環(huán)狀RNA調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥的研究進(jìn)展*

陳小英，柯瑤，劉夏，蘇宇婷，王聰，尹富強(qiáng)

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.生命科學(xué)研究院與區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)第3大惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年我國預(yù)計(jì)有57 090例卵巢癌新發(fā)病例和39 306例卵巢癌死亡病例，病死率在女性腫瘤中穩(wěn)居第5位[1]。以鉑類和紫杉烷類為主的化療是卵巢癌術(shù)后治療的主要手段，但多數(shù)晚期患者會(huì)不同程度地對化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和死亡[2]。卵巢癌化療耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，至少包括編碼基因和非編碼RNA調(diào)控及腫瘤微環(huán)境變化，涉及多藥耐藥、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、細(xì)胞周期、凋亡、自噬和異常信號(hào)通路等[3-4]。因此，調(diào)控卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究一直是基礎(chǔ)和臨床研究中的重點(diǎn)問題，并在卵巢癌治療及耐藥方面取得了一定進(jìn)展，但至今仍未找到非常有效的途徑以提高卵巢癌患者的生存率。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由信使RNA前體通過可變剪接形成的一類不具有5′-末端帽子和3′-末端poly（A）尾巴的單鏈共價(jià)閉合非編碼RNA，不易被核糖核酸酶降解，在多種腫瘤中顯著差異表達(dá)，可作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）、與功能蛋白互作、翻譯成多肽和蛋白質(zhì)等方式影響卵巢癌及其他腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，正迅速成為癌癥的潛在早期分子診斷標(biāo)志物和耐藥治療靶點(diǎn)[5]。因此，本文對已報(bào)道與卵巢癌及其耐藥調(diào)控相關(guān)的62個(gè)circRNAs進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，其中45個(gè)為腫瘤驅(qū)動(dòng)因子，17個(gè)為腫瘤抑制因子，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮癌基因作用；15個(gè)與順鉑和紫杉烷類化療耐藥顯著相關(guān)，9個(gè)存在于體液中具有高效診斷價(jià)值，24個(gè)與預(yù)后相關(guān)，主要影響卵巢癌細(xì)胞的凋亡、EMT、細(xì)胞周期和自噬等過程；梳理并探討了circRNA調(diào)控卵巢癌及其耐藥的分子機(jī)制，以期為后續(xù)circRNA與卵巢癌及其耐藥治療的相關(guān)研究提供新思路。

1 circRNA的形成和功能機(jī)制

本文首先系統(tǒng)地對circRNA的形成和功能機(jī)制進(jìn)行了梳理（見圖1）。circRNA根據(jù)序列來源分為外顯子circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、內(nèi)含子circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）及外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA），其中ecircRNA包括單外顯子circRNA和多外顯子circRNA。與線性RNA相比，circRNA以外顯子來源為主，通常定位于細(xì)胞質(zhì)中，而內(nèi)含子和外顯子-內(nèi)含子來源的circRNA通常定位于細(xì)胞核，且可定位于外泌體中，種類多，表達(dá)豐富，序列高度保守[5]。

圖1 circRNA的形成機(jī)制和功能機(jī)制

1.1 circRNA形成機(jī)制

①內(nèi)含子配對驅(qū)動(dòng)環(huán)化：外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子反向互補(bǔ)配對后可變剪接形成ecircRNA或EIciRNA（見圖1A）；②套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化：外顯子跳躍使被跨越的區(qū)域形成環(huán)形RNA中間體，再通過套索剪接形成ecircRNA或EIciRNA（見圖1B）；③RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs）驅(qū)動(dòng)環(huán)化：RNA結(jié)合蛋白的外顯子側(cè)翼與內(nèi)含子緊密結(jié)合，可變剪接形成ecircRNA或EIciRNA（見圖1C）；④依賴剪接體兩側(cè)保守序列的內(nèi)含子套索環(huán)化：保守序列由接近5′剪接位點(diǎn)富含7 nt-GU的元件和接近3′分支位點(diǎn)富含11 nt-C的元件構(gòu)成，該位點(diǎn)通過脫支酶避免內(nèi)含子套索物降解，形成ciRNA（見圖1D）[6]。上述4種形成機(jī)制來源的circRNA中，內(nèi)含子配對和套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的circRNA是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

