載神經(jīng)毒素的透明質(zhì)酸可溶性微針制備、評(píng)價(jià)及鎮(zhèn)痛作用研究

吳 婷 鐘家浩 姚文棟

神經(jīng)毒素（neurotoxin，NT）是一種從眼鏡蛇毒中分離的多肽，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗衰老及免疫抑制等作用[1-3]，現(xiàn)已有肌內(nèi)注射劑上市[4]。相較于傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥，NT 長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)成癮性與耐受性，不但可應(yīng)用于急性疼痛，還可應(yīng)用于晚期癌痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[3-4]?？扇苄晕⑨槪╠issolving microneedle，DMN）是一種由可生物降解的水溶性聚合物組成的微針，用于透皮遞送水溶性藥物[5]。通常將水溶性藥物封裝在DMN 的針頭部分，一旦穿過(guò)角質(zhì)層，由生物相容性聚合物構(gòu)成的針體在接觸組織液后就會(huì)溶解，從而釋放出包封的化合物。除了微針的其他優(yōu)點(diǎn)外，DMN還具有成本低廉，可以完全溶解針頭，不引起二次危害的優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究采用兩步離心法以高生物相容性材料——透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）作為針體材料，羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）作為背襯材料，制備載神經(jīng)毒素的可溶性微針（DMNNT），通過(guò)對(duì)DMN-NT 體內(nèi)外的評(píng)價(jià)，為分子量較大的多肽類藥物以及鎮(zhèn)痛藥物經(jīng)皮遞送提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀 器 微針模具，臺(tái)州薇凱生物科技有限公司；HF-50 數(shù)顯推拉力計(jì)，美國(guó)PACK 公司；B008 便攜式顯微鏡，深圳超眼科技有限公司；TL6R 立式離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；Nikon Eclipse Ci-L 正置顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；YLS-12A 鼠尾光照測(cè)痛儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站；Waters Alliance e2695 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司。

1.2 試 劑 NT，云南龍鳳谷生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)H45021228；HA，上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)42122；CMC，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)C10085620；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng) 物 健康SPF 級(jí)的6 周齡ICR 小鼠72 只（雄27 只、雌45 只），體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于SPF 屏障系統(tǒng)中，食物充足，光照條件為12 h 明暗交替，溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012，按照浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)及應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)后頸椎脫位處死。

2 方 法

2.1 DMN-NT 的制備 在前期工作基礎(chǔ)上，采用兩步離心法制備DMN-NT[6-7]。（1）加入NT 水溶液調(diào)節(jié)HA 濃度分別為10、20、30、40 mg/mL，攪拌均勻后將含藥的HA 液注入微針模具；在4 ℃，4 000 r/min 離心10 min，除去微針模具表面的HA 液，干燥1 h 后取出備用；（2）稱取CMC 溶脹為水溶液（4%），注入含干燥定型HA 的模具，離心10 min，取出后干燥成型，脫模，即得DMN-NT。DMN-NT 的機(jī)械強(qiáng)度通過(guò)使用拉力計(jì)測(cè)得的縱向與橫向斷裂力體現(xiàn)。以機(jī)械強(qiáng)度為指標(biāo)，篩選制備DMN 最合適的HA 濃度。

2.2 表 征

2.2.1 形態(tài)特征 將所制備的DMN-NT 置于便攜式顯微鏡下觀察其形態(tài)；在正置顯微鏡下觀察形態(tài)并記錄微針的長(zhǎng)度及寬度。

2.2.2 載藥量 將DMN-NT 溶于去離子水（1 mL）中，在充分溶解后離心，隨后取上清液，采用前期研究中的HPLC 法檢測(cè)每片載藥量[7]。

2.2.3 穩(wěn)定性 取制得的DMN-NT 在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下分別保存1 周及1、3 個(gè)月后，測(cè)定其剩余載藥量。

2.3 體外透皮釋放度 按前期研究處理得到無(wú)毛的離體鼠皮并設(shè)置擴(kuò)散池相應(yīng)條件，隨后DMN-NT 透皮給藥[7]；分別于DMN-NT 透皮給藥0、10、20、30 min和1、2、3、4、6、8 h 收集0.5 mL 接收液，隨后補(bǔ)充等量接收液。對(duì)取出的接收液處理后，用高效液相色譜法測(cè)定含量并計(jì)算累計(jì)釋放率。

2.4 藥效學(xué)

