具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗癌活性,并能抑制血小板凝聚、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[19-21],廣泛應(yīng)用在醫(yī)療衛(wèi)生藥物研發(fā)上[22]。

專門針對洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的研究極少,主要是洋蔥中揮中發(fā)性物質(zhì)的研究,提取方法主要有離子液體超聲-微波協(xié)同法[23]、超臨界CO2萃取[24]、亞臨界水提取法[25]、超聲波輔助提取[26],檢測方法主要有氣相色譜法[27]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[28-33]。很少有采用液相色譜法對硫化丙烯和烯丙基硫醚進(jìn)行分析檢測的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,而目前尚未有關(guān)于采用液相色譜法對洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚分析檢測的相關(guān)報(bào)道。為了研究出更加科學(xué)、簡便、低成本的分析方法,實(shí)驗(yàn)采用了有機(jī)溶劑超聲提取和高效液相色譜-二極管陣列檢測器法分析檢測。

本研究在歸納現(xiàn)有國內(nèi)外文獻(xiàn)資料后,研究出了采用加入穩(wěn)定劑丁硫醇后用乙腈提取,用無水硫酸鈉吸收多余的水分后離心的更加科學(xué)的提取方法,采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法進(jìn)行分析檢測,該方法操作簡便、靈敏度高、穩(wěn)定性好,為測定洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚含量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋蔥,市購。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色譜純),默克集團(tuán)股份有限公司;甲酸(色譜純)、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉(分析純)、乙醇(色譜純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;丁硫醇(C4H10S,CAS號:109-79-5,純度:99%),西亞試劑;烯丙基硫醚(C6H10S,CAS號:592-88-1,純度≥98.0%),CNW Technologies;硫化丙烯(C3H6S,CAS號:1072-43-1,純度>98.0%),東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260型液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;艾柯DISCV-IV-24M型超純水機(jī),成都唐氏康寧科技有限公司;SB25-12DTD型超聲波清洗器,寧波新芝生物科技有限公司;泰斯特DK-98-IIA恒溫水浴鍋,天津泰斯特儀器有限公司;TG16C型離心機(jī),長沙英泰儀器有限公司;Vortex-Genie2型渦旋混合器,美國Scientific Industries公司;MS105型十萬分之一電子天平、ME203/02型千分之一天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試樣前處理

用制樣機(jī)將樣品充分打碎混勻,裝在自封袋中,冷凍存放。稱取樣品2 g(精確至0.001 g)于50 mL具塞離心管中,之后準(zhǔn)確加入10 mg/mL穩(wěn)定劑丁硫醇1.0 mL,并準(zhǔn)確加入乙腈9.0 mL,渦旋1 min之后,放入超聲波儀器中,于室溫超聲提取20 min,超聲完畢向離心管中加入2.0 g無水硫酸鈉,振搖1 min,后渦旋1 min,將離心管置于離心機(jī)中,12 000 r/min離心3 min,取上清液過濾膜(0.22 μm,聚四氟乙烯),上機(jī)測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg硫化丙烯和烯丙基硫醚于50 mL燒杯中用少量乙腈溶解后立即轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,加入10 mg/mL穩(wěn)定劑丁硫醇1.0 mL之后用乙腈定容至刻度,配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液;取適量標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液于容量瓶中用乙腈逐級稀釋成1、5、10、20、50、100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合系列溶液。

1.3.3 高效液相色譜儀條件

色譜柱:Thermo Hypersil GOLD液相色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:水(60%)+乙腈(40%);流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,波長200 nm。

1.3.4 定性、定量方法

通過硫化丙烯和烯丙基硫醚保留時(shí)間定性分析,以外標(biāo)法對硫化丙烯和烯丙基硫醚進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的嘗試提取方法有水提法、乙醇法、甲醇法、乙酸乙酯法、乙腈法等,雖然均能不同程度地提取,從表1可以看出乙腈有最佳提取效果,但是提取效果不能達(dá)到最佳理想狀態(tài),并且回收率不穩(wěn)定?？紤]到洋蔥中含有大量的水影響了提取效果。因而本研究先加乙腈提取,用加入的無水硫酸鈉或無水硫酸鎂除去提取中多余的水,最后在高速離心機(jī)上離心,發(fā)現(xiàn)加入無水硫酸鈉離心后的樣液清澈并沉淀緊密,而無水硫酸鎂離心后的樣液渾濁且沉淀松散,從表2可以看出,加入無水硫酸鈉后加標(biāo)回收率較高,說明無水硫酸鈉有更強(qiáng)的吸水能力,提取的效果更佳。