1.2 circRNA功能機(jī)制

①充當(dāng)ceRNA，具有微小RNA（microRNA，miRNA）反應(yīng)元件（miRNA response elements，MREs）（見圖1F）；②與功能蛋白質(zhì)相互作用，形成RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物（見圖1H）；③調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，ciRNA/ecircRNA結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol Ⅱ）/U1小核核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoproteins，U1 snRNP）（見圖1E）；④翻譯成多肽和蛋白質(zhì)，翻譯機(jī)制可歸類為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）依賴性或非依賴性，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）可充當(dāng)IRES（見圖1G）[5，7]。上述4大功能機(jī)制中，circRNA充當(dāng)ceRNA是當(dāng)前研究最多且最易在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用的功能機(jī)制。

2 circRNA 調(diào)控卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展

基于對以往62個(gè)與卵巢癌調(diào)控相關(guān)的circRNAs系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)circRNA在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮癌基因作用，主要通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、EMT、細(xì)胞周期和自噬等方式影響卵巢癌增殖、遷移、侵襲和耐藥等惡性生物學(xué)行為，最終導(dǎo)致不良預(yù)后，且少數(shù)存在于外泌體、血清和血漿中的circRNA具有高效的卵巢癌早期診斷價(jià)值。

在本文綜述的62個(gè)circRNAs中[8-37，39-46]（見圖2），circ_0078607[8]、circ_0015326[9]和circ-PGAM1[10]等29個(gè)circRNAs通過調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)揮其生物學(xué)功能，circ_0000554[11]、circ-LNPEP[12]和circ-FGFR3[13]等15個(gè)circRNAs則通過調(diào)控EMT影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，circ-CELSR1[14]和circ-ATL2[15]等6個(gè)circRNAs可調(diào)控細(xì)胞周期，僅有circ-MUC16[16]和circ-RAB11FIP1[17]與卵巢癌自噬調(diào)控相關(guān)，且circ-HIPK2[18]、circ-NRIP1[19]和circ_0006404[20]等15個(gè)circRNAs與卵巢癌順鉑和紫杉烷類化療耐藥相關(guān)；此外，存在于外泌體中的circ-WHSC1[21]和circ-PUM1[22]等5個(gè)circRNAs和血清中的circ-ITGB6[23]和circ-MUC16[16]等3個(gè)circRNAs以及血漿中的circ-N4BP2L2[24]經(jīng)受試者工作特征曲線分析發(fā)現(xiàn)，其均具有高度的診斷敏感性和特異性；24個(gè)circRNAs可作為卵巢癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，其中circularRNAS-7[25]和circ-UBAP2[26]等20個(gè)circRNAs與總體生存期（overall survival，OS）顯著相關(guān)，circ-PVT1[27]和circ-SETDB1[28]等5個(gè)circRNAs與無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）顯著相關(guān)，circ-FBXO7[29]和circ-PTK2[30]等5個(gè)circRNAs與無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）顯著相關(guān)，circ-Foxp1[31]與OS、RFS 和無病生存期（disease-free survival，DFS）顯著相關(guān)。

