適配體傳感器檢測黃曲霉毒素的研究進展

郭歌,王田林,李天歌,黃現(xiàn)青,陳云堂,王嘉楠,宋蓮軍*

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州,450002)

2(河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州,450002)

3(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,北京,100193)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-2],常見的有黃曲霉毒素B1、B2、M1、G1、G2。其中黃曲霉毒素B1(aflatoxins,AFB1)和黃曲霉毒素M1(aflatoxins,AFM1)是迄今發(fā)現(xiàn)毒性最強的霉菌毒素之二,具有強致癌性、致突變性和致畸性,占動物和食品飼料中所有黃曲霉毒素污染的75%[3-4],早已被國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Researchon Cancer,IARC)列為人類致癌物(第I類)[5]。因此,大多數(shù)國家都對黃曲霉毒素有限量要求。例如,我國在GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定糧食及糧食制品的AFB1含量不超過5 μg/kg,奶制品AFM1含量不超過0.5 μg/kg[6-8],歐盟委員會將食品和牛奶中AFB1和AFM1的最大殘留量定為0.5～50 ng/mL[9-10]。所以,對食品中黃曲霉毒素的及時檢測對保障人體健康具有重要意義。常見的檢測方法以大型儀器檢測為主,包括薄層色譜法、質(zhì)譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13]等,這些檢測方法具有特異性強,靈敏度高的特點,但儀器價格高昂且需要專業(yè)技術(shù)人才操作、待檢樣品需要復(fù)雜的前處理等弊端,大大限制了其在樣品現(xiàn)場快速分析中的應(yīng)用[14]。此外,基于抗體為識別分子的免疫方法如酶聯(lián)免疫吸附測定法[15]、免疫層析法[16]等,由于抗體價格高和穩(wěn)定性差等不足,也限制了其進一步的應(yīng)用。因此,迫切需要開發(fā)簡便、快速、特異性好、精準(zhǔn)度高的檢測方法用于黃曲霉毒素的檢測。

適配體(aptamer,Apt)是一種單鏈寡核苷酸序列,通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)在體外篩選[17],具有成本較低、穩(wěn)定性高、特異性強等優(yōu)勢。適配體傳感器利用適配體作為識別元件,通過信號轉(zhuǎn)換元件將特異性識別結(jié)合作用轉(zhuǎn)化為電信號、顏色、熒光或拉曼信號。量子點[18]、金納米顆粒[19-20]、石墨烯[21]等具有光/電穩(wěn)定性的納米材料可作為信號轉(zhuǎn)換元件,根據(jù)信號轉(zhuǎn)化方式的不同,將適配體傳感器分為電化學(xué)適配體傳感器、比色適配體傳感器、熒光適配體傳感器和表面增強拉曼散射適配體傳感器,與傳統(tǒng)檢測方法相比,這些傳感器具有簡單、快捷、易于操作等優(yōu)點,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品分析中?；谶m配體傳感器的獨特優(yōu)勢,本文綜述了近年來基于電化學(xué)法、比色法、熒光法、拉曼光譜法等開發(fā)的適配體傳感器在檢測黃曲霉毒素中的研究進展,探討了其在檢測過程中的優(yōu)勢及局限性,并進一步對其在未來發(fā)展中的前景進行展望,為新型適配體傳感器的開發(fā)提供參考。

1 電化學(xué)適配體傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應(yīng)用

電化學(xué)適配體傳感器檢測黃曲霉毒素主要通過黃曲霉毒素與適配體結(jié)合后引起的電化學(xué)信號的變化來實現(xiàn)。電化學(xué)法使用的電極主要以玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)和金電極為主,其中,GCE在與適配體組裝之前一般需要進行活化或修飾處理。CUI等[22]在裸GCE上修飾羧化氧化石墨烯(graphene oxide,GO)和聚(4-乙烯基吡啶)[poly(4-vinyl pyridine),P4VP]組成的復(fù)合膜,建立了新型電化學(xué)適配體傳感器用于準(zhǔn)確、靈敏的檢測AFB1。如圖1-a所示,當(dāng)導(dǎo)電性弱的Apt與羧基化GO連接后,復(fù)合膜表面電流下降,AFB1被Apt捕獲后,由于電子轉(zhuǎn)移進一步受到阻礙,電流信號不斷下降,從而實現(xiàn)了對AFB1的檢測。

a-ON/OFF電化學(xué)適配體傳感器檢測AFB1[22];b-Apt-MIP納米雜交體電化學(xué)適配體傳感器檢測AFB1[23];c-可編程適配體傳感器檢測AFB1[24];d-發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)適配體傳感器檢測AFM1[28]

