冰凍切片免疫熒光 石蠟切片免疫熒光 石蠟切片免疫組織化學在系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病分型中的應用研究

代陸軍 楊文秀

【摘要】 目的 探討冰凍切片免疫熒光（frozen-immunofluorescence，F(xiàn)-IF）、石蠟切片免疫熒光（paraffin-immunofluorescence，P-IF）和石蠟切片免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）在系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病分型中的應用。方法 選取2020年5月—2022年5月在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院確診的52例系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病患者，所有系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病樣本均進行F-IF、P-IF和IHC標記染色，比較這3種病理檢驗方法對于系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病分型的效能。結(jié)果 52例患者經(jīng)F-IF檢測分型50例，分型率為96.15%;P-IF檢測分型34例，分型率為65.38%;IHC檢測分型36例，分型率為69.23%。F-IF檢測的分型率高于P-IF、IHC分型率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。F-IF檢測中僅κ+檢出9例，僅λ+檢出38例，雙陽性（強度差較大，提示分型）3例;未分型2例，均為陰性。P-IF檢測中僅κ+檢出6例，僅λ+檢出27例，雙陽性（強度差較大，提示分型）1例;未分型18例，其中雙陽性（強度差較小，分型困難）6例，陰性12例。IHC中僅κ+檢出6例，僅λ+檢出25例，雙陽性（強度差較大，提示分型）5例;未分型16例，其中雙陽性（強度差較小，分型困難）4例，陰性12例。3種方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 相較于P-IF和IHC，F(xiàn)-IF對系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病的分型診斷更為準確，可以在臨床上作為輔助診斷的手段，指導診療方案的制定。

【關(guān)鍵詞】 輕鏈型淀粉樣變性腎病;分型診斷;病理檢驗方法

文章編號：1672-1721（2024）07-0107-04? ? ?文獻標志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R692

淀粉樣變腎病是指淀粉樣纖維大量沉積于腎臟引起的病變[1]，主要表現(xiàn)為腎病綜合征，進入晚期會導致腎功能衰竭[2]。系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病是其中的一種分型，是由漿細胞異常產(chǎn)生單克隆輕鏈沉積于各組織器官引起的疾病，臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿，隨著病情進展可發(fā)展為終末期腎病[3]。系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病的分型與治療方案與患者的預后密切相關(guān)，對于淀粉樣變的分型做出正確的診斷具有重要意義。系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病根據(jù)其輕鏈類型可以分為κ型和λ型，其中κ型所占比例較λ型低[4]，但是輕鏈型淀粉樣變腎病κ型患者相較于λ型出現(xiàn)肝臟和腎間質(zhì)受累的頻率更高，器官病變會更加嚴重。腎活檢病理檢查是診斷輕鏈型淀粉樣變的重要手段[5]，在患者疾病早期做出正確判斷，可改善輕鏈型淀粉樣變性腎病患者預后。本研究探討了常用病理檢驗方法在輕鏈型淀粉樣變性腎病分型診斷中的效能，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年5月—2022年5月在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院確診的52例輕鏈型淀粉樣變性腎病患者，患者年齡為26～50歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

納入標準：符合輕鏈型淀粉樣變性腎病診斷標準[6];病理診斷為剛果紅染色陽性，高錳酸鉀預處理后樣本的病理診斷仍為陽性，偏振光下會呈現(xiàn)出蘋果綠色雙折光，患者病理學檢查結(jié)果顯示為單一輕鏈陽性，物理檢查下可見細纖維狀結(jié)構(gòu)，無分支，僵硬，排列紊亂。

排除標準：患者對研究中試劑有過敏史。

1.2 方法

樣本采集：通過腎穿刺活檢獲取腎臟病變組織，分別進行F-IF、P-IF、IHC和激光顯微切割術(shù)聯(lián)用質(zhì)譜（LMD/MS）分析。所有樣本均行輕鏈的免疫標記（κ、λ）。

F-IF：冰凍切片置于室溫晾干15 min，用組化油筆將待染組織圈好，放入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中浸泡10 min，用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1 h，加入輕鏈抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，15 min/次，封片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并記錄。此過程中要注意，整個檢測過程中要保證表面干燥，稀釋、加入熒光抗體以及之后的洗滌過程中注意避光。

P-IF：60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟15 min，重復3次。水化時，依次經(jīng)過無水乙醇，體積分數(shù)為95%、90%、80%、70%的乙醇各5 min，蒸餾水（或自來水）5 min。

PBS洗5 min，重復步驟3次。使用0.01 M枸櫞酸修復液煮沸（沸水?。┻M行修復維持15 min，樣本自然涼放置到室溫。PBS再洗5 min，重復步驟3次。正常山羊血清封閉，在37 ℃下維持20 min，之后用PBS洗5 min，重復3次。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核，1∶1 000稀釋，室溫作用5 min。防淬滅熒光封片劑封片，顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

