發(fā)酵乳桿菌GBJ 莢膜多糖結構、抗氧化及免疫活性研究

孫靖辰，高永嬌，潘禹溪，邰夢蝶，趙婧，王坤，王彥杰，鹿保鑫

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學與技術學院）

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外，常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，有的依附于微生物細胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖（Capsular polysaccharides，CPS）；有的進入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖（Slime-polysaccharides，SPS）[1-2]，它們都是微生物適應環(huán)境的產物。

莢膜對于細菌的生存具有重要的意義，因為細菌不僅可以利用莢膜抵御外界不良環(huán)境，還能保護自身不受白細胞吞噬[3]，同時還可有選擇性地黏附到特定細胞表面，從而表現出專一的攻擊能力。多糖作為莢膜的重要組成成分，在生理活性上起著至關重要的作用。目前已知鼠李糖乳桿菌GG（ATCC 53103）是一株著名的益生菌菌株，已被證明能產生莢膜多糖[4]。Yang 等[5]從傳統(tǒng)酸菜中成功分離出L.rhamnosus JAAS8，研究發(fā)現SPS 由相對摩爾比為4∶1∶1 的半乳糖、葡萄糖和N-乙酰葡萄糖胺組成，CPS 由相對摩爾比為5∶1 的半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺組成。然而，目前關于細菌CPS 的研究多集中于傷寒桿菌和肺炎球菌等致病菌，對于乳酸菌CPS 的研究較少，且大多以初級結構為主，對生理活性的研究更是少有報道，這十分不利于未來的開發(fā)和應用。多糖作為一類重要的活性物質，在抗氧化方面已顯示了誘人的前景。有研究表明乳酸菌CPS 具有清除ROS 的抗氧化作用，作用機理是多糖可以通過捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的ROS，從而阻斷或減緩脂質過氧化的進行，達到抗氧化的目的，而ROS 也可對體內細胞造成損害，迫使部分CPS 產生免疫原性，從而刺激機體產生免疫反應[6]。

近年來，由于巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中起著至關重要的作用，越來越多的研究學者致力于對具有巨噬細胞免疫調節(jié)活性的EPS 進行了研究和開發(fā)。因為它們是最早識別感染因子的細胞，對細胞介導的體液環(huán)境至關重要[7]。Deng 等[8]測定了EPS 對RAW264.7 細胞NO 和相關細胞因子產生的影響，結果表明EPS 對NO 分泌起到促進作用，進而可以顯著增強機體的抗免疫活性，這說明多糖可以作為一種安全有效的免疫調節(jié)物質，在保健和醫(yī)藥領域中具有廣泛的應用前景。對乳酸菌CPS 的結構和生物活性開展一定的研究，將有利于促進其未來的開發(fā)和應用。

基于此，對L.fermentum GBJ 的CPS 進行了提取，并對其初級結構以及體外抗氧化和免疫調節(jié)活性進行研究。希望為開發(fā)新型、安全、有效的乳酸菌益生產品提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

Lactobacillus fermentum GBJ（Genbank 登錄號：ON999190）：分離自貴州畢節(jié)家庭自制酸菜。HP 液體培養(yǎng)基：20 g 葡萄糖、5 g 檸檬酸三胺、20 g 大豆蛋白胨、6 g 酵母浸粉、0.05 g MnSO4、0.4 g MgSO4、0.07 g FeSO4、1 mL 吐溫-80 加熱溶解后定容于1 L 的去離子水中，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：小鼠巨噬細胞RAW264.7（中國科學院上海細胞庫）；DMEM 培養(yǎng)基（Biosharp 公司）；胎牛血清（美國Clark-Bioscience 公司）；細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α）試劑盒（上海朗頓生物技術有限公司）；其他所有試劑均為國產分析純。

主要儀器：LDZF-30KB 滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；GL-21M 高速冷凍離心機（上海湘儀生物技術有限公司）；ICS5000 離子色譜（美國Thermo 公司）。

1.3 L.fermentum GBJ CPS 的提取

參照Uemura 等[9]研究方法對CPS 進行提取。將甘油保藏的菌種二次活化后，以3%（v·v-1）的接種量轉接于HP 液體培養(yǎng)基中，33 ℃條件下培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液于10 000 rpm，4 ℃條件下離心10 min，收集菌體，用相對于發(fā)酵液一半體積10 mM 的磷酸鹽緩沖液（pH=6.7，4 ℃）清洗菌體，用原發(fā)酵液1/2 倍體積的10 mm 磷酸鹽緩沖液（pH=6.7，含20 μg·mL-1溶菌酶）將菌體混勻，并在37 ℃，140 rpm 條件下恒溫震蕩處理48 h。結束后在11 000 rpm，4 ℃條件下離心15 min，棄去沉淀。將上清液減壓濃縮后加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜。然后離心收集沉淀，去離子水溶解，經透析、凍干及Sevage 法除蛋白[10]得到CPS 樣品。

