基于多重免疫組化技術(shù)探討股骨頭壞死愈膠囊治療激素性股骨頭壞死的作用機制

簡羿,馬茂瀟,郭珈宜,劉又文,岳辰

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,湖南 長沙 410208;2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院,河南 洛陽 471002)

股骨頭壞死是骨科臨床中常見的高致殘性疾病之一,創(chuàng)傷、酗酒及激素濫用等是引起股骨頭壞死的主要因素[1]。我國股骨頭壞死患者中約有1/4為激素濫用引起[2]。對于早期激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH)患者,如不能采取有效的干預(yù)措施,多數(shù)患者會在5年內(nèi)發(fā)生股骨頭塌陷、壞死[3]。股骨頭壞死愈膠囊是平樂郭氏正骨治療“骨蝕”的經(jīng)典方劑,具有補益肝腎、活血化瘀的作用。我們團隊前期研究發(fā)現(xiàn),股骨頭壞死愈膠囊具有改善髖關(guān)節(jié)功能、減緩SONFH發(fā)病進程、降低股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)后股骨頭壞死發(fā)生率的作用[4-5]。但股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH的作用機制尚不清楚。多重免疫組化(multiplex immunohistochemistry,mIHC)是一項先進的病理學(xué)檢測技術(shù),在推演上下游信號通路、探索藥物作用機制方面具有一定的優(yōu)勢[6]。目前,mIHC已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管疾病、腸道疾病等的機制研究[7-9]。我們前期采用mIHC成功揭示了非創(chuàng)傷性股骨頭壞死巨噬細胞異常極化的相關(guān)機制[10]。為了探討股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH的作用機制,我們建立了SONFH大鼠模型,并采用mIHC進行了相關(guān)實驗研究,現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

無特定病原SD大鼠100只,購自成都達碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可SCXK(川)2020-0030]。實驗方案經(jīng)河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)倫理委員會審查通過,倫理批件號:KY2021-007-01。

1.2 實驗藥物

股骨頭壞死愈膠囊[河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)院內(nèi)制劑,批號:20200209;規(guī)格:每粒裝0.35 g]。

1.3 實驗試劑

甲潑尼龍、蘇木素(北京索萊寶科技有限公司),脂多糖(美國Sigma公司),10%中性福爾馬林[康迪斯化工(湖北)有限公司],Opal多色熒光免疫組化標(biāo)記試劑盒(美國Akoya Biosciences公司),CD68、CD80、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65抗體(美國Abcam公司),CD206抗體(美國Thermo公司)。

1.4 實驗儀器

HM 340E石蠟切片機、TLZ11攤片儀、ClearVue全自動封片儀(美國Thermo公司),BX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司),vivaCT40 Micro-CT(瑞士SCANCO Medical AG公司)。

2 方 法

2.1 分組方法

將100只大鼠稱重后按體質(zhì)量排序編號,從隨機數(shù)字表中抄錄100個連續(xù)的2位數(shù)記錄在大鼠編號下方,將隨機數(shù)字除以4,余數(shù)為1的隨機數(shù)字對應(yīng)的大鼠納入正常對照組,余數(shù)為2的隨機數(shù)字對應(yīng)的大鼠納入模型組,余數(shù)為3的隨機數(shù)字對應(yīng)的大鼠納入低劑量藥物治療組,整除的隨機數(shù)字對應(yīng)的大鼠納入高劑量藥物治療組。若分配不均,則繼續(xù)抄錄隨機數(shù)字并采用余數(shù)法進行調(diào)整。

2.2 大鼠SONFH造模方法

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,將模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠采用改良的脂多糖聯(lián)合甲潑尼龍法建立SONFH模型[11]:按照10 μg·kg-1的劑量給SD大鼠肌肉注射脂多糖,共注射2次,2次間隔7 d,第2次注射脂多糖24 h后,按照25 mg·kg-1的劑量給SD大鼠肌肉注射甲潑尼龍,每日注射1次,連續(xù)注射3 d。