ROUSHANI等[23]基于Cu2O納米立方體修飾的GCE與適配體-分子印跡聚合物雜交,構(gòu)建了一種新型電化學(xué)雙識別策略檢測AFB1,原理如圖1-b所示。Cu2O納米立方體通過增加表體積比來增加適配體的負載,由于適配體與Cu2O納米立方體形成Cu-N鍵產(chǎn)生空間阻礙降低電子轉(zhuǎn)移,電流信號急劇下降,當(dāng)目標(biāo)物存在時,Apt對AFB1特異性識別和捕獲,電子轉(zhuǎn)移和空穴增加使得電流增加,實現(xiàn)準(zhǔn)確經(jīng)濟高效地檢測AFB1。

此外,為了提高電流信號強度,可將化學(xué)探針如二茂鐵(ferrocene,Fc)[24]、亞甲基藍(methylene blue,MB)[25-26]和酶[27]等標(biāo)記在黃曲霉毒素適配體上來建立電化學(xué)適配體傳感器檢測黃曲霉毒素。例如,最近LI等[24]提出了一種競爭形式(圖1-c),使用亞硫氨酸和還原氧化石墨烯的納米復(fù)合材料來修飾GCE,Fc標(biāo)記的適配體為輸出響應(yīng)信號,而硫堇功能化氧化還原石墨烯(thionine functionalized reduced graphene oxide,THI-rGO)為參考信號。Fc-Apt-AFB1絡(luò)合物的形成導(dǎo)致其從電極上剝離,使Fc的電流強度減弱,而THI的電流強度增強,實現(xiàn)對AFB1特異性檢測。通過選擇2種電活性化合物給出的比率作為分析信號,可以獲得更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。WANG等[25]開發(fā)了一種無試劑電化學(xué)傳感器,使用與AFB1高度親和的26-merDNA適配體,在特定位點連接MB,適配體與AFB1的結(jié)合導(dǎo)致MB電流信號顯著增加,通過方波伏安法分析MB的電流檢測AFB1。該傳感器可以通過簡單的去離子水清洗而再生,可以很好地重復(fù)使用。

有研究還通過循環(huán)信號放大的方法,進一步增加反應(yīng)靈敏度,CUI等[27]使用核酸外切酶I(exonuclease I,Exo I)驅(qū)動的級聯(lián)放大對AFB1進行高靈敏度檢測,c-DNA表面的COO-能使帶正電的MB顯藍色,產(chǎn)生一個電化學(xué)信號,Fc-Apt為探針檢測AFB1為另一個信號,Exo I消化分離的適配體,釋放的AFB1進入下一輪循環(huán),形成靶循環(huán),實現(xiàn)信號放大,該適配體傳感器表現(xiàn)出較寬的檢測范圍(0.000 1～1 pg/mL)和低檢出限。JALALIAN等[28]基于適配體信標(biāo)和構(gòu)象改變的電化學(xué)適配體傳感器(圖1-d)。在沒有AFM1的情況下,Apt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)是完整的,得到了一個弱峰值電流。而AFM1的加入使Apt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生分解,加入MB作為氧化還原劑后,cDNA修飾的納米金(gold nanoparticles,AuNPs)靠近電極表面,產(chǎn)生強烈的電流信號。該適配體傳感器能以pg/mL水平檢測牛奶中的AFM1。此外,RAHMANI等[29]構(gòu)建了基于電紡碳納米纖維的電化學(xué)適配體傳感器,固定AFM1適配體,采用循環(huán)伏安法對AFM1進行檢測,檢出限為0.000 6 ng/mL。KORDASHT等[30]制造了一種用于適配體固定的新型生物相容性支架,首次合成氨基官能化的樹枝狀纖維納米二氧化硅和殼聚糖負載的金納米粒子,并通過計時電流法成功地將其電沉積在GCE表面,最后將MB標(biāo)記的適配體固定化,實現(xiàn)AFM1檢測。KHOLAFAZAD等[31]研制了一種新型的電化學(xué)界面,此界面由殼聚糖改性石墨烯量子點作為導(dǎo)電層、胺基官能化的樹枝狀纖維納米二氧化硅作為高表面元素和特異性核酸適配體構(gòu)成,將獨特的寡核苷酸固定在工程電極的表面,使用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法技術(shù)實現(xiàn)AFM1高靈敏度定量。由此可見,通過在工作電極表面修飾功能材料,不僅提升了工作電極的電子傳導(dǎo)效率,還能提高適配體在界面的負載量,進而提高檢測靈敏度。