表1 不同試劑提取的差異性 單位:mg/kg

表2 不同脫水劑對提取效果的影響 單位:%

表3 硫化丙烯和烯丙基硫醚的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R)、及其方法檢出限

2.2 穩(wěn)定劑的選擇

硫化丙烯不穩(wěn)定容易被氧化而分解,一般的硫化丙烯貯存過程中均加入一定濃度的穩(wěn)定劑,丁硫醇是硫化丙烯中常見加入的穩(wěn)定劑,試驗(yàn)表明在分析檢測中不加入穩(wěn)定劑丁硫醇,硫化丙烯的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖就會出現(xiàn)雙頭峰,說明硫化丙烯易分解成2種性質(zhì)相近的物質(zhì),致使無法準(zhǔn)確分析。通過分別向同一濃度的硫化丙烯標(biāo)準(zhǔn)溶液和同一洋蔥樣品中加入0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、12、15 mg/mL質(zhì)量濃度的丁硫醇通過液相色譜分析,加入10.0 mg/mL及以上質(zhì)量濃度的丁硫醇,硫化丙烯的峰型最佳且穩(wěn)定,所以試驗(yàn)方法均以加入10.0 mg/mL質(zhì)量濃度的丁硫醇為基礎(chǔ)。同時(shí),試驗(yàn)表明加入穩(wěn)定劑丁硫醇對烯丙基硫醚的分析檢測無任何影響。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 檢測波長的選擇

通過在190～810 nm內(nèi)對硫化丙烯和烯丙基硫醚進(jìn)行全波長掃描,表明硫化丙烯和烯丙基硫醚在200 nm處均有最強(qiáng)的紫外吸收,且基線噪音低,故確定200 nm作為該方法的檢測波長,標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1,硫化丙烯保留時(shí)間為4.332 min,烯丙基硫醚的保留時(shí)間為11.823 min。

圖1 硫化丙烯和烯丙基硫醚的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3.2 色譜柱的選擇

液相色譜法常用的為色譜C18柱,但是由于硫化丙烯和烯丙基硫醚具有疏水性和特殊的結(jié)構(gòu),一般的C18柱會有拖尾峰形而影響準(zhǔn)確定量,所以本方法采用了Thermo Hypersil GOLD液相色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),該色譜柱集先進(jìn)的高純硅膠技術(shù)、鍵合技術(shù)和烷基鍵合相的封端技術(shù)于一身。普通色譜柱由于分析物與硅基表面酸性的硅醇基會存在二次或三次吸附作用,從而導(dǎo)致峰形變差,Hypersil GOLD因在生產(chǎn)過程中對填料表面進(jìn)行了處理,減少這些不理想的相互作用,明顯改善了色譜峰拖尾。結(jié)果表明Thermo Hypersil GOLD液相色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)分離、檢測硫化丙烯和烯丙基硫醚效果良好,基線穩(wěn)定漂移小。

2.3.3 流動(dòng)相的選擇

選取水+甲醇體系、水+乙腈嘗試檢測硫化丙烯和烯丙基硫醚,通過比較發(fā)現(xiàn)乙腈在低波長更適用,具有比甲醇更小的基線噪音,因此,選用水+乙腈的體系來檢測硫化丙烯和烯丙基硫醚。

2.3.4 流動(dòng)相洗脫程序的選擇

硫化丙烯和烯丙基硫醚通過色譜柱分離出的間隔時(shí)間較長,流動(dòng)相采用梯度洗脫時(shí)對分析并沒有取得更好的效果,反而是基線漂移較大不利于準(zhǔn)確定量,尤其是對烯丙基硫醚檢測的誤差較大。而采用等度洗脫時(shí),流動(dòng)相體系的壓力穩(wěn)定,能夠準(zhǔn)確地檢測硫化丙烯和烯丙基硫醚,硫化丙烯和烯丙基硫醚出峰時(shí)間合適并且沒有雜質(zhì)干擾(圖2)。

