泛素特異性蛋白酶7功能和在結直腸癌中的研究進展

付錦程 付濤

泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease 7,USP7)是一種廣泛參與DNA修復、細胞分裂、細胞凋亡、基因表達、蛋白定位、蛋白降解等多種細胞過程的去泛素化酶[1]。有研究表明,UPS7在調節(jié)多種信號通路相關因子、調控細胞增殖和凋亡、協助建立腫瘤免疫逃逸、參與DNA損傷修復等促進腫瘤發(fā)生,發(fā)展的機制中發(fā)揮著重要的作用。USP7廣泛的生物學效應使其成為研究腫瘤機制和進展過程的重要分子。本文對USP7的結構、廣泛的生物學功能及其在結直腸癌中的研究進展進行綜述。

一、USP7的結構與功能

USP7能與單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) 編碼的具有泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes 3,E3)活性的感染性細胞蛋白(infected cell protein 0,ICP0)結合,也被稱為皰疹病毒相關泛素特異性蛋白(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protein,HAUSP)[2]。USP7由1 102個氨基酸組成,具有高度保守的結構域,自氨基末端至羧基末端包括：氨基末端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,poly Q)延伸,腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-related factor,TRAF)樣結構域,催化結構域(catalytic domain,CD)和羧基末端區(qū)域。

USP7是一種半胱氨酸蛋白酶,具有三個部分的保守USP7結構域,稱為手指、拇指和手掌[3-4]。USP7結構域的大小從300到800多個氨基酸不等[3]。輔助結構域,包括泛素相關結構域(UBA)、泛素相互作用基序(UIM)和鋅指泛素特異性蛋白酶結構域(ZnF-UBP)以及末端擴展,被認為賦予了USP7的底物特異性[3,5]。由于一些USP7控制細胞周期進程、DNA損傷修復和與癌癥相關的細胞信號,它們在腫瘤發(fā)生中的作用已被研究[3,6-8],關于其結構和功能也是最近才開始被研究[9]。

二、USP7的功能

1.p53依賴途徑：隨著研究的深入,越來越多的USP7底物被鑒定出來,這些底物中關于p53的研究最為透徹。正常細胞中的p53主要通過Murine double minute 2(MDM2)介導的泛素化和隨之而來的降解維持低水平狀態(tài)[10]。p53和MDM2均是USP7的底物,且以互斥的方式特異性地識別USP7 的TRAF樣結構域,由于MDM2的親和力強于p53,因此,正常細胞穩(wěn)態(tài)中MDM2是USP7的首選底物[11-12]。在細胞應激的條件下,MDM2磷酸化降低了其與USP7結合的親和力,使USP7從穩(wěn)定MDM2轉換為穩(wěn)定p53,誘導凋亡途徑激活[13],這個現象被研究人員稱為“開關”效應。腫瘤抑制因子p53在腫瘤預防中起著重要作用。在人類腫瘤的發(fā)展過程中,p53經常因直接突變或調節(jié)蛋白的表達改變而失活。p53是分子網絡中的一個中心樞紐,它能感知各種細胞應激,并引發(fā)有效的抗增殖反應,包括細胞周期阻滯、凋亡和衰老。此外,p53還參與調控其他細胞過程,如代謝、自噬和鐵死亡等[14]。

2.非p53依賴途徑：除了USP7-MDM2-p53軸之外,USP7還通過p53非依賴性的途徑參與細胞增殖和凋亡調控,這種效應主要源于USP7參與調節(jié)多種信號通路相關因子,改變它們的表達水平和亞細胞定位。

USP7可以通過逆轉多泛素化,穩(wěn)定轉錄因子導致其靶點表達增加,如USP7通過TRAF樣結構域和Ubl結構域與NOTCH1胞內結構域(Intracellular domain of NOTCH1,ICN1)交互,使其穩(wěn)定并異常激活,導致NOTCH1靶基因的表達上調,促進急性T淋巴細胞白血病的發(fā)展,而USP7缺失可使NOTCH1的多聚泛素化增強,導致其降解[15]。

USP7可以使E3泛素連接酶NEDD4L去泛素化,通過NEDD4L-SMAD軸影響神經系統[16]。USP7也可以調節(jié)TBX3、直接結合TBX3并減少其泛素化和降解來抑制p57KIP2的表達,促進甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖[17]。USP7逆轉單泛素化和多泛素化標記的能力使其能夠從多方面調節(jié)信號通路轉錄因子,這種通過逆轉多泛素化改變轉錄因子的穩(wěn)定性和逆轉單泛素化改變轉錄因子的亞細胞定位之間的差異性,將是一個有待進一步研究的課題。