電化學(xué)傳感所需的電極及傳感膜可以通過分布清洗降低除分析物以外的干擾,表現(xiàn)出更高的抗干擾性能。但是,電化學(xué)法具有需要對電極進行活化、材料修飾、復(fù)雜檢測平臺組裝、信號輸出不穩(wěn)定及電極昂貴等不足,這對其批量生產(chǎn)和制備提出挑戰(zhàn)。同時,樣品制備仍然存在瓶頸,尤其在霉菌毒素方面,樣品處理周期長、食品基質(zhì)干擾及純化不徹底等問題降低電化學(xué)法的檢測效率和準(zhǔn)確性。

2 比色適配體傳感器在檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用

比色法是將靶標(biāo)與識別元件的響應(yīng)信號轉(zhuǎn)化為顏色信號,比較檢測溶液對光選擇性吸收產(chǎn)生的顏色變化,通過肉眼和簡單的儀器來確定待測組分及其含量的方法?；谶m配體的比色生物傳感器已經(jīng)證明了其在靈敏度、選擇性及便捷性上具有顯著優(yōu)勢[32-34]。

貴金屬納米材料,特別是AuNPs和納米銀(silver nanoparticles,AgNPs),是比色分析常用的信號探針,AuNPs和AgNPs固有的表面等離子體共振特性對比色信號的產(chǎn)生起關(guān)鍵性作用[35]。由于獨特的光學(xué)、導(dǎo)熱性和電子特性,AuNPs和AgNPs常用作納米組裝單元和固定適配體來構(gòu)建比色適配體傳感器。LIU等[36]采用磁性GO結(jié)合SELEX篩選出AFM1高親和力適配體并作為特異性識別探針,適配體通過靜電相互作用吸附到AuNPs表面,使其在鹽溶液中保持分散而不改變其顏色,在AFM1存在下,適配體與其特異性結(jié)合,失去保護的AuNPs在鹽溶液的作用下聚集,顏色由紅色變?yōu)樗{色(圖2-a),利用該傳感器可實現(xiàn)對牛奶樣品中AFM1的檢測,檢出限為0.078 ng/mL,檢測范圍為0.078～10 ng/mL。KASOJU等[37]構(gòu)建了AuNPs-適配體-鹽比色體系,根據(jù)AFB1與適配體特異性結(jié)合后高鹽環(huán)境導(dǎo)致的AuNPs聚集,可在1 min內(nèi)實現(xiàn)對AFB1的特異性、定性和定量檢測。JALALIAN等[38]同樣用該體系,基于鏈霉親和素修飾的二氧化硅納米粒子、AuNPs和適配體互補鏈構(gòu)建適配體傳感器,AFM1不存在時,鹽誘導(dǎo)的AuNPs發(fā)生聚集,樣品顏色變?yōu)樽仙?反之為紅色,可有效應(yīng)用于牛奶中AFM1的檢測。此類基于金屬納米材料的適配體傳感器檢測原理簡單且實驗易操作,但該檢測體系易受到背景顏色干擾,有時也可能發(fā)生分子聚集,從而影響檢測結(jié)果。LERDSRI等[39]基于AgNPs聚集和局域表面等離子體共振效應(yīng),在沒有AFB1情況下,帶正電荷的苝二酰亞胺(positively charged perylene diimide,PCPD)與適配體結(jié)合,產(chǎn)生PCPD-適配體復(fù)合物。由于PCPD不足,AgNPs在溶液中分散良好,保持黃色。相反,在存在AFB1時,適配體特異性的與AFB1結(jié)合,使得靶標(biāo)響應(yīng)結(jié)構(gòu)變化并形成復(fù)雜結(jié)構(gòu),隨后PCPD連接到AgNPs表面,導(dǎo)致AgNPs聚集,通過肉眼可以觀察到AgNPs顏色從黃色到橙色到紅色到深灰色的變化(圖2-b),實現(xiàn)AFB1的可視化檢測,檢出限為0.09 ng/mL。