2.3 治療方法

造模結(jié)束后,低劑量藥物治療組按照0.33 g·kg-1的劑量給予股骨頭壞死愈膠囊溶液(將股骨頭壞死愈膠囊粉劑溶于水中)灌胃,高劑量藥物治療組按照 0.67 g·kg-1的劑量給予股骨頭壞死愈膠囊溶液灌胃,正常對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。每日灌胃2次,連續(xù)治療4周。藥物等效劑量均按照人體與SD大鼠的體表面積進行換算。

2.4 評價方法

2.4.1Micro-CT掃描分析大鼠股骨頭松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu) 治療結(jié)束后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,分離大鼠雙側(cè)股骨,注意避免股骨頭軟骨損傷。將大鼠股骨固定于4%多聚甲醛中24 h后,再置于0.9%生理鹽水中浸泡24 h。采用vivaCT40 Micro-CT對大鼠股骨進行掃描,并進行三維重建。采用儀器自帶軟件分析股骨頭松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu),并提取大鼠股骨頭松質(zhì)骨的骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量(1 mm線段與骨小梁交點的個數(shù))及骨小梁分離度(骨小梁之間的平均距離)等指標(biāo)。

2.4.2組織切片染色觀察大鼠股骨頭組織病理學(xué)改變 將大鼠股骨浸入10%中性福爾馬林中浸泡固定48 h,常規(guī)脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片。取股骨頭組織切片,采用HE染色觀察股骨頭組織病理學(xué)改變,計算空骨陷窩率和骨壞死發(fā)生率:在200倍鏡下隨機選取10個視野,計算每個視野中骨小梁空骨陷窩數(shù)與骨小梁細胞數(shù)的比值,10個視野比值的平均值即為空骨陷窩率;當(dāng)空骨陷窩率>50%,提示發(fā)生股骨頭壞死,任一側(cè)發(fā)生股骨頭壞死的大鼠數(shù)量與組內(nèi)大鼠數(shù)量的比值即為骨壞死發(fā)生率。

2.4.3mIHC檢測巨噬細胞極化及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達 取股骨頭組織石蠟切片,脫蠟水化后,加入EDTA抗原修復(fù)液,于微波高火下修復(fù)抗原;加入抗原封閉液,室溫封閉10 min;加入CD206一抗(抗體稀釋比例為1∶200),4 ℃孵育過夜;PBS緩沖液漂洗后,加入Opal Polymer HRP抗鼠/兔通用型二抗,37 ℃孵育10min;PBS緩沖液避光漂洗后,加入Opal520試劑室溫顯色10 min。再次加入EDTA抗原修復(fù)液,于微波高火下修復(fù)抗原,按照上述步驟依次完成CD68(抗體稀釋比例為1∶200)、CD80(抗體稀釋比例為1∶100)、TLR4(抗體稀釋比例為1∶100)、MyD88(抗體稀釋比例為1∶100)、NF-κB P65(抗體稀釋比例為1∶200)的標(biāo)記和顯色。完成所有蛋白的標(biāo)記和顯色后,PBS緩沖液避光漂洗,滴加DAPI染料,避光孵育5 min;雙蒸水避光漂洗后,加入防淬滅劑后,封片。于熒光顯微鏡下觀察切片,采用Qupath 0.3.4軟件統(tǒng)計CD206、CD68、CD80、TLR4、MyD88、NF-κB P65的熒光強度,分析CD206、CD68、CD80、TLR4、MyD88、NF-κB P65的蛋白相對表達量,并計算M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞的占比。M1型巨噬細胞占比=CD80的相對熒光強度/CD68的相對熒光強度×100%,M2型巨噬細胞占比=CD206的相對熒光強度/CD68的相對熒光強度×100%。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度、空骨陷窩率、M1型巨噬細胞占比、M2型巨噬細胞占比及TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量的組間比較均采用單因素方差分析,組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗;骨壞死發(fā)生率的組間比較采用卡方檢驗,兩兩比較采用卡方分割法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,卡方分割檢驗水準(zhǔn)α’=0.012 5。