圖2 洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線以質(zhì)量濃度(X,μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,硫化丙烯和烯丙基硫醚的線性方程及其相關(guān)系數(shù)見表2,在質(zhì)量濃度1～100 μg/mL時(shí),標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R)為0.999 97～0.999 98,硫化丙烯和烯丙基硫醚的線性關(guān)系良好,完全可以滿足定量分析的要求。

2.5 檢出限和定量限

在洋蔥空白基質(zhì)中加入低濃度的硫化丙烯和烯丙基硫醚,通過試驗(yàn)研究得出硫化丙烯和烯丙基硫醚的方法檢出限為0.5 mg/kg,定量限為1.5 mg/kg,可見本方法有很高的靈敏度。

2.6 回收率、精密度

在未檢出硫化丙烯和烯丙基硫醚的洋蔥空白基質(zhì)中添加5.0、10.0、15.0 μg/mL 3個(gè)濃度水平的硫化丙烯和烯丙基硫醚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照以上試驗(yàn)方法提取,并且每個(gè)加標(biāo)水平的樣品平行測定6次,本實(shí)驗(yàn)中硫化丙烯和烯丙基硫醚的加標(biāo)回收率為96%～103%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.28%～0.49%(表4),試驗(yàn)表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度很高,能夠準(zhǔn)確地分析檢測洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚。

表4 硫化丙烯和烯丙基硫醚的回收率和精密度

2.7 洋蔥樣品分析

用本方法對不同顏色品種的洋蔥檢測分析,從檢測結(jié)果可看出,不同洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚含量差別較大(圖3和圖4),黃皮洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚含量均最高,紅皮洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚含量均略比黃皮洋蔥中的含量低但也屬于較高,硫化丙烯在白皮洋蔥中的含量總體比在紫皮洋蔥中的含量高,烯丙基硫醚在紫皮洋蔥中含量總體比在白皮洋蔥中高。黃皮洋蔥中的硫化丙烯含量可達(dá)4.47 mg/kg,白皮洋蔥中的硫化丙烯含量最低為2.79 mg/kg,黃皮洋蔥中的烯丙基硫醚含量可達(dá)6.71 mg/kg,白皮洋蔥中的硫化丙烯含量最低為3.33 mg/kg。黃皮洋蔥和紅皮洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚含量相較于紫皮洋蔥和白皮洋蔥中的含量高,這也就是黃皮洋蔥和紅皮洋蔥比紫皮洋蔥和白皮洋蔥在口味和氣味上更為辛辣的原因,同時(shí)說明黃皮洋蔥和紅皮洋蔥比紫皮洋蔥和白皮洋蔥的抗菌效果更好。

圖3 不同顏色品種洋蔥中的硫化丙烯含量

圖4 不同顏色品種洋蔥中的烯丙基硫醚含量

2.8 對不同主產(chǎn)區(qū)洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的分析研究

我國的南北均盛產(chǎn)洋蔥,但是因?yàn)椴煌赜虻牡乩憝h(huán)境不同而差別比較大,通過對相近皮色品種的洋蔥分析檢測也確實(shí)證明了不同地域的洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚含量有很大差異,其中新疆石河子、甘肅酒泉、吉林延吉、內(nèi)蒙通遼、黑龍江齊齊哈爾產(chǎn)的洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚含量較高,兩物質(zhì)含量之和均在9.0 mg/kg以上,河南新鄉(xiāng)、山東濰坊、四川西昌、云南元謀產(chǎn)的洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚含量比較接近并且比北方產(chǎn)的低,不同地域的洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的含量見圖5。北方產(chǎn)的洋蔥中的硫化丙烯和烯丙基硫醚含量普遍較高,應(yīng)該與北方普遍氣候干燥、晝夜溫差大有一定的關(guān)聯(lián)。

圖5 不同區(qū)域洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的含量

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚的方法。利用穩(wěn)定劑丁硫醇防止了硫化丙烯的分解,用乙腈超聲提取,除水和離心后,以高效液相色譜-二極管陣列檢測器法進(jìn)行定性定量的分析,有效填補(bǔ)了現(xiàn)有國內(nèi)外采用液相色譜法分析檢測硫化丙烯和烯丙基硫醚的技術(shù)空白。該方法操作簡便,科學(xué)性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、精密性好,非常適合洋蔥中硫化丙烯和烯丙基硫醚含量的分析,為洋蔥的的成分研究分析提供了有效科學(xué)技術(shù)依據(jù)。