氧化苦參堿減輕糖尿病腎病小鼠腎組織炎癥及纖維化反應的機制研究*

代云莉，彭燦，梁丹，李志陽，馮昭衛(wèi)，王一凡，馮莉，陳佳佳，陳圣杰，肖瑛

（1.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.寧波市臨床病理診斷中心，浙江 寧波 315021；3.貴陽市第二人民醫(yī)院 科研管理科，貴州 貴陽 550023）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常見微血管并發(fā)癥[1]。近年來DKD被認為是一種慢性低度炎癥性和自然免疫性疾病[2]。Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）和含NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（Nod-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體作為病原模式識別受體在免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[3-4]。有研究報道，糖尿病大鼠腎組織TLR4表達明顯增多，伴隨炎癥因子的表達和細胞外基質(zhì)的沉積，促進DKD的進展[5]。課題組前期研究表明糖尿病大鼠腎組織TLR4表達增多，促進了炎癥因子的表達和細胞外基質(zhì)的沉積[6]。有實驗研究表明在糖尿病腎損傷及脂代謝異常中NLRP3介導的炎癥反應發(fā)揮著重要作用[7-10]，NLRP3炎癥小體可通過誘導白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的分泌，將糖尿病腎臟中的代謝應激與促炎級聯(lián)反應的激活聯(lián)系起來[11]，同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（homeodomain interacting protein kinase 2，HIPK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，為腎纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。研究表明HIPK2不僅可以介導促纖維化通路，還可以介導炎癥反應，在腎間質(zhì)損傷及腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用[13]。但在DKD中，HIPK2與TLR4信號及NLRP3炎癥小體活化的相互作用未見報道。

氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是一種從苦參根部分離的喹唑啉生物堿，具有抗炎癥、抗纖維化、抗腫瘤活性，抑制iNOS表達和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad通路。其可用于治療病毒性肝炎、癌癥、病毒性心肌炎、胃腸出血和皮膚疾病[14-16]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，OMT可下調(diào)糖尿病大鼠腎組織TLR4的表達，抑制炎癥因子的表達和細胞外基質(zhì)的沉積，延緩DN進展[6]。為進一步探究OMT對糖尿病腎病的保護作用及其可能機制，本研究通過觀察糖尿病小鼠中腎組織TLR4、HIPK2和NLRP3的表達情況，以及給予OMT治療后小鼠腎組織TLR4、HIPK2、NLRP3、纖維連接蛋白（Fibronectin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）及炎癥信號因子的表達變化，初步探討OMT對糖尿病腎病的保護作用及其可能機制，為尋找新的抗炎抗纖維化藥物提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康6周齡、SPF級db/db小鼠20只和同月齡同背景非轉(zhuǎn)基因db/m小鼠10只，體重分別為（40±5）g、（20±20）g，雌雄不限，由南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2015-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-001]，本實驗符合貴州醫(yī)科大學動物論理審查委員會操作規(guī)范。

1.1.2 藥物與試劑 OMT購自南京廣潤生物制品有限公司，免疫組織化學SP兩步法檢測試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，血糖儀及血糖試紙購自美國強生制藥有限公司，TRIzol? Reagent購自美國Thermo Fisher Scientific公司，RIPA強裂解液和一抗稀釋液購自蘇州碧云天生物有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒、BSA以及Tween-20購自北京索萊寶生物有限公司，蛋白酶磷酸酶抑制劑、30%丙烯酰胺、SDS、TEMED、APS、甘氨酸、DTT、Tris-堿、DGlucose、PMSF購自北京索萊寶生物有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購自常州天地人和生物科技有限公司，脫脂奶粉購自內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，RevertAIdTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit以及總RNA提取試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，2×SuperReal PreMix Plus購自北京天根生物化學科技有限公司，小鼠抗HIPK2單克隆抗體購自美國Santa公司，小鼠抗TLR4單克隆抗體、兔抗Fibronetin多克隆抗體、小鼠抗E-cadherin單克隆抗體購自美國CST公司，小鼠抗β-actin抗體購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司，Goat Anti-rabbit IgG/HRP、Goat Anti-Mouse IgG/HRP購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢Elabscience公司。全自動生化分析儀購自德國Bayer公司，高速低溫離心機購自美國Beckman公司，電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置購自北京六一公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型復制及分組 小鼠均給予無菌飼料適應性喂養(yǎng)2周，自由飲純凈水，將db/db小鼠隨機分為糖尿病組（DM組）、氧化苦參堿治療組（OMT組），各10只；并設(shè)同月齡同背景非轉(zhuǎn)基因db/m小鼠為對照組（NC組）。OMT組小鼠予以腹腔注射生理鹽水溶解的氧化苦參堿120 mg/（kg·d）[14]，給藥8周后處死小鼠。