3 結(jié) 果

3.1 一般結(jié)果

模型組1只大鼠于造模后死亡,低劑量藥物治療組和高劑量藥物治療組分別有3只和2只大鼠在治療過程中死亡。正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好、進食正常、毛發(fā)光澤無脫落,模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠在造模開始后第3天出現(xiàn)神情不振、進食減少、少量脫毛,1周后精神、進食等逐漸恢復(fù)。

3.2 大鼠股骨頭松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)Micro-CT掃描分析結(jié)果

大鼠股骨近端CT片顯示,正常對照組股骨頭松質(zhì)骨的骨小梁呈多孔網(wǎng)架結(jié)構(gòu),排列規(guī)律,骨小梁數(shù)量、厚度正常;模型組骨小梁明顯減少、變細,稀疏,排列不規(guī)律;高劑量藥物治療組骨小梁較模型組增厚、變粗,致密,排列規(guī)律;低劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)介于模型組與高劑量藥物治療組之間(圖1)。正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質(zhì)骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁分離度組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質(zhì)骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量均小于正常對照組(骨體積分數(shù):P=0.000,P=0.000,P=0.000;骨小梁厚度:P=0.000,P=0.003,P=0.026;骨小梁數(shù)量:P=0.000,P=0.000,P=0.031),骨小梁分離度均大于正常對照組(P=0.000,P=0.001,P=0.036);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質(zhì)骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度與模型組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.052,P=0.071),骨小梁數(shù)量大于模型組(P=0.012),骨小梁離散度小于模型組(P=0.001);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭松質(zhì)骨骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量大于模型組(P=0.001,P=0.011,P=0.000),骨小梁離散度小于模型組(P=0.001),骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁離散度與低劑量藥物治療組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.146,P=0.414,P=0.086,P=0.146)。見表1。

表1 4組大鼠股骨頭松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)Micro-CT掃描分析結(jié)果

圖1 4組大鼠股骨近端CT片

3.3 大鼠股骨頭組織病理學(xué)觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示,正常對照組大鼠股骨頭骨小梁內(nèi)無明顯空骨陷窩,細胞核正常;模型組、低劑量藥物治療組及高劑量藥物治療組大鼠股骨頭骨小梁內(nèi)出現(xiàn)不同程度的空骨陷窩,細胞核變小、萎縮并移動到細胞邊緣,且以模型組最為明顯(圖2)。正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率、骨壞死發(fā)生率組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率、骨壞死發(fā)生率均高于正常對照組(空骨陷窩率:P=0.000,P=0.000,P=0.000;骨壞死發(fā)生率:P=0.000,P=0.000,P=0.000);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率低于模型組(P=0.000),骨壞死發(fā)生率與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.054);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭空骨陷窩率和骨壞死發(fā)生率均低于模型組(P=0.000,P=0.000),空骨陷窩率低于低劑量藥物治療組(P=0.049),骨壞死發(fā)生率與低劑量藥物治療組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.556)。見表2。

表2 4組大鼠股骨頭空骨陷窩率和骨壞死發(fā)生率

圖2 4組大鼠股骨頭組織切片HE染色結(jié)果(×200)

3.4 巨噬細胞極化mIHC檢測結(jié)果

正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比均高于正常對照組(M1型巨噬細胞占比:P=0.000,P=0.000,P=0.000;M2型巨噬細胞占比:P=0.000,P=0.000,P=0.000);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞占比與模型組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.270,P=0.533);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比低于模型組(P=0.009),M2型巨噬細胞占比高于模型組(P=0.006);高劑量藥物治療組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比與低劑量藥物治療組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.131),M2型巨噬細胞占比高于低劑量藥物治療組(P=0.038)。見表3、圖3。

Merge表示融合圖片,DAPI為4,6-二脒基-2-苯基吲哚,TLR4為Toll樣受體4,MyD88為髓樣分化因子初次應(yīng)答基因88,NF-κB p65為核因子-κB p65。