a-Apt-AuNP比色適配體傳感器檢測AFM1[36];b-Apt-PCPD-AgNPs比色適配體傳感器檢測AFB1[39];c-液晶比色適配體傳感器檢測AFB1[40];d-雙通道比色適配體傳感器檢測AFB1[42]

為提升比色法檢測的靈敏度,WU等[40]構(gòu)建了基于滾環(huán)擴增(roll ring amplification,RCA)的液晶(liquid crystal,LC)比色適配體傳感器,原理如圖2-c所示,使用分散有水性微滴的LC,在磁珠(magnetic beads,MBs)上觸發(fā)適配體識別,AFB1結(jié)合的適配體誘導(dǎo)MBs上修飾的適配體/互補鏈雙鏈體的解離,隨后啟動MBs上的RCA反應(yīng),生成長鏈ssDNA,辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)被包裹在十二烷基硫酸鈉穩(wěn)定的微滴中。由于界面電荷相互作用,HRP從LC噴射到覆蓋的水溶液中,進而催化無色TMB轉(zhuǎn)化為氧化TMB,實現(xiàn)肉眼檢測,相反,由于擴增的ssDNA完全捕獲十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB),當(dāng)CTAB與MBs上的RCA產(chǎn)物預(yù)孵育時,無法觀察到顏色變化,表明存在AFB1,此方法具有較高的選擇性和靈敏度,并成功實現(xiàn)對大米和花生油中AFB1的檢測。除此之外,SEOK等[41]開發(fā)了超靈敏比色傳感器,該傳感器使用適配體和2個分裂DNA酶結(jié)合為探針,在AFB1存在下,適配體與AFB1特異性結(jié)合使得探針結(jié)構(gòu)變形并解離,導(dǎo)致DNA酶分裂為兩半、過氧化物酶催化活性降低,顏色由深綠色變?yōu)闊o色,可經(jīng)肉眼識別,催化過程產(chǎn)生的比色信號會以濃度依賴性方式降低,檢測范圍為0.1～1.0×104ng/mL,比色檢出限為0.1 ng/mL。

由于單信號輸出缺乏自校準(zhǔn)能力,易受到操作條件和生物環(huán)境變化的干擾,因此將顏色信號和熒光信號集成在一個傳感平臺中不僅可以有效地提高分析效率,而且通過增大檢測線性范圍、增強精度和增加應(yīng)用靈活性來提高分析性能。QIAN等[42]開發(fā)了雙通道分析的新型多功能適配體傳感器,具有類過氧化物酶活力和促進銀沉積能力的AuNPs被用作比色和電化學(xué)技術(shù)的通用標(biāo)記(圖2-d),制備適配體修飾的Fe3O4@Au MBs和cDNA修飾的AuNPs作為捕獲探針和信號探針,2個探針使用Apt和cDNA之間的雜交反應(yīng)相互偶聯(lián),在暴露于AFB1后,由于Apt-AFB1復(fù)合物的形成,部分cDNA-AuNPs與MBs-Apt分離。AuNPs可以催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生藍色氧化TMB,釋放的cDNA-AuNPs報告探針使用外部磁場進行分離和收集,用于AFB1的比色和電化學(xué)雙通道檢測,雙通道方法相互驗證,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,進一步拓寬了比色傳感器在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用范圍。

比色適配體傳感器適用于批量樣品檢測,目前比色法大多采用溶液均相體系,檢測探針、目標(biāo)物質(zhì)均放置在同一溶液中,雖然在緩沖體系、標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品檢測時有較好的檢測性能,但在實際樣品檢測時,會有一些局限性,如樣品顏色的影響、環(huán)境因素的干擾及多靶標(biāo)分析,檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性會受到影響。因此在構(gòu)建傳感器之前,應(yīng)考慮待檢樣品中非靶標(biāo)物質(zhì)的影響,提升比色適配體傳感器的抗干擾能力是研究重點和發(fā)展趨勢。

