超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血清康替唑胺濃度及其臨床應(yīng)用

金 潔 羅敬銘 范旭東 蔡鑫君

康替唑胺屬于新一代惡唑烷酮類抗菌藥物，其抗菌機制與利奈唑胺相同，可以與細菌的核糖體結(jié)合，阻止細菌蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細菌生長，臨床上多用于多重耐藥的革蘭氏陽性球菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌的治療[1-3]。有研究報道，康替唑胺的骨髓抑制，造成三系下降的不良反應(yīng)低于利奈唑胺，但因其上市時間短，仍有待于更長時間的監(jiān)測[4]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectro-metry，UPLC-MS/MS）作為一種高度敏感性和選擇性的檢測方法，具有檢測速度快，靈敏度高，不要求被分析物峰完全分離，樣本需求量更少等優(yōu)勢，被廣泛用于血藥濃度監(jiān)測[5-7]。本研究旨在開發(fā)一種高效、快速、準確的UPLC-MS/MS，用于測定人血清中康替唑胺濃度。

1 材 料

1.1 主要儀器 UPLC-MS/MS 系統(tǒng)由Xevo TQ-S IVD 三重四極桿質(zhì)譜儀和ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation，MLF，USA）組成，Eppendorf 5425R 高速冷凍離心機（德國），Heal Force SMART-N 超純水儀（香港）。

1.2 試劑和標準品 甲醇、乙腈（美國Supelco 公司，質(zhì)譜級），乙腈（美國Honeywell 公司，HPLC 級），甲酸（上海Macklin 公司，質(zhì)譜級），色譜柱（ZORBAX PRHD SB-Aq，3×50 mm，1.8 μm，美國安捷倫公司）。標準物質(zhì)康替唑胺（上海盟科藥業(yè)股份有限公司），內(nèi)標物質(zhì)利奈唑胺-D3（Bepure 有限公司）。

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為甲醇，流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測時間為5 min，進樣量為3 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源，質(zhì)譜掃描模式為正離子模式（ESI，MS+）。電壓設(shè)定為3.00 kV。解吸氣體溫度和流速為500 ℃，900 L/Hr。錐形氣體流速為150 L/Hr，噴霧氣體壓力設(shè)定為7.00 Bar，碰撞氣體的流速為0.16 mL/min。具體參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜檢測參數(shù)

2.2 標曲、質(zhì)控及內(nèi)標工作液的制備 精密稱取適量的康替唑胺標準品和利奈唑胺-D3 內(nèi)標物，分別溶于甲醇-水溶液（50%，v/v）和甲醇中，配制濃度均為1 mg/mL 的儲備液。以甲醇-水溶液（50%，v/v）為稀釋劑，配制康替唑胺含量分別為500、400、250、100、50、10、5、2.5 μg/mL 的標曲工作液。取1 mg/mL的利奈唑胺-D3 儲備液10 μL 加入到9.99 mL 的甲醇溶液中，配制1.00 μg/mL 的內(nèi)標工作液。

按照上述方法，制備四個濃度水平的質(zhì)控工作液，分別為定量下限（LLOQ，2.5 μg/mL）、低濃度質(zhì)控（LQC，5 μg/mL）、中濃度質(zhì)控（MQC，100 μg/mL）、高濃度質(zhì)控（HQC，400 μg/mL）。

2.3 樣本的處理 取空白血清樣本45 μL 加入所需工作液5 μL 或臨床血清樣本50 μL 于1.5 mL 離心管中，加入內(nèi)標工作液200 μL。渦旋混勻后在4 ℃，12 000 r/min 條件下離心5 min。取20 μL 的上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，加入780 μL 的甲醇-水溶液（50%，v/v），渦旋混勻1 min 后取100 μL 樣品溶液于進樣瓶進行UPLC-MS/MS 分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 按照“2.3”下方法處理6 個不同來源的血清分別制備空白基質(zhì)樣品，按照“2.2”下的方法制備康替唑胺LLOQ 濃度的質(zhì)控樣品；按照“2.1”下的方法進行分析。將空白基質(zhì)樣品的響應(yīng)值和LLOQ樣品的響應(yīng)值進行比較，空白基質(zhì)樣品中康替唑胺的響應(yīng)值不能超過LLOQ 樣品中響應(yīng)值的20%，內(nèi)標則不能超過5%。

2.4.2 標準曲線 按照“2.2”下的方法制備梯度稀釋的標曲工作液，通過將分析物的峰面積和內(nèi)標面積之比和樣品標稱濃度進行線性回歸，建立標準曲線。

2.4.3 準確度、精密度和回收率 建立4 個濃度水平質(zhì)控樣品（LLOQ、LQC、MQC、HQC），每個質(zhì)控樣品重復(fù)6 次，在3 d 內(nèi)進行至少3 批次的分析，用來驗證批次內(nèi)和批次間的準確度、精密度和回收率。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng) 選取兩個濃度水平質(zhì)控樣品（LQC 和HQC）驗證基質(zhì)效應(yīng)。采用不同來源的血清制備多個空白基質(zhì)樣本（n=3），將它們與不含基質(zhì)的樣品（n=3）做對比。由此計算出內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。