1.2.2 標本收集 處死小鼠前采集并記錄小鼠24 h尿液，空腹6 h后乙醚麻醉后摘眼球取血，并開腹取兩側(cè)腎臟。腎組織部分用4 %中性甲醛固定進行石蠟切片，其余腎臟組織置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 生化指標檢測 按試劑盒說明書操作，用葡萄糖氧化酶法檢測小鼠血糖，酶分析法檢測血總膽固醇，雙縮脲法測尿蛋白濃度，得到的尿蛋白濃度與24 h尿量乘積為24 h尿總蛋白量。

1.2.4 HE、Masson染色檢測腎組織病變情況 將4%中性甲醛固定的腎臟組織做成3μm厚的石蠟切片，分別予以HE、Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測腎組織HIPK2、TLR4、NLRP3表達和定位 采用免疫組織化學染色SP二步法，將腎組織石蠟切片進行脫蠟、水化、微波爐加熱進行抗原修復、3%過氧化氫去離子水孵育，一抗孵育（HIPK2、TLR4、NLRP3均以1∶50濃度稀釋）置于4 ℃冰箱過夜，應用DAB溶液顯色，最后用自來水充分沖洗、復染、脫水、封片，光鏡下觀察并拍攝圖片。

1.2.6 Western blotting檢測腎組織HIPK2、TLR4、NLRP3、Fibronectin、E-cadherin蛋白表達 在-80 ℃冰箱內(nèi)取腎臟組織0.08 g，加入500 μL組織蛋白裂解液進行組織勻漿。離心后，取上清液，按BCA試劑盒說明書檢測小鼠腎組織蛋白濃度。加入5×的上樣緩沖液，煮沸后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶封閉。TBST洗膜后，分別加入小鼠抗HIPK2單克隆抗體（1∶1 000），小鼠抗TLR4單克隆抗體（1∶1 000），兔抗Fibronetin多克隆抗體（1∶1 000），小鼠抗E-cadherin單克隆抗體（1∶1 000），小鼠抗β-actin抗體（1∶4 000），4 ℃孵育過夜。洗滌后，分別加入相應的Goat Anti-rabbit IgG/HRP或Goat Anti-Mouse IgG/HRP（1∶5 000），室溫水平搖床上孵育1 h，用增強化學發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光，經(jīng)Image Lab 5.1軟件處理并分析圖像。

1.2.7 ELISA檢測小鼠血清IL-1β和IL-18水平 將收集的小鼠血液置于低溫高速離心機中，4 ℃、3 500 r/min離心3 min，取上層血清液，按ELISA試劑盒說明書檢測血清IL-1β、IL-18水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，采用Pearson法進行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般資料比較

各組小鼠體重、血糖、24 h尿蛋白量、總膽固醇、甘油三酯水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DM組較NC組均升高（P＜0.05），OMT組24 h尿蛋白量、總膽固醇、甘油三酯水平較DM組降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠一般資料比較 （n=10，±s）

表1 各組小鼠一般資料比較 （n=10，±s）

組別NC組DM組OMT組F 值P 值體重/g 23.00±2.58 58.14±4.30 56.00±6.2 182.915 0.000血糖/（mmol/L）6.93±0.38 38.21±3.76 36.49±6.35 169.726 0.000 24 h尿蛋白量/mg 7.32±0.36 34.38±4.86 24.26±8.69 56.489 0.000總膽固醇/（mmol/L）2.18±0.38 4.21±0.36 2.88±0.59 51.287 0.000甘油三酯/（mmol/L）1.26±0.28 2.34±0.29 1.65±0.14 48.809 0.000