3 熒光適配體傳感器在檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用

熒光法具有信號響應(yīng)快、靈敏度高、可選擇性標(biāo)記等優(yōu)點,能適用于多種靶物質(zhì)檢測[43]。通過適配體與黃曲霉毒素強識別親和力,實現(xiàn)對目標(biāo)物的半定量/定量分析。

利用分子信標(biāo)原理,適配體用熒光團或猝滅劑進行標(biāo)記,通過兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)效應(yīng)[44]構(gòu)建不同傳感裝置,實現(xiàn)“信號開啟”或“信號關(guān)閉”的熒光響應(yīng)差異。熒光材料如熒光染料和熒光納米粒子,與適配體的集成可以實現(xiàn)高靈敏度、選擇性及快速分析,使其成為熒光適配體傳感器生物測定候選材料。PAN等[45]設(shè)計了基于雙發(fā)射持久發(fā)光納米粒子(persistent luminescent nanoparticles,PLNP)標(biāo)記Apt和Cy5.5標(biāo)記cDNA的比率適配體熒光傳感器,原理如圖3-a所示,雙發(fā)射PLNP ZnGa2O4:Cr 0.000 1作為磷光光源,Cy5.5為能量轉(zhuǎn)移的受體和猝滅基團,AFB1存在時,熒光信號增強。此熒光適配體傳感器具有不需要原位激發(fā)、無自發(fā)熒光和外源干擾及高靈敏度和選擇性等優(yōu)點,在精確測定復(fù)雜基質(zhì)中痕量AFB1中表現(xiàn)出巨大潛力,檢出限為0.016 ng/mL。REN等[46]成功構(gòu)建了基于自組裝DNA四面體信號開關(guān)熒光適配體傳感器,DNA四面體結(jié)構(gòu)由4個特殊的單鏈DNA S1、S2、S3和S4組成,其中一個邊緣延伸有發(fā)夾結(jié)構(gòu),與OTA適配體部分互補,另一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)嵌入在另一邊,與AFB1適配體部分互補。OTA和AFB1的存在與否可以控制發(fā)夾結(jié)構(gòu)的關(guān)閉和打開,從而調(diào)節(jié)Cy3與Cy5和BHQ2之間的距離,相應(yīng)地改變熒光強度?？梢酝ㄟ^Cy3和Cy5的熒光強度變化間接定量分析OTA和AFB1,檢出限分別為0.005 ng/mL和0.01 ng/mL,該熒光傳感器成功地應(yīng)用于玉米和葡萄酒的OTA和AFB1的同時檢測。

a-PLNP@Cy5.5熒光適配體傳感器檢測熒光適配體傳感器檢測c-Uio-66-NH2-apt-TAMRA熒光適配體傳感器檢測熒光適配體傳感器檢測AFB1[49]

內(nèi)濾效應(yīng)(inner filter effect,IFE)不需要供體的表面修飾或供體和受體之間的任何共價連接來滿足特定距離,效率與光譜重疊程度直接相關(guān)。XIONG等[47]開發(fā)了一種用于AFB1比色和熒光雙模檢測的無標(biāo)記適配傳感器,原理如圖3-b所示。在沒有AFB1的情況下,AgNPs由于適配體保護,溶液保持黃色。在AFB1存在下,Apt優(yōu)先與AFB1結(jié)合,隨后從AgNPs表面解吸,導(dǎo)致AgNPs聚集在鹽溶液中,顏色變?yōu)榛疑?之后將精氨酸修飾的發(fā)光增強金納米團簇引入反應(yīng)體系,通過光譜重疊介導(dǎo)的IFE,將顏色信號成功轉(zhuǎn)化為更靈敏的熒光信號。熒光信號下檢測AFB1的檢測限為1.91 ng/mL,比顏色信號提高6.4倍。構(gòu)建的適配體傳感器集成了無標(biāo)記、雙信號、自校準(zhǔn)、操作簡便、成本效益高等多種優(yōu)點,可作為定量AFB1控制食品樣品中霉菌毒素的替代方法。