圖2 62個(gè)circRNAs在卵巢癌和耐藥卵巢癌中的作用機(jī)制

3 circRNA調(diào)控卵巢癌化療耐藥

3.1 circRNA調(diào)控卵巢癌順鉑耐藥

順鉑是卵巢癌最有效的化療藥物之一，但耐藥性很常見。本文中有6個(gè)circRNAs作為癌基因或抑癌基因參與調(diào)控卵巢癌順鉑耐藥，且有望成為卵巢癌順鉑耐藥的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物（見圖2）。circ-HIPK2[18]、circ-LPAR3[32]、circ-PBX3[33]、circ-Foxp1[31]和circ-ITGB6[23]均在卵巢癌順鉑耐藥組織和/或細(xì)胞中高表達(dá)。敲低circ-HIPK2、circ-LPAR3可干擾相應(yīng)的ceRNA調(diào)控軸，進(jìn)而抑制卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力及細(xì)胞周期和糖酵解進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而circ-PBX3和circ-ITGB6可直接通過與功能蛋白結(jié)合促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥，其中circ-ITGB6在順鉑耐藥的卵巢癌患者血清中顯著上調(diào)表達(dá)并與OS和RFS呈負(fù)相關(guān)；另外circ-Foxp1可通過作為活性蛋白和RNA載體的外泌體分泌到腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥，且與卵巢癌患者的OS、RFS和DFS不良預(yù)后相關(guān)。與上述不同的是，circRNA Cdr1as是卵巢癌順鉑耐藥的抑制因子，在順鉑耐藥患者的血清外泌體、組織和細(xì)胞中低表達(dá)，體外過表達(dá)Cdr1as能顯著抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且通過調(diào)控miR-1270/SCAI分子信號(hào)軸提高卵巢癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性[34]。

3.2 circRNA調(diào)控卵巢癌紫杉醇耐藥

紫杉醇是一種長期應(yīng)用于卵巢癌臨床治療的一線化療藥物，患者對其產(chǎn)生耐藥性仍是卵巢癌治療失敗的主要原因之一。本文中有7個(gè)circRNAs有望成為克服卵巢癌紫杉醇耐藥性的潛在靶標(biāo)（見圖2）。circ-NRIP1[19]、circ-CELSR1[14]、circ-ATL2[15]、circ_0000714[35]和circ-TNPO3[36]在卵巢癌紫杉醇耐藥組織和細(xì)胞中高表達(dá)，其中circ-TNPO3預(yù)警OS不良預(yù)后，干擾circRNAs表達(dá)可抑制細(xì)胞活力、克隆形成、遷移和侵襲能力，阻滯細(xì)胞周期G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞對紫杉醇的敏感性；而血清中的circ-SETDB1[28]在鉑-紫杉烷聯(lián)合化療耐藥和復(fù)發(fā)的高級別漿液性卵巢癌中顯著上調(diào)表達(dá)，且其可有效診斷高級別漿液性卵巢癌和正常卵巢[受試者工作特征曲線下面積為（0.803±0.040）]、原發(fā)性化療耐藥和原發(fā)性化療敏感的高級別漿液性卵巢癌[受試者工作特征曲線下面積為（0.811±0.064）]，并與PFS呈負(fù)相關(guān)，是一種新型的生物標(biāo)志物。此外，circ-EXOC6B可作為腫瘤抑制因子，介導(dǎo)miR-376c-3p/FOXO3軸提高體內(nèi)外卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，且其高表達(dá)與OS良性預(yù)后相關(guān)[37]。

3.3 circRNA調(diào)控卵巢癌多西紫杉醇耐藥

多西紫杉醇是卵巢癌治療的紫杉烷類化療藥物之一，其耐藥機(jī)制與ABC超家族多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)（如P-glycoprotein，P-gp/ABCB1）和抑制細(xì)胞凋亡等相關(guān)[38]。研究報(bào)道，circ_0000735[20]和circ_0006404[20]均通過調(diào)控P-gp表達(dá)影響卵巢癌對多西紫杉醇的敏感性，其中circ_0000735在卵巢癌多西紫杉醇耐藥細(xì)胞系中上調(diào)表達(dá)，降低其表達(dá)水平可促進(jìn)miR-546b和DKK4表達(dá)、抑制P-gp表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高和增殖能力下降；而circ_0006404則在耐藥細(xì)胞系中低表達(dá)，干擾其表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)其介導(dǎo)miR-346/DKK3/P-gp軸參與卵巢癌多西紫杉醇耐藥（見圖2）。

