高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌的篩選、誘變及發(fā)酵條件優(yōu)化

朱青永,張?chǎng)?鄧紫菱,扎西多杰,余佳莉,陳啟和,劉政捷*

1(浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 舟山,316000)

2(浙江大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系,浙江 杭州,310058)

蛋氨酸,又稱甲硫氨酸,有D型和L型2種存在形式,均具有生物活性[1]。蛋氨酸被MUELLER首次從酪蛋白中分離出來(lái),被認(rèn)為是α-氨基-N-丁酸的γ-甲硫基衍生物,是人和動(dòng)物體中唯一的含硫必需氨基酸,在機(jī)體中具有非常重要的生理功能[2]。目前,蛋氨酸已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)中,如飼料、預(yù)防肝損傷藥物、運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑和嬰幼兒制劑等眾多食品藥品中[3]?，F(xiàn)行的蛋氨酸合成方法主要為化學(xué)合成法,但是化學(xué)合成法的產(chǎn)物為D型和L型外消旋混合物,分離十分困難,不能滿足一些高精尖行業(yè)的需求,而且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[4-5]。所以迫使人們使用微生物發(fā)酵法替代化學(xué)合成法[6],但由于蛋氨酸生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制較為復(fù)雜,給蛋氨酸產(chǎn)生菌的選育帶來(lái)了很大困難。蛋氨酸生物合成常用菌有大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌,HUANG等[7]通過(guò)優(yōu)化絲氨酸合成途徑和使用優(yōu)化過(guò)的大腸桿菌W3110,經(jīng)過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵,在48 h內(nèi)蛋氨酸產(chǎn)量可達(dá)到16.86 g/L,使用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)蛋氨酸產(chǎn)量最高約為9.88 g/L[8],該產(chǎn)量對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用還有一定差距,因此對(duì)于蛋氨酸高產(chǎn)菌株的選育仍然有待深入研究。

內(nèi)生菌一般包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌,研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌廣泛存在,自VOGL從黑麥草種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生真菌以來(lái),植物內(nèi)生菌就作為一種新的微生物資源受到了廣泛關(guān)注[9]。因?yàn)閮?nèi)生菌和宿主之間可能存在水平基因轉(zhuǎn)移的作用,使得內(nèi)生菌具有合成其宿主產(chǎn)生的活性化學(xué)成分類似物的潛力,是重要次生代謝物的儲(chǔ)存庫(kù)[10]。據(jù)報(bào)道,鹽膚木為眾多亞熱帶常見(jiàn)森林植物種子中蛋氨酸含量較高的一種植物,酸水解法處理測(cè)得的蛋氨酸含量高達(dá)36.89 mg/g,是開(kāi)發(fā)新型高產(chǎn)蛋氨酸蛋白基因資源的優(yōu)良選擇[11]。因此,本研究嘗試從鹽膚木種子中挖掘具有產(chǎn)蛋氨酸能力的內(nèi)生菌,將其應(yīng)用于蛋氨酸的生物合成領(lǐng)域。

首先從蛋氨酸含量較高的鹽膚木種子中分離出內(nèi)生菌,再利用不同的培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)蛋氨酸的菌株。然后以篩選出的菌株為出發(fā)菌株,對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物和60Co-γ射線誘變育種,再采用傳統(tǒng)方式優(yōu)化培養(yǎng)基,為實(shí)現(xiàn)蛋氨酸的工業(yè)生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù),有益于下一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽膚木當(dāng)年新鮮種子,購(gòu)于淘寶;蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、法尼醇、亮氨酸,上海源葉生物科技有限公司;LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇、二甲基亞砜、結(jié)晶紫,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇、乙腈、三乙胺,武漢弗頓控股有限公司;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司;DL2000 Plus DNA Marker,南京諾唯贊生物科技股份有限公司。所有分離用有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-100B臺(tái)式恒溫振蕩器,上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;Agilent1100高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司;SJB-CJ-1FX生物超凈工作臺(tái),蘇州佳寶凈化設(shè)備有限公司;Thermo酶標(biāo)儀,美國(guó)賽摩飛世爾科技公司;智能生化培養(yǎng)箱SPX-1000,寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Olympus光學(xué)顯微鏡,奧林巴斯有限公司;