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)是指在光照下不同狀態(tài)的供電子基團和接收電子基團發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致熒光猝滅。姚惠文等[48]利用金屬有機框架氨基功能化的奧斯陸大學(xué)66(Amino-functionalized University of Oslo 66,UiO-66-NH2)和標(biāo)記有四甲基羅丹明(tetramethyl rhodamine,TAMRA)熒光團的核酸適配體(TAMRA-aptamer)構(gòu)建了熒光適配體傳感器用于檢測AFB1。TAMRA-aptamer通過π-π堆積作用吸附于UiO-66-NH2表面,由于PET使TAMRA-aptamer的熒光猝滅。加入目標(biāo)物AFB1后,熒光恢復(fù)。所構(gòu)建的熒光傳感器的熒光強度與AFB1的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢測限為0.5 ng/mL。

聚集誘導(dǎo)發(fā)射(aggregation-induced emission,AIE)是指水溶液中不發(fā)射或者弱發(fā)射熒光,而在聚集狀態(tài)時由于分子內(nèi)運動受限而表現(xiàn)出高度發(fā)光。ZHAO等[49]提出了一種基于AIE和FRET的內(nèi)在構(gòu)象響應(yīng)杠桿適配體探針(iconAptamer)用于AFB1檢測(原理示意圖如圖3-d所示)。AIE染料與末端標(biāo)記的熒光團之間的FRET過程會在結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程中引起距離效應(yīng),產(chǎn)生熒光信號響應(yīng)。室溫下1 min內(nèi)即可實現(xiàn)食品和環(huán)境樣品中AFB1污染的檢測。

與比色法相似,熒光法主要在溶液均相體系中進行檢測,即熒光探針和檢測物在同一溶液中,所以在檢測靶標(biāo)分析時會受到一些因素的影響,如實際樣品或檢測體系中的重金屬離子、pH、離子強度及其他干擾物,進而影響傳感器檢測可靠性基于適配體的熒光法能借鑒電化學(xué)法的檢測原理,開發(fā)并構(gòu)建熒光界面?zhèn)鞲心せ蚱渌杀Ｗo材料的殼,進而提升傳感裝置的抗干擾性能及對黃曲霉毒素分析的準(zhǔn)確性,這也作為適配體熒光傳感器的未來發(fā)展趨勢。

4 表面增強拉曼散射適配體傳感器在檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用

表面增強拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)是一種用于檢測貴金屬(金或銀)納米結(jié)構(gòu)為增強基底表面或附近的分子,可將分子微弱的拉曼信號增強至幾個數(shù)量級的超靈敏振動光譜技術(shù),具有窄帶寬和特征分子指紋光譜的特點[50-51]?；赟ERS適配體傳感器具有檢測速度快、特異性強、靈敏度高、多目標(biāo)物檢測等優(yōu)點。

CHEN等[52]開發(fā)了基于氧化石墨烯的比率性SERS適配體傳感器,如圖4-a所示,4-巰基苯甲酸作為拉曼信號物嵌入Au@Ag核殼納米粒子和與Ag殼偶聯(lián)的AFB1適配體作為信號探針,AFB1-Apt通過π-π堆疊相互作用與拉曼信號修飾的AuNPs/銦錫氧化物玻璃連接到GO表面,促進信號的進一步放大,實現(xiàn)真實花生樣品中AFB1檢測,檢出限低至0.000 1 ng/mL。HE等[53]構(gòu)建了基于磁分離的SERS適配體傳感器,AFB1適配體通過Au-S鍵標(biāo)記在Au@Ag納米球上,cDNA標(biāo)記于Fe3O4@Au納米花上,在沒有AFB1的情況下,由于SERS效應(yīng)獲得高強度的拉曼信號。相反,適配體與AFB1結(jié)合,從而觸發(fā)信號探針的釋放,導(dǎo)致磁分離后SERS強度降低,實現(xiàn)AFB1的痕量檢測。上述方法基于單個信號,易受到共存物質(zhì)、儀器和非標(biāo)準(zhǔn)分析儀器的干擾,因此,HE等[54]進一步構(gòu)建了SERS和熒光雙信號適配體傳感器,用于花生、核桃和杏仁樣品中的AFB1檢測(圖4-b)。Cy5為熒光信號和拉曼信號,聚乙烯亞胺修飾的MNP@Ag微球通過靜電相互作用吸附Apt,當(dāng)檢測出AFB1時,熒光信號增強,SERS信號減弱,結(jié)果表明,SERS法和熒光法在0.001～1 000 ng/mL和0.2～20 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

a-SERS適配體傳感器檢測熒光雙信號適配體傳感檢測AFB1[54]