1.4 CPS 常規(guī)組成成分分析

CPS 樣品的中性糖、蛋白、硫酸基以及糖醛酸含量，分別采用硫酸苯酚法、考馬斯亮藍法、氯化鋇-明膠比濁法以及間羥基聯(lián)苯比濁法進行測定[3]。

1.5 單糖組成分析

稱取適量多糖樣品，采用2 M 三氟乙酸溶液121 ℃處理2 h，然后通入氮氣吹干，重復使用甲醇清洗2～3次，最后加入無菌水溶解待測。采用Thermo ICS5000 離子色譜系統(tǒng)對單糖組成進行分析，色譜柱為DionexTMCarboPacTMPA20（150×3.0 mm，10 μm）；流動相A（H2O），流動相B（0.1 M NaOH），流動相C（0.1 M NaOH，0.2 M NaAc）；洗脫梯度：0 min A 相/B相/C 相（95∶5∶0，V·V-1），26 min A 相/B 相/C 相（85∶5∶10，V·V-1），42 min A 相/B 相/C 相（85∶5∶10，V·V-1），42.1 min A 相/B 相/C 相（60：0：40，V·V-1），52 min A 相/B 相/C相（60∶40∶0，V·V-1），52.1 min A 相/B 相/C 相（95∶5∶0，V·V-1），60 min A 相/B 相/C 相（95∶5∶0，V·V-1）；進樣量為5 μL；流速0.5 mL·min-1；柱溫為30 ℃。采用單糖標準品對樣品的單糖組成進行定性和定量分析。

1.6 紅外光譜分析

稱取1.3 中CPS 樣品1 mg，以1∶100 比例與KBr粉末充分混合，經研缽充分研磨后在紅外壓片機上制成透明薄片，進行壓片處理，采用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內進行譜圖掃描。

1.7 L.fermentum GBJ CPS 體外抗氧化活性分析

按照Liu 等[11]和Xiao 等[12]研究方法，測定CPS 的DPPH、羥基、ABTS+自由基清除活性。以抗壞血酸（Vc）作為陽性對照。

1.8 RAW 264.7 細胞免疫分析

1.8.1 RAW 264.7 細胞的培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞系RAW264.7 于含10%胎牛血清和1%雙抗（青/鏈霉素）的DMEM 完全培養(yǎng)基中生長，細胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時進行傳代，將培養(yǎng)至對數生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.8.2 細胞活力的檢測

采用MTT 法檢測細胞活性[13]。取對數生長期的RAW264.7 細胞，并調整最終濃度約2×105細胞·mL-1的密度，接種于96 孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁。然后取出培養(yǎng)板，吸去舊培養(yǎng)基，設置不接種細胞的空白組，對照組加入100 μL DMEM 完全培養(yǎng)液，樣品組依次加入31.25、62.5、125、250、500 μg·mL-1樣品溶液各100 μL，每組設置4 個重復。孵育24 h 后，加入100 μL MTT（1 mg·mL-1）工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT 工作液，加入100 μL DMSO 輕微震蕩以溶解結晶，室溫條件下放置10 min，用酶標儀在570 nm 波長處測定吸光度。細胞活力計算公式如下：

1.8.3 中性紅法檢測細胞吞噬能力

根據You 等[7]研究方法，采用中性紅法測定細胞吞噬活性。將RAW264.7 細胞以2×105細胞·mL-1的密度接種于96 孔板中過夜培養(yǎng)，吸去上清液，設置空白組、陽性對照組和樣品組，其中空白組加入100 μL PBS 緩沖液，對照組加入100 μL DMEM 完全培養(yǎng)液，陽性對照組加入100 μL 1 μg·mL-1的LPS，并基于1.8.2 的試驗結果設置無細胞毒性的4個濃度梯度（31.25、62.5、125、250 μg·mL-1，100 μL）的樣品組。培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL體積分數為0.1%中性紅溶液染色，靜置30 min 后棄除，PBS 洗滌3 次，每孔加入100 μL 醇酸裂解液（乙醇和冰乙酸等體積混合），室溫靜置2 h，測定540 nm波長處的吸光度，中性紅吞噬率計算公式如下：

1.8.4 細胞因子分泌水平測定

細胞按2×105細胞·mL-1的密度接種于96 孔板中過夜培養(yǎng)，然后依照組別加樣預孵12 h，取100 μL培養(yǎng)基上清液，根據試劑盒說明檢測培養(yǎng)液中細胞白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。

1.9 數據分析

采用SPSS 20.0 對數據進行統(tǒng)計分析。采用Duncan’s ANONA 進行多重比較，不同處理之間P＜0.05 表明差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)組成成分分析