3.促進DNA修復及細胞分裂分化：USP7對DNA損傷和耐受有重要作用。當細胞出現DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks ,DSBs)時,會出現DNA損傷反應(DNA damage response,DDR),這個過程需要關鍵調控因子MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復合物和DDR信號的核心成分DNA損傷檢查點蛋白調節(jié)因子1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1,MDC1)。MRN識別DSBs信號時導致MDC1與磷酸化組蛋白H2AX結合,使得泛素E3連接酶RNF168聚集,促進多聚泛素鏈在染色質上形成,同時生成染色質綁定的p53結合蛋白1(p53 binding protein 1,p53BP1)和乳腺癌蛋白1(breast cancer protein 1),產生有效的DNA修復[18-20]。

4.表觀遺傳學調控功能：USP7作為翻譯后蛋白穩(wěn)定性調節(jié)因子的作用被廣泛接受。它可能以通過組蛋白H3K9的甲基轉移酶SUV39H1以表觀遺傳學機制調控p53靶蛋白[21]。USP7是控制組蛋白H2A泛素化水平的非典型多梳抑制復合體1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的組分之一[22]。有研究顯示,延伸蛋白BC和多梳抑制復合物相關蛋白EPOP能夠通過招募USP7調控H2B泛素化水平,參與癌癥增殖調控[23]。這些研究為USP7調控組蛋白標記的結構提供了更清晰的解釋。

E3連接酶泛素樣含PHD和環(huán)指域(ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1,UHRF1)是DNA甲基化機制的重要組成部分,能夠結合半甲基化的CpG島并招募維持甲基轉移酶DNMT1,以確保DNA甲基化模式通過復制傳播[24]。UHRF1、USP7和DNMT1還可以作為泛素E3連接酶-USP7靶復合物在已知的抑癌基因啟動子處形成,通過增加DNA甲基化和組蛋白修飾來抑制它們[25]。提示了USP7表觀遺傳調控和DNA修復兩大功能之間存在聯系。

三、USP7與結直腸癌

1.USP7在結直腸癌中的研究進展：正如上文所述,USP7具有廣泛且迥異的生物學功能,使得其在結直腸癌(CRC)中的表現也呈現出顯著的差異,在CRC中像“雙刃劍”一樣,即USP7既可以促進腫瘤生長,又可以抑制腫瘤生長。

Kerstin等[26]的研究顯示,USP7既具有促癌效應,又具有抑癌效應：在無應激的癌細胞中,無論上調還是下調USP7均能穩(wěn)定p53,從而導致抑制細胞生長并誘導凋亡。體內實驗也證實,USP7上調或下調,都使腫瘤的體積和重量下降,腫瘤生長抑制。有研究表明,USP7的上調所帶來的生長抑制效應可能源于其穩(wěn)定了p53,同時激活p53依賴的凋亡途徑;而USP7下調所帶來的生長抑制效應則較為復雜,因為其效果依賴于p53、MDM2和USP7相對化學計量,當USP7部分減少時可使p53失活,而USP7接近完全消失時則由于MDM2的失穩(wěn)定性而使p53趨于穩(wěn)定?？偠灾?在CRC中,USP7下調所帶來的p53依賴和p53獨立同時存在的生長抑制作用,表現為促增殖蛋白的減少和抗增殖蛋白的增加。

Yang等[27-28]通過實時PCR和蛋白質印跡分析了25例結腸癌及癌旁組織中USP7表達,發(fā)現USP7在癌組織中顯著下調,同時還觀察到癌組織中磷酸化STAT3的表達升高。隨后在結腸癌細胞系HCT116、SW620和SW480中發(fā)現,磷酸化STAT3增多時,USP7的表達水平會降低,同時內源性p53蛋白水平下降。通過熒光素酶報告和芯片分析發(fā)現STAT3與USP7啟動子區(qū)域結合導致組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1,HDAC 1)招募抑制USP7活性進而使內源性p53蛋白水平降低,導致腫瘤生長。Choi等[29]研究發(fā)現,FAM188B的mRNA和蛋白水平在結腸癌細胞系(HCT116,SW620,HT-29)中均有較高的表達。FAM188下調可以通過細胞周期阻滯或細胞死亡導致體外細胞生長抑制,這一過程的機制是：FAM188B的沉默激活了p53,從而上調凋亡相關基因導致細胞死亡。這種效應是通過與USP7相互作用來調控p53的穩(wěn)定性。FAM188B中存在USP7結合基序,當FAM188B過表達時,會使得其結合的USP7顯著增加,導致泛素化的p53增多,使p53凋亡途徑被抑制;反之,當FAM188B表達下調時,游離的USP7增多,使得p53上調,激活p53凋亡信號通路,抑制腫瘤生長。總而言之,FAM188B的發(fā)現為USP7-MDM2-p53軸增添了新的內容。