2.2 OMT處理可改善小鼠腎組織病變情況

HE染色可見，在NC組小鼠的腎組織中，腎小球結(jié)構(gòu)清楚，輪廓清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，DM組可見腎小球系膜區(qū)節(jié)段性增生，基底膜無明顯增厚，大部分腎小管上皮細胞裂解，有空泡樣變性，部分腎小管管腔內(nèi)有透明管型，間質(zhì)有大量淋巴細胞浸潤及纖維組織增生，部分小動脈內(nèi)膜纖維組織增生。與DM組相比，OMT組腎臟病變情況有不同程度的改善。Masson染色可見，與NC組相比，DM組腎小管間質(zhì)中呈深藍色的Masson染色陽性物質(zhì)明顯增多，而與DM組比較，OMT組可見腎小管間質(zhì)中Masson染色陽性物質(zhì)較DM組減少。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織的形態(tài)觀察

2.3 OMT降低DM小鼠腎組織HIPK2、TLR4、NLRP3、Fibronectin，增加E-cadherin蛋白表達

各組小鼠TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin、Ecadherin蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DM組TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin蛋白相對表達量較NC組上升（P＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達量較NC組下降（P＜0.05）；OMT組小鼠TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin蛋白相對表達量較DM組下降（P＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達量較DM組上升（P＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 各組小鼠腎組織中TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin、E-cadherin蛋白條帶圖

表2 各組小鼠TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin、E-cadherin蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表2 各組小鼠TLR4、HIPK2、NLRP3、Fibronectin、E-cadherin蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

組別NC組DM組OMT組F 值P 值TLR4 0.17±0.01 0.45±0.04 0.20±0.03 265.776 0.000 HIPK2 0.32±0.02 0.65±0.06 0.51±0.03 187.493 0.000 NLRP3 0.13±0.01 0.21±0.01 0.14±0.01 280.525 0.000 Fibronectin 0.13±0.01 0.51±0.03 0.20±0.03 644.810 0.000 E-cadherin 0.64±0.04 0.35±0.03 0.68±0.03 255.241 0.000

2.4 OMT處理可減少DM小鼠腎組織TLR4、HIPK2、NLRP3的表達

免疫組織化學染色可見，NC組小鼠腎組織中，TLR4、HIPK2、NLRP3無明顯棕黃染，表達減少；DM組可見TLR4、HIPK2、NLRP3棕黃染表達明顯增多，主要表達在腎小管上皮細胞和部分腎小球；OMT組TLR4、HIPK2、NLRP3陽性染色較DM組明顯減弱。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織TLR4、HIPK2、NLRP3表達 （免疫組織化學染色×200）

2.5 各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較

各組小鼠血清IL-1β、IL-18水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。DM組較NC組升高（P＜0.05），OMT組較DM組降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清中IL-1β、IL-18水平比較（n=10，pg/μL，±s）

表3 各組小鼠血清中IL-1β、IL-18水平比較（n=10，pg/μL，±s）

組別NC組DM組OMT組F 值P 值IL-1β 27.20±7.66 94.00±18.63 51.35±18.29 28.620 0.000 IL-18 116.68±23.63 256.72±13.05 159.40±47.29 31.271 0.000

2.6 HIPK2與TLR4、NLRP3蛋白表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，DM組腎組織中HIPK2蛋白與TLR4、NLRP3蛋白表達均呈正相關(guān)（r=0.881和0.774，P=0.001和0.009）。OMT組HIPK2蛋白與TLR4、NLRP3蛋白表達均呈正相關(guān)（r=0.814和0.871，P=0.004和0.001）。