2.4.1 醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 取36 只小鼠，雌雄各半，將其隨機(jī)數(shù)字表法分成生理鹽水（normal saline，NS）組、NT 組、DMN-NT 組；每組又分為1 h 與4 h 兩個(gè)亞組，每組6 只。按組分別給藥，NT 組肌肉注射NT 溶液（100 μg/kg），DMN-NT 組使用DMN-NT 透皮給藥，每片（2.2±0.2）μg；NS 組肌肉注射與NT 組等量的NS。給藥后1、4 h 每只小鼠按10 mL/kg 劑量腹腔注射0.6%醋酸，觀察并記錄30 min 內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)。

2.4.2 熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 設(shè)定溫度為（55±0.5）℃，以舔足或躍起時(shí)間為痛閾指標(biāo)，篩選出基礎(chǔ)痛閾在10～30 s 內(nèi)的雌性小鼠18 只。為避免組織損傷，設(shè)定60 s 為加熱的上限。將篩選出的18 只小鼠隨機(jī)數(shù)字表分成NS 組、NT 組、DMN-NT 組。按組給藥，隨后分別測(cè)定在30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛閾值變化。

2.4.3 鼠尾測(cè)痛法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 篩選出基礎(chǔ)痛閾在5～10 s 內(nèi)的小鼠18 只，雌雄各半，分層隨機(jī)數(shù)字表分為NS 組、NT 組、DMN-NT 組。為避免組織損傷，設(shè)定16 s 為持續(xù)加熱的上限。按組給藥，分別測(cè)定給藥后30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛閾值變化。

3 結(jié) 果

3.1 DMN-NT 的制備 所得DMN-NT 機(jī)械強(qiáng)度如表1 所示，隨HA 濃度的升高，所制備DMN-NT 機(jī)械強(qiáng)度升高；HA 濃度30 mg/mL 時(shí)，機(jī)械強(qiáng)度達(dá)到最大值，縱向斷裂力為（0.173±0.004）N，橫向橫向斷裂力為（0.598±0.042）N。然而HA 濃度40 mg/mL 時(shí)，由于濃度過(guò)高，影響DMN 成型，無(wú)法制備得到形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的DMN。

表1 不同濃度HA 對(duì)DMN-NT 機(jī)械強(qiáng)度的影響（N，±s）

表1 不同濃度HA 對(duì)DMN-NT 機(jī)械強(qiáng)度的影響（N，±s）

注：HA 為透明質(zhì)酸；DMN-NT 為載神經(jīng)毒素的可溶性微針；“-”為無(wú)此項(xiàng)結(jié)果

HA 濃度（mg/mL）10 20 30 40橫向斷裂力0.412±0.031 0.545±0.046 0.598±0.042-DMN-NT 片數(shù)6666縱向斷裂力0.148±0.004 0.165±0.005 0.173±0.004-

3.2 表 征 結(jié)果如圖1 所示，DMN-NT 針體呈金字塔形，表面平整，長(zhǎng)度約為500 μm，底部寬度約為350 μm。所得每片DMN-NT 載藥（2.2±0.2）μg。穩(wěn)定性結(jié)果如表2 所示，隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，不同保存條件下的DMN-NT 剩余載藥量均有所下降。而相同保存時(shí)間下，低溫更有利于NT 的保存，-20 ℃條件下DMN-NT 保存3 個(gè)月仍有（98.4±1.8）%的剩余載藥量。由此可知，DMN-NT 冷凍保存穩(wěn)定性較為良好。

圖1 便攜式顯微鏡（4×，A）與正置光學(xué)顯微鏡觀察DMN-NT表觀形態(tài)（100×，B）

表2 DMN-NT 在不同條件下的穩(wěn)定性（%，±s）

表2 DMN-NT 在不同條件下的穩(wěn)定性（%，±s）

注：DMN-NT 為載神經(jīng)毒素的可溶性微針

溫度-20 ℃4 ℃室溫DMN-NT 片數(shù)剩余載藥量666 1 周100.2±1.8 100.5±2.0 99.8±2.1 1 個(gè)月99.8±1.5 99.2±2.2 99.0±2.7 3 個(gè)月98.4±1.8 96.5±1.5 95.2±2.0

3.3 體外透皮釋放度 根據(jù)釋放時(shí)間及通過(guò)計(jì)算處理后累計(jì)釋放率，繪制藥物的累積滲透曲線。結(jié)果如圖2 所示，前10 min 釋放較慢，累計(jì)滲透百分比約為10%；20～30 min DMN 中的NT 釋放較快，在20 min時(shí)已有33%累積滲透，而30 min 后透過(guò)離體皮膚的NT 累積釋放率已高于60%。并且，在2 h 后基本釋放完全，3 h 基本達(dá)到最大值95%。