4 circRNA調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥的分子機(jī)制

4.1 circRNA調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥的主要分子機(jī)制

ceRNA包括長鏈非編碼RNA、circRNA、偽基因和mRNA等，通過與miRNA競爭結(jié)合靶基因mRNA上的MREs發(fā)揮“miRNA海綿”作用，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。本文綜述的62個(gè)circRNAs中，除circ-NOLC1[39]、circ-ATRNL1[40]、circ-N4BP2L2[24]、circ-PBX3[33]和circ-ITGB6[23]外，其余circRNAs均通過ceRNA機(jī)制調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥進(jìn)展。

circ-UBAP2[26，41]、circ-KRT7[42]和circ-FGFR3[13]等作為ceRNA調(diào)控EMT、細(xì)胞周期和凋亡等，加劇卵巢癌細(xì)胞的惡性發(fā)展，其中circ-UBAP2充當(dāng)miR-382-5p或miR-144的ceRNA，上調(diào)PRPF8或CDH2的表達(dá)，其高表達(dá)與卵巢癌患者TMN分期和5年生存率呈負(fù)相關(guān)，而circ-KRT7和circ-FGFR3是miR-29a-3p的海綿分子，且circ-FGFR3高表達(dá)與卵巢癌患者的低生存率和高復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。此外，與卵巢癌化療耐藥相關(guān)的15個(gè)circRNAs中大部分依賴于ceRNA機(jī)制響應(yīng)卵巢癌耐藥，如circ_0000735[20]和circ_0006404[20]均通過ceRNA機(jī)制調(diào)控P-gp蛋白表達(dá)影響卵巢癌多西紫杉醇耐藥。

4.2 circRNA與功能蛋白互作調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥

circRNA除了充當(dāng)miRNA海綿分子外，還可與功能蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮其“支架”作用。本文綜述的62個(gè)circRNAs中，有5個(gè)circRNAs與功能蛋白互作參與調(diào)控卵巢癌及其化療耐藥的進(jìn)程（見圖2）。在上皮性卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)的circ-MUC16[16]和circ-RAB11FIP1[17]分別與自噬相關(guān)蛋白ATG13和DSC1蛋白直接結(jié)合，增加卵巢癌細(xì)胞中的自噬通量，進(jìn)而加劇癌細(xì)胞增殖和侵襲；另外有研究報(bào)道，circ-NOLC1[39]可能通過結(jié)合ESRP1調(diào)節(jié)CDK1和RhoA表達(dá)，加劇上皮性卵巢癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。而在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，circ-PBX3[33]和circ-ITGB6[23]分別通過與RNA結(jié)合蛋白IGF2BP2相互作用，提高ATP7A mRNA和FGF9 mRNA的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性。

4.3 circRNA翻譯成多肽和蛋白質(zhì)調(diào)控卵巢癌

目前研究發(fā)現(xiàn)，具有開放閱讀框（open reading frame，ORF）的circRNA可以翻譯成致癌或抑制腫瘤活性的功能多肽和蛋白質(zhì)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。在該文綜述的62個(gè)circRNAs中（見圖2），僅有1篇文獻(xiàn)報(bào)道circRNA的翻譯功能與卵巢癌調(diào)控相關(guān)。circ-ATRNL1[40]主要定位于卵巢癌細(xì)胞質(zhì)中，過表達(dá)circ-ATRNL1可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，同時(shí)進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，circ-ATRNL1包含1個(gè)編碼131aa蛋白的IRES與1個(gè)ORF重疊啟動(dòng)翻譯，提示circ-ATRNL1可能通過編碼131aa蛋白發(fā)揮抑癌作用；不足的是，該研究尚未進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和卵巢癌臨床大樣本評估131aa蛋白的抑癌作用。

5 circRNA調(diào)控卵巢癌進(jìn)展的通路分析

為進(jìn)一步從整體上了解circRNA調(diào)控卵巢癌進(jìn)展的分子機(jī)制，該文對62個(gè)circRNAs中的54個(gè)靶基因（40個(gè)靶基因由作為腫瘤驅(qū)動(dòng)因子circRNA所調(diào)控，而另外14個(gè)靶基因由作為腫瘤抑制因子circRNA所調(diào)控）進(jìn)行了通路分析，共富集到106條通路（Q＜0.05），聚類為5大類功能（即C1～C5）（見圖3），其中C1和C3都是實(shí)體瘤相關(guān)的信號(hào)通路，包括膀胱癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌和腎細(xì)胞癌等；C2包括有絲分裂原活化蛋白激酶等癌基因通路，C4為細(xì)胞自噬通路，C5包括癌癥中程序性細(xì)胞死亡配體-1的表達(dá)及程序性細(xì)胞死亡受體-1檢查點(diǎn)等免疫調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路；此外，其他信號(hào)通路中還包含鐵死亡等信號(hào)通路。上述結(jié)果提示circRNA可能主要通過調(diào)控上述信號(hào)通路特別是細(xì)胞自噬通路調(diào)控卵巢癌進(jìn)展。