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌的篩選

取新鮮的鹽膚木種子,在75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中浸泡l min,無(wú)菌水漂洗3次后用5%(體積分?jǐn)?shù))NaClO消毒2 min,再用無(wú)菌水沖洗3～4次,無(wú)菌濾紙吸干[12]。在無(wú)菌工作臺(tái)中用研缽研磨種子,將研磨獲得的液體,按照1、10、100、1 000倍稀釋,取100 μL,分別在LB、YPD、PDA固態(tài)培養(yǎng)基上涂板。LB平板置于37 ℃培養(yǎng),YPD和PDA平板置于28 ℃培養(yǎng)。將從培養(yǎng)基上獲取獲得的內(nèi)生菌菌株,挑取單克隆,分別接種于5 mL的LB、YPD和PDB液體培養(yǎng)基,120 r/min,培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后,取種子液1 mL,分別接種于對(duì)應(yīng)的100 mL液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)72 h,之后通過(guò)蛋氨酸含量測(cè)定,篩選出高產(chǎn)蛋氨酸的菌株。

1.3.2 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌菌種鑒定

將篩選出的高產(chǎn)蛋氨酸菌株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。從種子內(nèi)部取內(nèi)生菌,在培養(yǎng)72 h左右時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色,確定該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌?；驕y(cè)序:使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取。用于16S rRNA的PCR反應(yīng)的引物為一對(duì)通引物,一般細(xì)菌鑒定選擇通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為:5×SF Buffer 4 μL,dNTPs(0.02 mol/L)1 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL,DNA模板2 μL,Phanta酶(1 U/50 μL)0.4 μL,ddH2O 11.8 μL。PCR擴(kuò)增程序如下:94 ℃ 5 min→(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 1 min)×30個(gè)循環(huán)→72 ℃ 10 min→4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由上海生工生物技術(shù)公司完成,將菌株LB-2序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cg)上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,在GenBank中下載相近典型菌株的16S rRNA基因序列,利用MEGA X軟件,采用鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行1 000次自展分析(bootstrap analysis),構(gòu)建基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13]。

1.3.3 生物量的測(cè)定

量取40 mL的發(fā)酵液,離心,向沉淀中加入少量的蒸餾水使得菌體懸浮,倒入已記錄過(guò)質(zhì)量的玻璃培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放在烘箱中烘干,直到前后2次稱量質(zhì)量不再發(fā)生變化,記錄質(zhì)量。比較前后2次的質(zhì)量差,即為40 mL發(fā)酵液中生物體的質(zhì)量。

1.3.4 蛋氨酸含量的檢測(cè)

用高效液相色譜法測(cè)定蛋氨酸含量。Agilent 1200色譜儀,色譜柱C18,流動(dòng)相A相(1 L):無(wú)水乙酸鈉5 g,四氫呋喃5 mL,三乙胺200 μL,pH為7.2。流動(dòng)相B相(1 L):無(wú)水乙酸鈉5 g,超純水200 mL,甲醇400 mL,乙腈400 mL,pH為7.2。紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm,柱溫40 ℃,流速1.0 mL/min。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,使用前稀釋成濃度為1、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/mL等8個(gè)梯度,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。得到回歸方程y=1.594 1x+0.289 9,R2=0.999 6。將發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾,加入液相小瓶,樣品準(zhǔn)備完畢。樣品采用自動(dòng)衍生化程序,衍生試劑包括:1 μL樣品+5 μL硼酸+1 μL OPA+32 μL水。梯度洗脫程序見(jiàn)表1,洗脫時(shí)間為38 min。