為了驗證殘留效應(yīng)，連續(xù)進樣3 次HQC 樣品后，立即進樣1 次空白基質(zhì)樣品，重復(fù)多次。空白基質(zhì)樣品中的康替唑胺信號應(yīng)當小于LLOQ 水平的20%，內(nèi)標信號應(yīng)當小于5%。

2.4.5 穩(wěn)定性 不同條件下，對人血清和最終提取物中康替唑胺的穩(wěn)定性進行測試?？疾旄摺⒌唾|(zhì)控樣品（n=3）在常溫下放置6 h 和4 ℃下放置24 h 的穩(wěn)定性。最終提取物在自動進樣條件下（4 ℃）保存24 h，測試最終提取物在高、低質(zhì)控水平的穩(wěn)定性。通過分析3 次凍融后高、低質(zhì)控的濃度，測定未處理樣品的凍融穩(wěn)定性。對于所有的穩(wěn)定性實驗，高、低質(zhì)控的精密度≤15%，準確度≤15%。

2.5 臨床應(yīng)用 收集9 份臨床血清樣本，按照“2.3”項下操作，取上清液經(jīng)UPLC-MS/MS 分析，檢測樣本中康替唑胺的濃度。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性 康替唑胺和利奈唑胺-D3 的出峰時間均為2.25 min 左右（見圖1A～E）。專屬性結(jié)果顯示，空白基質(zhì)樣品中康替唑胺色譜峰響應(yīng)極低，不存在造成干擾的內(nèi)源性物質(zhì)（見圖1A）。各組質(zhì)控樣品重復(fù)性良好，峰形清晰，無前沿或拖尾（見圖1B～E）。

圖1 康替唑胺空白基質(zhì)樣品（A），標準品的定量下限、低、中、高濃度質(zhì)控樣本（B～E）的色譜圖

3.2 標準曲線 經(jīng)過驗證，康替唑胺的回歸方程為y=0.193*x+0.020（R2=0.997），在0.25～50 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線性良好，定量下限為0.25 μg/mL。

3.3 精密度、準確度及回收率試驗 康替唑胺的批內(nèi)和批間準確度、精密度見表3。結(jié)果顯示，各項質(zhì)控指標均符合相關(guān)要求。在三批（n=6）樣品中，LLQC 回收率在88.20%～108.90%之間；LQC 回收率在96.30%～108.20%之間；MQC 回收率在98.90%～104.70%之間；HQC 回收率在98.70%～104.90%之間。

表3 康替唑胺批內(nèi)和批間準確度和精密度

3.4 基質(zhì)效應(yīng)和殘留效應(yīng) 在LQC 和HQC 上，使用6 個不同來源的基質(zhì)制備的樣品來評估基質(zhì)效應(yīng)。LQC 下，康替唑胺的基質(zhì)效應(yīng)因子為（0.93±0.02），而HQC 下，則為（1.09±0.01）。

在最高濃度的質(zhì)控樣品進樣后，空白基質(zhì)樣品中的康替唑胺峰面積占LLOQ 峰面積的（12.70±1.15）%，而內(nèi)標的信號幾乎沒有（0.03±0.02）%。因此，可以認為該分析方法的殘留效應(yīng)符合要求。

3.5 穩(wěn)定性 從表4 的穩(wěn)定性結(jié)果可以看到，在不同的儲存條件下，康替唑胺在人血清和最終提取物中都是穩(wěn)定的。

表4 康替唑胺的穩(wěn)定性

3.6 臨床應(yīng)用 將建立并完成驗證的檢測方法成功用于9 例臨床患者康替唑胺血藥濃度測定，其中有4例患者血清樣本的康替唑胺濃度低于檢測的LLQC，其余樣本的康替唑胺檢測濃度為1.10～8.99 μg/mL之間，檢測濃度與臨床預(yù)測結(jié)果相符，表明該檢測方法可以用于治療藥物濃度監(jiān)測（therapeutical drug monitoring，TDM）和藥代動力學(xué)研究。

4 討 論

本研究開發(fā)并且驗證了一種用于檢驗康替唑胺血清藥物濃度的方法。我們選擇利奈唑胺-D3 作為內(nèi)標物是基于康替唑胺和利奈唑胺-D3 具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是具有不同的質(zhì)荷比，這一內(nèi)標良好地補償了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法中信號漂移的問題，即使康替唑胺和利奈唑胺-D3 的出峰時間同為2.25 min，但是仍能保證兩者被有效區(qū)分出來。

本研究中采用的UPLC-MS/MS 方法需要的樣本量少，只需要50 μL 血清就可以達到檢測要求。樣品只需加入含有定量內(nèi)標的甲醇，沉淀蛋白質(zhì)后離心稀釋，該處理方法簡單易行，且檢測時間僅需要5 min，方便快捷。同時，由于康替唑胺作為新型惡唑烷酮類抗菌藥物，臨床應(yīng)用不多，其有效的血藥濃度范圍有待進一步研究，本研究中設(shè)置了康替唑胺線性范圍為0.25～50 μg/mL，以便開展臨床研究。綜上所述，我們開發(fā)的康替唑胺血藥濃度分析方法能夠在TDM實驗室中開展，適用于在重癥監(jiān)護室治療的患者及特殊患者人群如老年人、合并慢性病的患者，也適用于藥代動力學(xué)研究。