經測定，通過提取獲得的L.fermentum GBJ CPS的產量為124.37 mg·L-1?；窘M成成分分析表明，CPS 的中性糖含量為92.54%，蛋白含量為3.06%，表明多糖中可能存在糖蛋白結構[14]。CPS 中硫酸基含量為1.04%，但未檢測到糖醛酸。

2.2 單糖組成分析

標準單糖的離子色譜分析結果如圖1（A）所示，所有的單糖均被較好的分離，保留時間從小到大依次為巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸。CPS 的單糖組成色譜分析圖如圖1（B）所示，可知CPS 主要由半乳糖和葡萄糖兩種單糖組成，其摩爾比為3.64∶1.00。Li 等[15]發(fā)現L.helveti-cus MB2-1 的CPS 主要由摩爾比為1.33∶2.75∶1.00 的半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，而Yang 等[5]對L.rhamnosus JAAS8 的CPS 進行測定發(fā)現，CPS 由相對摩爾比為5∶1 的半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺的組成。這表明不同乳酸菌菌株產生的CPS 單糖組成有所差異，這可能是由于菌株特異性導致的[16]。

圖1 標準單糖A 及CPS 單糖組成B 的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatogram of monosaccharide standard A and CPS monosaccharide composition B

2.3 紅外光譜分析

CPS 在400～4 000 cm-1范圍內的紅外光譜如圖2 所示，CPS 具有多糖的典型特征吸收峰。CPS 在3 295.23 cm-1處存在寬而強的吸收峰，這是由O-H鍵伸縮震動導致[17]；2 893.07 cm-1處的吸收峰可能是由多糖中C-H 和C-O 基團的伸縮震動導致[17]，也可能與樣品中存在蛋白有關；1 639.62 cm-1和1 562.75 cm-1處存在的微弱吸收峰可能是C=O 和N-H 伸縮振動造成，這是由于樣品中含有的少量蛋白所致[18]；1 370.68 cm-1處的吸收峰可能是由來自于多糖或蛋白中的-CH3基團伸縮振動造成[19]；在1 255.15 cm-1處出現的吸收峰歸因于S=O 的震動，表明多糖中存在硫酸基，這些均與基本組成成分的分析結果一致[14]；而在895.66 cm-1的吸收峰則表明樣品中可能含有β-糖苷鍵。

2.4 體外抗氧化活性分析

CPS 清除DPPH、羥基及ABTS+自由基活性大小如圖3（A-C）所示，可以看出CPS 及Vc 在0.25～4.0 mg·mL-1濃度范圍內對各自由基的清除率呈現劑量效應關系。在濃度為0.25 mg·mL-1時，CPS 對DPPH、羥基及ABTS+自由基的清除率分別為57.62%、39.79%和47.82%；當濃度為4 mg·mL-1時，CPS 對各自由基的清除率分別可達80.61%、86.24%和97.41%，其中ABTS+自由基清除率最高，接近于同濃度Vc 的ABTS+自由基清除率（98.33%）。以上結果表明，發(fā)酵乳桿菌GBJ 的CPS 具有較高的自由基清除活性，能夠有效地避免自由基對機體的氧化損傷。L.fermentum GBJ CPS 的DPPH 自由基活性略低于L.fermentum S1 的CPS，但高于L.plantarum YW32 的EPS，可能與其中性糖含量的高低有關[3，20]。良好的DPPH 自由基清除活性也說明L.fermentum GBJ 的CPS 可能是良好的氫或電子供體[21]。而較高的羥自由基清除活性，可能與其存在一定的硫酸基有關。此外，多糖的ABTS+自由基清除能力較高可能是其自由基由活性狀態(tài)轉化為穩(wěn)定狀態(tài)，并通過向自由基提供電子來終止自由基鏈式反應[22]，蛋白質含量也是影響CPS 的ABTS+自由基清除活性的重要因素[23]。

圖3 CPS 清除DPPH A、羥基B 和ABTS+自由基的活性CFig.3 DPPH A，hydroxyl B and ABTS+free radical scavenging activities C of CPS

2.5 免疫調節(jié)活性

2.5.1 CPS 對細胞活力的影響

如圖4（A）所示，與對照組相比，低濃度（31.25和62.5 μg·mL-1）的CPS 對RAW264.7 細胞活力無明顯影響（P＞0.05），125 和250 μg·mL-1的CPS 對細胞活力可產生顯著的促進作用（P＜0.05），并在250 μg·mL-1時細胞的存活率達到最大值124.25%，而隨著濃度的進一步提升，這種促進作用發(fā)生明顯下降（P＜0.05），500 μg·mL-1CPS 處理RAW264.7 細胞的細胞活力與對照組相比已無明顯差異（P＞0.05），這可能是因為過高濃度CPS 開始對巨噬細胞產生一定的毒性作用，從而導致細胞活力促進作用下降，甚至產生抑制作用[24]。綜合考慮細胞增殖效果及節(jié)約樣品，研究選擇31.25、62.5、125 和250 μg·mL-1這4 個濃度梯度評價CPS 對RAW264.7 細胞的免疫調節(jié)作用。