表1 梯度洗脫程序

1.3.5 亮氨酸抑制濃度確定

據(jù)報(bào)道,閔偉紅等[14]和林小秋等[15]以亮氨酸作為蛋氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,進(jìn)行蛋氨酸抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的篩選,使蛋氨酸產(chǎn)量得到明顯提高。本研究以高產(chǎn)蛋氨酸菌株LB-2為出發(fā)菌株,用亮氨酸篩選抗蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株。配制亮氨酸質(zhì)量濃度分別為0、2、4、6、8 g/L的LB培養(yǎng)基平板,從LB培養(yǎng)基斜面上挑取菌落到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。稀釋104倍,取200 μL涂板,37 ℃培養(yǎng)48 h。比較LB-2菌株在不同濃度下的亮氨酸的生長(zhǎng)狀況,由此確定篩選培養(yǎng)基中應(yīng)該添加的亮氨酸的質(zhì)量濃度。

1.3.660Co-γ射線誘變及誘變菌株的篩選

取5 mL對(duì)數(shù)期的LB-2菌液離心,棄上清液,生理鹽水洗滌3次,最后懸浮于生理鹽水中,使得OD600為0.5左右。采用200雷姆劑量的60Co-γ射線對(duì)其進(jìn)行照射誘變,將經(jīng)過(guò)輻照后的菌液分別用生理鹽水稀釋105、106、107倍,并涂布在含有一定質(zhì)量濃度亮氨酸的篩選培養(yǎng)基平板中,挑選菌落直徑比較大的單克隆菌體,采用點(diǎn)菌的方式分別點(diǎn)植在LB固體培養(yǎng)基和含有亮氨酸的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵,37 ℃、220 r/min,培養(yǎng)48 h。選擇對(duì)亮氨酸抑制作用不敏感的突變菌株,測(cè)定發(fā)酵液中蛋氨酸的含量,挑選出蛋氨酸產(chǎn)量最高的菌株。

1.3.7 單因素試驗(yàn)

固定單因素試驗(yàn)條件為葡萄糖15 g/L、硫酸鈉1.5 g/L、法尼醇75 μmol/L,研究向培養(yǎng)基中加入不同含量的葡萄糖(5、10、15、20、25 g/L)、硫酸鈉(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)和法尼醇(25、50、75、100、125 μmol/L)對(duì)LB-2-13菌株蛋氨酸產(chǎn)量的影響。

1.3.8 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定選取葡萄糖、硫酸鈉、法尼醇3個(gè)因素進(jìn)行編碼,得出各因素的交互作用,并求出各因素的最佳水平,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析,Origin 2021軟件作圖,利用軟件Design-Expert 10進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽膚木種子中高產(chǎn)蛋氨酸內(nèi)生菌的篩選和鑒定

植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物非常豐富,是許多生物活性代謝物的重要來(lái)源,這些代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出了抗菌、抗糖尿病、殺蟲(chóng)和抗關(guān)節(jié)炎等活性[16]。在以往研究中,蛋氨酸生產(chǎn)常用菌株有大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和百合棒桿菌等[17]。本研究從先前的研究報(bào)道中得到啟發(fā)[18],首次使用鹽膚木內(nèi)生菌作為蛋氨酸的生產(chǎn)菌株。從圖1可以看出鹽膚木種子中培養(yǎng)篩選出的11種菌株在LB、PDA、YPD 3種平板中單克隆呈現(xiàn)出不同顏色和形態(tài),LB平板上呈現(xiàn)黃綠色,PDA平板上呈現(xiàn)白色或者褐色,YPD平板上呈現(xiàn)淺褐色或棕褐色。對(duì)篩選出的11種菌株進(jìn)行命名,根據(jù)所使用培養(yǎng)基的不同,分別命名為L(zhǎng)B-1、LB-2、LB-3、LB-4、LB-5、YPD-1、YPD-2、YPD-3、PDA-1、PDA-2、PDA-3。從圖2可以看出這11株內(nèi)生菌均可產(chǎn)生蛋氨酸,LB平板上的菌株生產(chǎn)蛋氨酸的能力更高,LB-2產(chǎn)蛋氨酸的能力最強(qiáng),可達(dá)0.92 g/L。