在促進癌癥進展的研究中,Novellasdemunt等[30]在APC突變SW480細胞系中發(fā)現,敲減USP7會使CRC細胞的生長受限。隨后將SW480細胞系導入免疫缺陷模型鼠(SCID mice)中,構建異種移植模型,結果表明,USP7特異性抑制劑P2207對小鼠腫瘤生長有明顯的抑制作用,分離瘤體顯示出對Wnt靶基因的抑制,這種效應與敲減USP7一致,并且在APC突變的細胞中更為明顯。該研究顯示了USP7促進CRC發(fā)展的機制：APC突變的CRC細胞中Wnt活化和轉化的閾值-β-catenin抑制結構域(β-catenin inhibitory domain ,CID)缺失,使得β-catenin暴露于USP7下,放大了USP7對β-catenin去泛素化效應,導致Wnt信號的異常激活,促進了細胞增殖和腫瘤進展。

有關USP7抑制劑的研究也進一步證實了USP7所帶來的促癌效應。Du等[37]發(fā)現,結腸癌中USP7與DNMT1的豐度相關(R2=0.84)。USP7敲減的結腸癌細胞對組蛋白去乙?；窰DAC抑制劑更敏感：相較于正常細胞系,USP7敲減的細胞中HDAC抑制劑可以誘導5～10倍的細胞凋亡,增加了凋亡細胞標志物的豐度,包括caspase3,6,9和PARP。An等[31]發(fā)現與正常細胞相比,USP7在CRC細胞系HCT116,SW480,Caco-2,SW620 and HT-29中高表達。減少USP7的表達可以有效抑制CRC細胞系HCT116,SW480,Caco-2的增殖,由于三種細胞系中p53的狀態(tài)差異大,表明這種效應是非p53依賴性的。有數據分析顯示,CRC病人的總體生存率與USP7水平呈現顯著負相關,低表達USP7的病人顯示出相對增加的無復發(fā)生存的可能性。隨后使用USP7抑制劑P5091處理細胞,顯著抑制了細胞生長,增加了細胞凋亡,這與β-catenin降解有關。P5091能夠增加β-catenin的泛素化從而加快其降解,顯著降低β-catenin的水平,抑制了Wnt/β-catenin通路的異常激活,誘導了凋亡途徑。隨后的裸鼠異種移植實驗證實,使用P5091治療的裸鼠腫瘤的直徑和重量都明顯降低,并且荷瘤小鼠的體重沒有明顯下降,顯示出較好的耐受性?？偠灾?P5091的處理在體內和體外均能通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制CRC的增殖。研究表明,USP7抑制劑在CRC中的顯著作用,進一步開發(fā)和完善有助于CRC的靶向治療。

2.USP7在結直腸癌中的研究方向

正如上文所述,USP7的生物學功能廣泛,普遍參與細胞調節(jié),尤其是調節(jié)信號通路相關因子。已有的研究闡明了USP7如何調節(jié)Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信號通路相關因子以促進CRC的進展,未來探究其他通路中USP7與CRC的關系將是一個方向,例如,目前研究已經證實Hippo通路與CRC的發(fā)展密切相關[32],而且已有研究人員證實USP7穩(wěn)定該通路的轉錄因子Yki,促進肝細胞癌的發(fā)展[33]。上文提到USP7通過去泛素化可以調節(jié)NOTCH通路、Hedgehog通路、PI3K/Akt通路的相關轉錄因子,而這些通路廣泛參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展,提示我們研究USP7如何通過這些通路促進CRC的進展。

另外,關于非編碼RNA協同USP7在腫瘤中研究逐漸增多,如上文所示的miR-205與USP7的關系,最近的研究也顯示在體脂較高的肝細胞癌病人中,由脂肪細胞分泌的外泌體中的環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)上調,通過抑制microRNA-34a(miR-34a),激活USP7,導致一組基因上調,包括細胞周期蛋白cyclin A2,促進腫瘤增殖和轉移[34]。也有研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以通過USP7蛋白介導Wnt/β-catenin通路促進結直腸癌的發(fā)生[35],這也為USP7在結直腸癌的研究中提供了新的方向。

四、結語

USP7具有廣泛的表達調節(jié),其主要底物不僅涉及經典的腫瘤抑制因子,如p53和PTEN,還涉及各種信號通路分子,如Yki、Ci/Gil、NOTCH1、β-catenin等,還參與細胞分裂、細胞分化、DAN損傷修復及表觀遺傳學的調控,使得USP7具有獨特的研究價值。