圖3 通過KOBAS數(shù)據(jù)庫對54個(gè)circRNAs靶基因進(jìn)行通路富集和功能聚類分析

細(xì)胞自噬是指細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器被具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹后進(jìn)入溶酶體降解循環(huán)的過程，這種保守的細(xì)胞自我消化機(jī)制，對于機(jī)體發(fā)育和緩解多種環(huán)境壓力至關(guān)重要。研究表明，自噬是一把雙刃劍，抑制或促進(jìn)自噬均可影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和耐藥[47]。和上述通路富集結(jié)果相一致的是，在所綜述的62個(gè)circRNAs中，circ-MUC16[16]和circ-RAB11FIP1[17]均通過與自噬相關(guān)蛋白結(jié)合或充當(dāng)miRNA分子海綿促進(jìn)自噬，進(jìn)而加劇卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲等惡性行為。值得關(guān)注的是，經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，circRNA通過介導(dǎo)自噬調(diào)控腫瘤的相關(guān)研究有限，其中調(diào)控卵巢癌的研究極少（3篇左右）。本文綜述的5個(gè)circRNAs（circ-VPS13C[43]、circ-MUC16[16]、circ-RAB11FIP1[17]、circ_0007444[44]和circ-9119[45]）的靶基因（ERK、Beclin-1、ATG7、ATG14、PTEN）又主要富集在自噬通路上。因此，自噬很可能成為circRNA調(diào)控卵巢癌及其他腫瘤進(jìn)展的重要信號(hào)通路，值得進(jìn)一步關(guān)注和深入研究。

6 總結(jié)與展望

本文系統(tǒng)綜述了62個(gè)circRNAs在卵巢癌及其化療耐藥中的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)circRNA主要基于ceRNA網(wǎng)絡(luò)和與功能蛋白互作參與卵巢癌及其耐藥調(diào)控，并主要與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和周期相關(guān)，且通路富集結(jié)果表明可能和細(xì)胞自噬及鐵死亡通路相關(guān)，但是否通過調(diào)控細(xì)胞自噬等信號(hào)通路影響卵巢癌耐藥知之甚少，提示基于這些通路的circRNA研究有待深入探索。此外，circRNA調(diào)控卵巢癌順鉑和紫杉烷類化療耐藥的研究仍處于初級階段，大部分研究僅限于細(xì)胞耐藥功能研究，未針對化療藥物特有的耐藥機(jī)制（如DNA損傷修復(fù)、微管-蛋白質(zhì)相互作用、ABC超家族多藥外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和自噬等）深入研究；同時(shí)尚未有研究報(bào)道circRNA參與調(diào)控卵巢癌卡鉑耐藥，因此，circRNA在卵巢癌耐藥調(diào)控中的作用仍需進(jìn)一步研究，且其是否參與卵巢癌卡鉑耐藥是卵巢癌化療耐藥調(diào)控值得揭示的科學(xué)問題。在診斷和預(yù)后標(biāo)志物方面，部分circRNA與卵巢癌患者預(yù)后顯著相關(guān)，且有限的研究表明體液中的circRNA具有更高效的診斷敏感性和特異性，提示體液circRNA在標(biāo)志物和臨床應(yīng)用方面更具研究價(jià)值。

綜上所述，circRNA在卵巢癌及其耐藥調(diào)控方面取得了較大的進(jìn)展，在卵巢癌診斷、治療和預(yù)后方面均顯示出越來越多的非凡潛力，值得進(jìn)行全面而深入的探討，以進(jìn)一步提高婦女健康水平，服務(wù)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展。