圖1 分離的菌株在不同平板上的形態(tài)特征

圖2 鹽膚木種子內(nèi)生菌株發(fā)酵液蛋氨酸含量

用瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖3-a所示,菌株ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物在約1 600 bp的位置有明顯的條帶,且無(wú)其他雜質(zhì)存在。

a-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果;b-基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將所得16S rRNA 基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì),與菌株LB-2相似度最高的菌株為Micrococcusluteusstrain NCTC 2665(NR 075062.2,相似度為99%)、Micrococcusaloeveraestrain AE-6(NR 134088.1,相似度為99%)。圖3-b為L(zhǎng)B-2菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),由圖可知,LB-2與Micrococcusyunnanensis(MT033093.1)的同源性最高,達(dá)到了100%。結(jié)合形態(tài)特征和16S rRNA 基因序列同源性,確定LB-2菌株為微球菌屬。

2.2 亮氨酸抑制濃度的確定

篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株是使相關(guān)酶的調(diào)節(jié)基因或變構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變,使結(jié)構(gòu)類似物不能再與阻遏物或變構(gòu)酶結(jié)合,即結(jié)構(gòu)類似物不再抑制突變株的生長(zhǎng),從而解除反饋調(diào)節(jié)[19]。從圖4可以看出,菌株在加入了6 g/L亮氨酸的平板中的菌落大小為空白對(duì)照平板中的一半,且數(shù)量上也要少很多,說(shuō)明含有6 g/L亮氨酸的LB培養(yǎng)基對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,可以選用為篩選培養(yǎng)基。

圖4 不同質(zhì)量濃度的亮氨酸對(duì)菌落生長(zhǎng)的影響

2.3 60Co-γ射線誘變菌株的篩選

60Co-γ射線是一種高能電磁波,它產(chǎn)生的電離輻射可以直接或間接改變DNA的結(jié)構(gòu)[20]。有研究表明,通過(guò)對(duì)阿庫(kù)曲霉G1-3進(jìn)行60Co-γ射線照射,葡萄糖苷酶的產(chǎn)量從1.94 U/mL增加到7.02 U/mL[21]。據(jù)報(bào)道,黑曲霉DSM 26641中的β-1,4-endoxylanase酶活性因60Co-γ輻射而大大提升[22]。實(shí)驗(yàn)標(biāo)號(hào)0和33為原始菌株,如圖5所示,13和25號(hào)菌株無(wú)論是蛋氨酸產(chǎn)量還是生物量都明顯高于其他菌株,尤其是13號(hào)菌株,蛋氨酸產(chǎn)量達(dá)到了1.52 g/L。經(jīng)過(guò)60Co-γ射線誘變和6 g/L亮氨酸篩選之后,一些突變菌株產(chǎn)蛋氨酸的能力得到明顯提升。

a-誘變菌株不同菌株的蛋氨酸產(chǎn)量;b-誘變菌株不同菌株的生物量

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 葡萄糖添加量對(duì)LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