IHC：石蠟切片放置在60 ℃恒溫箱中烘烤120 min，脫蠟和水化步驟是二甲苯（20 min）→二甲苯（20 min）→無水乙醇（5 min）→質(zhì)量分數(shù)為95%的乙醇（5 min）→質(zhì)量分數(shù)為80%的乙醇（5 min）。PBS洗2次各5 min，蒸餾水沖洗1次5 min?？乖迯蜁r，當壓力鍋開始噴氣時，蓋上氣閥，冷卻時取下氣閥，冷卻至室溫。蒸餾水洗1次

5 min，PBS洗2次各5 min，質(zhì)量分數(shù)為3%的H2O2在室溫下孵育30 min，PBS洗3次各5 min，滴加藍色試劑，室溫孵育30 min后傾倒，PBS沖洗3次各5 min，滴加黃色試劑，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次各5 min，滴加試劑C（橙色），37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次各5 min，DAB顯色5～20 min，自來水充分沖洗，蘇木素復染2～3 min，自來水充分沖洗，鹽酸酒精分化2 s，自來水充分沖洗。脫水后用中性樹脂，加蓋玻片（勿殘留氣泡），自然晾干。

LMD/MS分析[7]：對F-IF、P-IF、IHC均無法分型的樣本采用LMD/MS進行分析，分離4～6個腎小球，每例取樣3次;將病變組織收集到含緩沖液的試管中，充分渦旋振蕩并水浴孵育60 min，40 kHz超聲波處理30 min后，二硫蘇糖醇還原及碘乙酰胺烷基化;將提取的蛋白37 ℃下胰蛋白酶酶解后液相色譜分離及串連質(zhì)譜分析。

1.3 結(jié)果判斷標準

1.3.1 F-IF和P-IF結(jié)果

“-”說明結(jié)果為陰性?！啊馈闭f明結(jié)果可疑，需要再次檢測?！?”表示陽性，說明視野中僅見微弱熒光;“++”說明視野中熒光微弱稀散;“+++”說明視野下可以看到強熒光。

1.3.2 IHC結(jié)果

“-”說明視野中沒有發(fā)現(xiàn)著色，樣本中沒有發(fā)現(xiàn)棕黃色;“+”（弱陽性）說明視野可見范圍內(nèi)≤10%的部分呈現(xiàn)不同程度的棕黃色著色，其他部位沒有顯色;“++”說明視野可見范圍內(nèi)10%～30%的部分呈現(xiàn)強的棕褐色著色，或者≤70%的部分呈現(xiàn)弱或中等強度的著色;“+++”說明視野可見范圍內(nèi)>30%的部分呈現(xiàn)強的棕褐色或≥70%的中等強度棕黃色著色。

1.3.3 LMD/MS分析結(jié)果

結(jié)果有高豐度κ輕鏈恒定區(qū)表達，顯著高于其他淀粉樣變致病蛋白，可以診斷為輕鏈型淀粉樣變腎病κ型患者。結(jié)果有高豐度λ輕鏈恒定區(qū)表達，顯著高于其他淀粉樣變致病蛋白，可以診斷為輕鏈型淀粉樣變腎病λ型患者。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，樣本的檢出率等計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 輕鏈型淀粉樣變性腎病患者的F-IF、P-IF、IHC分型率比較

52例患者經(jīng)F-IF、P-IF、IHC檢測共分型50例，其中F-IF檢測輕鏈型淀粉樣變性腎病分型率為96.15%，P-IF的分型率為65.38%，IHC的分型率為69.23%。F-IF分型率高于P-IF、IHC分型率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。未分型患者共2例，經(jīng)LMD/MS分析均為λ型，見表1。

2.2 輕鏈型淀粉樣變性腎病患者的F-IF、P-IF、IHC分型具體情況比較

52例患者經(jīng)F-IF檢測分型50例，其中僅κ+檢出9例，僅λ+檢出38例，雙陽性（強度差較大，提示分型）3例;未分型2例，均為陰性。P-IF檢測分型34例，其中僅κ+檢出6例，僅λ+檢出27例，雙陽性（強度差較大，提示分型）1例;未分型18例，其中雙陽性（強度差較小，分型困難）6例，陰性12例。IHC檢測分型36例，其中僅κ+檢出6例，僅λ+檢出25例，雙陽性（強度差較大，提示分型）5例;未分型16例，其中雙陽性（強度差較小，分型困難）4例，陰性12例。3種方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