3 討論

有研究表明db/db小鼠從4周齡起即可出現(xiàn)貪食、肥胖、多飲多尿，隨著周齡的增加進而出現(xiàn)有明顯的高血糖、高血脂等特征[17]。本研究中小鼠隨著周齡的增加也出現(xiàn)了上述特征，經(jīng)病理組織HE染色和Masson染色可見db/db小鼠腎小球系膜區(qū)發(fā)生節(jié)段性增生，基底膜無明顯增厚，腎小管上皮細胞裂解有空泡樣變性，間質(zhì)有淋巴細胞浸潤及纖維組織增生，部分小動脈內(nèi)膜纖維組織增生，深藍色的Masson染色陽性物質(zhì)明顯增多，ELISA檢測顯示db/db小鼠血清中的炎性介質(zhì)IL-1β、IL-18水平明顯增加，生化指標檢測顯示db/db小鼠體重、血糖、24 h尿蛋白量、總膽固醇、甘油三酯水平較NC組均明顯升高；與db/db小鼠相比，OMT治療后db/db小鼠腎臟病理改變有所改善，伴隨24 h尿蛋白量、總膽固醇、甘油三酯水平降低，而體重和血糖水平無統(tǒng)計學差異，Masson染色陽性物質(zhì)明顯減少，炎性介質(zhì)IL-1β與IL-18的含量明顯降低，以上結(jié)果均提示db/db小鼠出現(xiàn)腎功能減退，糖尿病腎病模型復制成功，OMT可明顯減輕db/db小鼠腎臟炎癥反應及纖維化程度，改善腎功能，但其可能的作用機制不甚清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4和NF-κB作為炎癥反應激活通路中的重要調(diào)節(jié)因子，在糖尿病腎病發(fā)展過程中的表達水平上調(diào)以及過度激活可能是導致糖尿病腎損傷的重要機制之一[18]。而NAGAREDDY等[19]發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織巨噬細胞中，通過TLR4/MyD88誘導IL-1β和NLRP3炎癥小體的活化，抑制TLR4的配體或NLRP3-IL-1β信號軸可以減輕肥胖狀態(tài)下脂肪組織的炎癥反應和胰島素抵抗。提示TLR4的信號傳導與NLRP3之間存在信號串擾且共同參與了糖尿病肥胖狀態(tài)的病理過程[20]。本研究結(jié)果中NC組小鼠腎組織中TLR4、NLRP3少量棕黃染，db/db小鼠在腎小管上皮細胞和部分腎小球中可見TLR4、NLRP3棕黃染表達明顯增多，Western blotting結(jié)果顯示，兩者的水平明顯增加，且伴隨纖維化指標Fibronectin蛋白表達增多，EMT指標E-cadherin蛋白表達明顯下降，以上結(jié)果提示db/db小鼠腎組織中TLR4、NLRP3炎癥信號通路被激活，炎性介質(zhì)產(chǎn)生增多，出現(xiàn)腎臟病理改變，上皮細胞表型標志物減少，促進了EMT過程，纖維結(jié)締組織在腎組織中含量增加，加快纖維化進展。

HIPK2是一種功能多樣的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可促凋亡、促纖維化、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，參與DNA損傷應答及缺氧環(huán)境中抑制血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)HIPK2能抑制TGF-β誘導的Smad3磷酸化，HIPK2缺失可抑制該通路的激活[21]；也有研究證實TGF-β/Smad3信號通路的激活能促進NLRP3炎癥小體的活化，而在小膠質(zhì)細胞中，脂多糖可通過上調(diào)TLR4表達，激活小膠質(zhì)細胞，促進NLRP3與Caspase-1活化，引起小鼠腦組織中炎性細胞因子高表達[22]；非小細胞肺癌中，胡蘿卜素B直接結(jié)合TLR4來激活NLRP3炎癥小體，進一步導致Gasdermin D的N-和C-末端分離以執(zhí)行焦性下垂[23]。以上研究提示HIPK2可能與TLR4、NLRP3共同參與糖尿病腎病的發(fā)病機制，但是否存在相關(guān)性，尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，db/db小鼠腎小管上皮細胞和部分腎小球中HIPK2蛋白表達明顯增加，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)db/db小鼠HIPK2分別與TLR4和NLRP3呈正相關(guān)，揭示3者共同促進糖尿病腎病的腎功能減退，促炎信號的活化及腎臟纖維化的進程。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，OMT可通過抑制TLR4或NLRP3炎癥信號發(fā)揮作用[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)OMT組與DM組相比，HIPK2、TLR4、NLRP3的表達均明顯降低，伴隨炎癥反應減弱、炎性介質(zhì)釋放減少，同時Ecadherin表達增加，F(xiàn)ibronectin沉積減少，OMT組HIPK2分別與TLR4和NLRP3也呈正相關(guān)。

綜上所述，OMT可改善db/db小鼠血脂水平和腎功能，減少炎性介質(zhì)的釋放，逆轉(zhuǎn)EMT過程，減輕腎臟纖維化進展，可能與下調(diào)HIPK2表達，進而抑制TLR4和NLRP3炎癥信號通路有關(guān)，但是具體的調(diào)控機制還需要在體外應用多種手段干預進一步論證。