葡萄糖在蛋氨酸生物合成過(guò)程中具有非常重要的作用,不僅為微生物的生長(zhǎng)提供能量,還作為原料直接參與蛋氨酸的合成。葡萄糖通過(guò)糖酵解等途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,進(jìn)入TCA循環(huán),生成草酰乙酸鹽,通過(guò)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶將代謝通量導(dǎo)向天冬氨酸。利用一系列酶,連續(xù)還原天冬氨酸末端羧基合成高絲氨酸,最終得到蛋氨酸[23]。如圖6-a所示,當(dāng)葡萄糖添加量超過(guò)10 g/L時(shí),發(fā)酵液中的生物量開(kāi)始明顯降低,可能是因?yàn)殡S著葡萄糖質(zhì)量濃度的提升,發(fā)酵液中的滲透壓也隨之提升,滲透壓過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微生物失水而發(fā)生質(zhì)壁分離,從而導(dǎo)致生物量降低。隨著葡萄糖添加量的增加,發(fā)酵液中蛋氨酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)添加量為15 g/L時(shí)蛋氨酸含量達(dá)到最高。最終確定最適葡萄糖添加量為15 g/L。

a-葡萄糖添加量對(duì)蛋氨酸參量的影響;b-硫酸鈉添加量對(duì)蛋氨酸參量的影響;c-法尼醇添加量對(duì)蛋氨酸參量的影響

2.4.2 硫酸鈉添加量對(duì)LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

2.4.3 法尼醇添加量對(duì)LB-2-13蛋氨酸產(chǎn)量的影響

法尼醇是由真菌物種白色念珠菌分泌的一種群體感應(yīng)分子,主要在白色念珠菌生物膜生長(zhǎng)期間起到生理作用,它還可以對(duì)其他細(xì)菌的生理活動(dòng)起到一定的調(diào)控作用,例如調(diào)節(jié)細(xì)胞生理特征、形態(tài)、抗菌性等[27]。LOPES等[28]研究發(fā)現(xiàn)法尼醇同樣能夠影響耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等細(xì)菌生物膜的形成,與生物膜中重要蛋白質(zhì)具有顯著的結(jié)合親和力。本研究利用法尼醇對(duì)細(xì)菌生物膜的影響,找到促進(jìn)微球菌中蛋氨酸高產(chǎn)的一種創(chuàng)新方式。從圖6-c可以看出,加入100 μmol/L法尼醇時(shí)蛋氨酸含量最高,因此確定最適法尼醇添加量為100 μmol/L。適量的法尼醇顯著提高了微球菌中蛋氨酸的產(chǎn)量,具體原因可以從以下幾個(gè)方面考慮:首先,有研究顯示,適量的法尼醇可以增加金黃色葡萄球菌中的溶氧量[29],微球菌是需氧菌,法尼醇通過(guò)增加微球菌中的溶氧量,產(chǎn)生足夠的能量用于蛋氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的合成以及蛋氨酸的運(yùn)輸。其次,法尼醇可以通過(guò)影響微球菌生物膜的形成,改變生物膜的蛋白成分,從而影響蛋氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。另外,最直接的影響就是法尼醇對(duì)微球菌中蛋氨酸合成途徑的調(diào)控,法尼醇在培養(yǎng)基中隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行被微球菌慢慢積累,從而改變合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá),以實(shí)現(xiàn)蛋氨酸的高產(chǎn)。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步提高LB-2-13菌株的蛋氨酸產(chǎn)量,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)法對(duì)篩選出的3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

各因素經(jīng)過(guò)回歸擬合,得到回歸方程:Y=2.80-0.066A+0.013B-0.13C-7.50AB+5.00AC+0.25BC-0.55A2-0.37B2-0.48C2。從表4可以看出,響應(yīng)值模型P值小于0.05,該二次項(xiàng)方程模型顯著;同時(shí)該模型失擬項(xiàng)P值大于0.05,說(shuō)明模型失擬項(xiàng)不顯著,可以較好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。響應(yīng)值可信度分析的模型相關(guān)系數(shù)R2為0.96,表示該模型相關(guān)度很好;變異系數(shù)為6.66%,表示該模型置信度較高,可以反映試驗(yàn)的真實(shí)性。綜上所述,該回歸模型對(duì)響應(yīng)值的擬合程度較高,方程能夠較好地反映響應(yīng)值與自變量的關(guān)系。