淀粉樣變常會侵犯機體多個器官和系統(tǒng)，導致患者出現(xiàn)不同程度的身體器官機能障礙。淀粉樣變指一種形似淀粉樣的物質(zhì)沉降于機體各部位，可能侵犯于各個器官，也可能只存在于表皮，會對機體正常的生理功能產(chǎn)生一定的影響，其形成原因尚不明確[8]。淀粉樣物質(zhì)是由來源于各處的小分子前體蛋白通過一定的改變發(fā)生了異常變形，由一種可以溶解的物質(zhì)最終形成了難以溶解的纖維絲，在體內(nèi)各個器官沉積，導致器官發(fā)生功能障礙[9]。系統(tǒng)性淀粉樣變性通過不同的前體蛋白分型可以分為12種，其中最為常見的是輕鏈型淀粉樣變。輕鏈型淀粉樣變性腎病是一種不可治愈性疾病，主要是單克隆免疫球蛋白輕鏈在折疊過程中發(fā)生了錯誤，沉積于體內(nèi)，導致沉積部位的功能發(fā)生障礙，進而破壞其結(jié)構(gòu)和發(fā)展。不同類型的這一疾病臨床治療方案不同，及早快速且準確地對患者進行疾病分型對于治療方案的確立和預后轉(zhuǎn)歸的進展具有積極意義[10]。影響疾病正確分型的重要因素之一是樣本的質(zhì)量。輕鏈型淀粉樣變性腎病主要侵害的器官是腎臟，腎臟進行活檢的取材陽性率較高，且對患者身體的危害性較小，患者安全性較高。故本研究采用常用的病理檢驗方法來探究其在輕鏈型淀粉樣變性腎病分型診斷中的效能。

本研究結(jié)果顯示，52例患者經(jīng)F-IF、P-IF、IHC檢測共分型50例，F(xiàn)-IF檢測輕鏈型淀粉樣變性腎病分型率為96.15%，P-IF的分型率為65.38%，IHC的分型率為69.23%。F-IF分型率高于P-IF、IHC分型率。系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病可以分為κ型和λ型，早期分型診斷對于指導臨床治療具有重要意義。有研究[11]顯

示，輕鏈型淀粉樣變性分型方法有很多種，其中較好的是F-IF檢測方法，與本研究結(jié)果基本一致。臨床實踐中，輕鏈型淀粉樣變性腎病分型檢測結(jié)果往往會受到多種因素影響，如標本的取材數(shù)量不夠，或者標本的儲藏條件不同，或者儲藏條件發(fā)生改變等，這些因素都可能導致檢測結(jié)果發(fā)生假陰性或者其他錯誤分型。P-IF和IHC是臨床上進行輕鏈型淀粉樣變性腎病分型診斷的重要輔助手段，但其分型結(jié)果容易受標本質(zhì)量等因素影響，出現(xiàn)陰性、雙陽性（無法分型）等無法分型的情況。IHC檢測需要采用甲醛固定，可能對抗原表位產(chǎn)生不良影響導致其被覆蓋，在檢測時需要進行抗原修復，使其表位再次顯露出來，操作較為煩瑣。本研究結(jié)果提示，臨床可優(yōu)先采用F-IF檢測方法對系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病進行分型診斷。目前，系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病的診斷分型尚存在許多問題需要解決，包括檢測顯示輕鏈型淀粉樣變性陰性、雙陽性（無法分型）等。有研究[12]顯示，使用常規(guī)免疫病理技術(shù)無法對系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病分型時，可以使用LMD/MS技術(shù)。本研究結(jié)果顯示，未分型患者共2例，經(jīng)LMD/MS分析均為λ型，提示LMD/MS技術(shù)可以對常規(guī)免疫病理技術(shù)無法分型的患者進行分型，了解輕鏈型淀粉樣變性腎病患者病理分型，改善患者的預后。淀粉樣變性腎病目前在臨床上已經(jīng)不是罕見的疾病，盡可能快速且準確地明確其分型并做出診斷，把握疾病的發(fā)展方向，指導臨床治療，改善患者預后，是臨床進行淀粉樣變性腎病干預治療、減緩疾病帶來的機體損傷和改善患者預后的關(guān)鍵。F-IF不能作為金標準來對輕鏈型淀粉樣變性腎病患者進行高準確率的分型，但是可以作為檢測輕鏈型淀粉樣變性腎病分型的重要輔助手段，指導臨床診斷和治療。

綜上所述，相較于P-IF和IHC，F(xiàn)-IF對于系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病的分型診斷較為準確，臨床可以優(yōu)先采用F-IF檢測方法對系統(tǒng)性輕鏈型淀粉樣變性腎病進行分型診斷;對于3種方法均無法分型的患者，可以采用LMD/MS技術(shù)進行分型，指導治療方案的制定，值得在臨床上推廣使用。

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（編輯：郭曉添）

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（下轉(zhuǎn)第110頁）

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（編輯：張興亞）