3.5 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達mIHC檢測結(jié)果

正常對照組、模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88、NF-κB p65的蛋白相對表達量組間比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。模型組、低劑量藥物治療組、高劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均高于正常對照組(TLR4蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.028;MyD88蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.001;NF-κB p65蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.000,P=0.001);低劑量藥物治療組大鼠股骨頭TLR4、MyD88蛋白相對表達量與模型組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.268,P=0.280),NF-κB p65蛋白相對表達量低于模型組(P=0.034);高劑量藥物治療組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均低于模型組和低劑量藥物治療組(TLR4蛋白相對表達量:P=0.002,P=0.040;MyD88蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.013;NF-κB p65蛋白相對表達量:P=0.000,P=0.039)。見表4、圖3。

4 討 論

SONFH屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痿”“骨痹”范疇,其主要證候為腎虛、血瘀。因此,補腎活血是SONFH的主要治則。股骨頭壞死愈膠囊作為平樂郭氏正骨的經(jīng)典方劑,臨床實踐顯示其治療SONFH效果顯著。該方由鹿茸、丹參、續(xù)斷、杜仲、黃芪、水蛭、雞血藤、玄參、連翹、乳香、沒藥共11味藥物組成。相關(guān)研究表明,杜仲的主要活性成分杜仲苷能夠有效抑制SONFH發(fā)病進程[12],丹參、川芎等活血類中藥的有效成分也被證實具有抑制炎癥反應(yīng)的作用[13-14]。但股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH作用機制尚不清楚。

SONFH的發(fā)生與持續(xù)性慢性炎癥所導(dǎo)致的骨再生障礙密切相關(guān),因而SONFH的炎癥反應(yīng)機制也成為研究的重點[15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),M1型巨噬細胞的過度激活是引起SONFH持續(xù)性慢性炎癥的主要原因[16-17],而M1型巨噬細胞不能向M2型巨噬細胞極化是導(dǎo)致SONFH微環(huán)境內(nèi)持續(xù)慢性炎癥和組織破壞的關(guān)鍵,在股骨頭壞死的進程中起著至關(guān)重要的作用[18-20]。骨組織損傷后,骨細胞和骨髓細胞釋放的損傷相關(guān)模式分子將巨噬細胞招募到損傷區(qū)域,并將其極化為M1型巨噬細胞,進而促進炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6的分泌,啟動和維持炎癥反應(yīng),并導(dǎo)致骨修復(fù)和再生障礙[21]。而促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化,則能夠抑制SONFH慢性炎癥持續(xù)、減輕組織破壞,進而促進骨組織的再生與修復(fù)[22-23]。TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路,在巨噬細胞的極化過程中發(fā)揮重要作用[24-25]。Adapala等[26]通過研究豬股骨頭壞死模型發(fā)現(xiàn),在壞死骨組織引起巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化過程中,TLR4的表達量顯著增加,且引起了依賴MyD88途徑的下游信號的改變。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn),抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可以有效抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放,抑制炎癥反應(yīng),促進壞死骨組織內(nèi)的骨形成,從而延緩SONFH進展。我們采用mIHC探討股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH作用機制,結(jié)果顯示,模型組大鼠股骨頭M1型巨噬細胞占比、M2型巨噬細胞占比均顯著上升,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達上調(diào);股骨頭壞死愈膠囊治療后能夠顯著抑制巨噬細胞向M1型極化、促進巨噬細胞向M2型極化,能夠抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的上調(diào);且股骨頭壞死愈膠囊對巨噬細胞極化及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的影響具有一定的濃度依賴性。

本研究結(jié)果表明,股骨頭壞死愈膠囊治療SONFH,能夠顯著改善股骨頭骨微結(jié)構(gòu)、抑制骨壞死,其作用具有一定的劑量依賴性;其作用機制與調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達及巨噬細胞極化有關(guān)。