表4 回歸方程的方差分析

為了更直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面圖分析。當(dāng)多種因素交互作用時(shí),三維曲面圖可直觀反映響應(yīng)值的變化趨勢(shì)。從圖7可知,隨著葡萄糖、硫酸鈉和法尼醇添加量的增加,蛋氨酸含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),通過(guò)比較3因素的P值可知,各因素對(duì)蛋氨酸產(chǎn)量的影響大小為:C>A>B,即法尼醇添加量>葡萄糖添加量>硫酸鈉添加量。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖14.70 g/L,硫酸鈉0.98 g/L,法尼醇96.35 μmol/L,預(yù)測(cè)得到的最高蛋氨酸含量為2.81 g/L。在此條件下進(jìn)行最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)定發(fā)酵液中蛋氨酸含量,平行測(cè)定3次試驗(yàn)結(jié)果為2.85 g/L,與預(yù)測(cè)值接近,證明此模型可以用于LB-2-13菌株生產(chǎn)蛋氨酸培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。

a-葡萄糖-硫酸鈉交互作用;b-葡萄糖-法尼醇交互作用;c-硫酸鈉-法尼醇交互作用

3 結(jié)論

本文從鹽膚木種子中分離內(nèi)生菌進(jìn)行蛋氨酸發(fā)酵培養(yǎng),篩選出高產(chǎn)菌株LB-2。之后選擇LB-2菌株為出發(fā)菌株,采用60Co-γ射線、蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行誘變篩選,最終得到高產(chǎn)菌株LB-2-13。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,同等發(fā)酵條件下,突變菌株比野生菌株的蛋氨酸產(chǎn)量增加了162.72%。培養(yǎng)基的優(yōu)化,是微生物發(fā)酵中最常見(jiàn)的優(yōu)化方式,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用響應(yīng)面優(yōu)化LB-2-13菌蛋氨酸合成的培養(yǎng)條件,得出在葡萄糖14.70 g/L,硫酸鈉0.98 g/L,法尼醇96.35 μmol/L的條件下,蛋氨酸的產(chǎn)值最高,產(chǎn)值可以達(dá)到2.85 g/L,比未優(yōu)化前增長(zhǎng)了約88%。為早日實(shí)現(xiàn)蛋氨酸生物合成工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

但在不同的微生物中,蛋氨酸的合成途徑存在一定差異,如高絲氨酸在大腸桿菌中被高絲氨酸-O-琥珀?；D(zhuǎn)移酶(homoserine succinyltransderase,metA)和高絲氨酸激酶(homoserine kinase,HK)催化形成O-琥珀酰-L-高絲氨酸和O-磷酸-L-高絲氨酸,而在谷氨酸棒桿菌中則被高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(homoserine acetyltransferase,HAT)催化形成O-乙酰-L-高絲氨酸[30]。蛋氨酸在微球菌中也應(yīng)有獨(dú)特的合成途徑,但目前對(duì)其合成途徑?jīng)]有深入了解,并且蛋氨酸生物合成過(guò)程中還受到硫同化內(nèi)部途徑關(guān)鍵酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、反饋抑制、阻遏蛋白、NADPH和ATP等多種物質(zhì)及機(jī)制的調(diào)控。此外,在發(fā)酵過(guò)程中,還受到營(yíng)養(yǎng)元素和培養(yǎng)條件的影響。在后續(xù)研究中,研究者可以從蛋氨酸在微球菌內(nèi)的合成途徑著手,掌握合成途徑中關(guān)鍵酶和重要前體物質(zhì),使用RT-PCR檢測(cè)合成途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平。通過(guò)基因改造的方式解除關(guān)鍵物質(zhì)的反饋調(diào)節(jié),提高關(guān)鍵酶的酶活,實(shí)現(xiàn)對(duì)各個(gè)前體物質(zhì)的綜合調(diào)控,進(jìn)一步提高微球菌中蛋氨酸的產(chǎn)量。