2.5.2 CPS 對細胞吞噬作用的影響

如圖4（B）所示，與空白組相比，LPS 顯著增強了RAW264.7 細胞對中性紅的吞噬性能（P＜0.05），經刺激后的吞噬率可達對照組的206.90%。CPS 對RAW264.7 細胞中性紅吞噬性能的影響，隨濃度的上升呈現先上升后下降的趨勢，但均明顯高于對照組（P＜0.05），并在125 μg·mL-1時達到最高值，為對照組的168.97%。這一結果與You 等[7]和Tian 等[13]的研究結果相似，前者發(fā)現戊糖乳桿菌LZ-R-17 EPS 能顯著改善巨噬細胞的吞噬能力，后者從蟬擬青霉TJJ1213 的菌絲體中獲得的兩個胞內多糖組分也具有激活RAW264.7 細胞吞噬活性的能力。上述結果表明，CPS 可以通過增強RAW264.7 細胞吞噬活性，達到提高機體免疫力的作用。

2.5.3 CPS 對細胞分泌細胞因子的影響

如圖4（C-F）所示，與對照組相比，LPS 組RAW264.7 IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 分泌水平顯著上升（P＜0.05）。對于樣品組，62.5 μg·mL-1的CPS可使小鼠巨噬細胞RAW264.7IL-1β 的分泌量提高近2 倍，125 和250 μg·mL-1的CPS 可分別顯著提高RAW264.7 細胞IL-6 和IL-10 分泌水平（P＜0.05），而CPS 對RAW264.7 細胞的TNF-α 分泌水平則無明顯作用（P＞0.05）。這些結果表明，適當濃度的CPS 可增強巨噬細胞IL-1β、IL-6 和IL-10 三種細胞因子的分泌水平，表明CPS 具有一定的免疫增強潛力。You等[7]研究表明，50～200 μg·mL-1范圍內的戊糖乳桿菌LZ-R-17 EPS 可顯著提高RAW264.7 細胞TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量，而在50～400 μg·mL-1范圍內能顯著提高IL-10 的含量。Tian 等[13]通過檢測三種典型的細胞因子來揭示蟬擬青霉TJJ1213 胞內多糖IPS2對巨噬細胞的免疫調節(jié)活性，發(fā)現200 μg·mL-1的IPS2 可顯著提高RAW264.7 細胞IL-6 及IL-1β 水平，同時IPS2 還可以通過劑量依賴的方式增強TNF-α 的分泌。不同來源多糖對巨噬細胞細胞因子分泌水平影響不同，這種差異可能與其單糖組成及分子量等因素有關[7]。

3 討論

多糖是由重復的單糖通過糖苷鍵連接形成的聚合物，由于單糖組成和連接方式不同，導致CPS 結構解析存在巨大的挑戰(zhàn)，而試驗對CPS 基本結構的研究，為其今后在功能性食品的應用奠定了基礎，同時對結構的深度解析也會成為未來研究的一個重點。近年來，科研人員根據CPS 的抗原性異同在研制多糖疫苗方面有了新的思考，但主要是針對細菌CPS進行研究，雖然目前對乳酸菌胞外多糖的結構及生理活性的研究已經取得了一定的成果，但對其具體提高機體抗腫瘤和免疫能力方面的研究還存在明顯的不足[25]。劉雯雯等[26]在研究植物乳桿菌-12 的抗氧化試驗中發(fā)現，DPPH 清除率與EPS 濃度呈依賴關系，當濃度為0.5 mg·mL-1時，DPPH 清除率能達到49.13%，而李偉欣等[27]研究了一種雙歧桿菌代謝產生的EPS 在低劑量下能誘導小鼠脾淋巴細胞增殖，可以看出目前的研究多集中在EPS 對其抗氧化、免疫活性以及其他生理活性的研究中，對CPS 的研究較為淺顯，這也客觀地反映了今后研究的發(fā)展方向。

4 結論

研究對L.fermentum GBJ 的CPS 結構和生物活性進行了初步研究。發(fā)現CPS 不僅具有較強的DPPH、ABTS+以及羥基自由基的清除活性，還能通過提高RAW264.7 細胞的吞噬能力和免疫因子釋放，進而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。因此，L.fermentum GBJ CPS可以作為一種新型的功能性輔料應用于食品或藥品領域。