SERS作為一種原位無損的檢測技術(shù),無需在檢測前進行較復(fù)雜的前處理,即可進行檢測,具有成本低、靈敏度高、多路復(fù)用性好等特點,在檢測黃曲霉毒素分析應(yīng)用中優(yōu)勢顯著并取得較大研究進展。但SERS適配體傳感器在檢測黃曲霉毒素時也存在信號重現(xiàn)性差及樣本在敞開體系中易被污染等問題,因此實現(xiàn)在微升甚至納升的基質(zhì)中目標(biāo)物的快速靈敏檢測需作出更多的努力。

5 結(jié)論與展望

本文綜述了基于適配體的生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應(yīng)用研究。利用適配體的優(yōu)良特性,構(gòu)建高性能的適配體傳感器,能夠?qū)崿F(xiàn)對黃曲霉毒素快速、靈敏及特異性檢測。其中,電化學(xué)適配體傳感靈敏度高、抗干擾能力強,但是由于受檢測儀器的限制,高通量傳感陣列適配體傳感器難以制備。比色法適配體傳感器制備時間短、可操作性強及信號易于采集,能實現(xiàn)可視化現(xiàn)場檢測,但檢測體系大多采用溶液相反應(yīng),使得容易受到待測系統(tǒng)中其他物質(zhì)的干擾,進而影響檢測的精密度和可靠性,因此仍需提高比色適配體傳感器的抗干擾性,推動快檢產(chǎn)品應(yīng)用的發(fā)展。熒光法因其簡單、快速和高靈敏度而備受關(guān)注,然而大多數(shù)熒光方法需要外部光源的連續(xù)激發(fā),難以避免來自樣品復(fù)雜基質(zhì)的自體熒光干擾,仍需開發(fā)自體熒光和抗外源干擾的傳感器,用于測定復(fù)雜樣品中的黃曲霉毒素。SERS適配體傳感器能滿足食品現(xiàn)場檢測分析的基本要求,但基底的穩(wěn)定性和均一性對環(huán)境要求嚴格,導(dǎo)致SERS傳感器使用受到限制,對黃曲霉毒素檢測靈敏度顯著下降,因此避免基質(zhì)效應(yīng)是保證方法準(zhǔn)確性的重要措施。

綜上所述,采用適配體傳感技術(shù)可以實現(xiàn)目標(biāo)物黃曲霉毒素快速、特異性檢測,但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用的需要,為更好不斷的展現(xiàn)該技術(shù)的廣泛應(yīng)用范圍和發(fā)展?jié)摿?適配體傳感器的構(gòu)建在未來的研究中仍需關(guān)注:a)傳感探針的再生性和重復(fù)性有待改善,以便進一步提高檢測黃曲霉毒素的靈敏性;b)目前適配體傳感器大多僅針對單一目標(biāo)物如AFB1或AFM1的檢測,需增加多通道陣列、多目標(biāo)物檢測;c)多種檢測技術(shù)是在溶液相均相體系中反應(yīng),因此會存在對黃曲霉毒素檢測時存在干擾基質(zhì)影響檢測的可靠性,探索便攜式、模塊化、減少基質(zhì)效應(yīng)的生物傳感方法;d)在能實現(xiàn)檢測AFB1和AFM1要求的基礎(chǔ)上,將預(yù)處理簡單化,提高檢測效率;e)目前大多數(shù)傳感器所用的AFB1和AFM1適配體序列還為多年前篩選出的,有必要增加適配體種類?？傊?今后傳感技術(shù)的應(yīng)用仍需要深入研究和探索,致力于研發(fā)快速、高效、現(xiàn)場、家庭化、商業(yè)化和便攜式的定量檢測霉菌毒素的適配體傳感器,使得更多的家庭和欠發(fā)達地區(qū)能實現(xiàn)食品或環(huán)境中的AFB1和AFM1的檢測,為食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生、生命科學(xué)等領(lǐng)域創(chuàng)造實際價值,進而為人類和動物的生命健康安全提供必要保障。