圖2 DMN-NT 累積滲透曲線

3.4 藥效學(xué)

3.4.1 醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 如表3 所示，與NS 組比較，NT 組及DMN-NT 組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的扭體次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。1 h 時(shí)，DMN-NT 組小鼠的扭體次數(shù)顯著高于NT 組（P＜0.01）；4 h 時(shí)，DMNNT 組的扭體次數(shù)顯著低于NT 組（P＜0.01）。

表3 各組小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果比較（次，±s）

表3 各組小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果比較（次，±s）

注：NS 為生理鹽水；NT 為神經(jīng)毒素；DMN-NT 為載神經(jīng)毒素的可溶性微針；與NS 組比較，aP＜0.01；與NT 組比較，bP＜0.01

組別NS 組NT 組DMN-NT 組鼠數(shù)666 1 h 60.12±9.06 30.13±2.91a 37.38±3.56ab 4 h 60.25±8.96 39.64±3.52a 33.15±3.18ab

3.4.2 熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 結(jié)果如圖3 所示，與NS 組比較，NT 組及DMN-NT 組在給藥后30～480 min 的痛閾均顯著升高（P＜0.01）。但NT 組在30～90 min 的痛閾顯著高于DMN-NT 組，表明肌肉注射的起效時(shí)間比微針透皮快。但在240～480 min，DMN-NT 組的痛閾顯著高于NT 組，顯示微針透皮給藥延長(zhǎng)了NT的作用時(shí)間。

圖3 各組小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果

3.4.3 鼠尾測(cè)痛法鎮(zhèn)痛試驗(yàn) 鼠尾測(cè)痛法結(jié)果（見圖4）與熱板法結(jié)果類似，與NS 組比較，NT 組在30～240 min 的痛閾顯著升高（P＜0.01），DMN-NT 組在給藥后30～480 min 的痛閾顯著升高（P＜0.01）。NT 組在30～90 min 的痛閾顯著高于DMN-NT 組；但在180～480 min，DMN-NT 組的痛閾顯著高于NT 組，再次驗(yàn)證了NT 經(jīng)DMN 封裝后透皮給藥延長(zhǎng)了NT 的作用時(shí)間。

圖4 各組小鼠鼠尾測(cè)痛法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果

4 討 論

NT 主要通過(guò)與膽堿能受體結(jié)合，發(fā)揮鎮(zhèn)痛療效，但其對(duì)外周也具有明顯的鎮(zhèn)痛作用[1]。目前NT 臨床制劑主要采用肌肉注射給藥，造成患者注射部位的疼痛；而慢性疼痛的反復(fù)注射更降低了患者依從性，在有替代藥物時(shí)，不作為優(yōu)先考慮，限制了其臨床應(yīng)用。DMN 以穿刺形式在角質(zhì)層形成通道；DMN隨后接觸組織液，針體在皮膚中逐步溶解，釋放包封在針體的藥物并發(fā)揮療效[5-6]。即使是分子量在6900左右的NT 也能通過(guò)DMN 實(shí)現(xiàn)透皮遞藥。

DMN 主要由高水溶性的生物相容性材料構(gòu)成。與其他類型的微針（例如固體、水凝膠、包被的和空心的微針）比較，DMN 不會(huì)在皮膚上留下生物危害殘留物[8-9]。HA 是一種廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)的黏多糖，具備優(yōu)越的生物相容性及生物可降解性[10]。HA無(wú)免疫原性，在潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合、調(diào)節(jié)血管通透性、抑制炎癥等生理功能方面具有重要意義[11]。因此，以HA 作為微針材料，不僅保證了生物安全性，還可加速皮膚微孔道愈合[12]。由于皮膚的彈性與異質(zhì)性，微針針頭應(yīng)具備極佳的成形性與機(jī)械強(qiáng)度以確保能順利穿過(guò)角質(zhì)層且不變形[6]。HA 的濃度直接影響到DMN 機(jī)械強(qiáng)度，本研究考察不同濃度HA 制備得到DMN 的機(jī)械強(qiáng)度，確定了最佳制備濃度。在前期工作基礎(chǔ)上，我們確定了CMC 作為背襯材料可以保證DMN 柔韌性[7]。制備的DMN 主要為金字塔形，這種結(jié)構(gòu)相對(duì)常見的圓柱狀、圓錐狀微針，針體更為穩(wěn)固，不易在給藥過(guò)程出現(xiàn)斷針等現(xiàn)象[7，13]。微針的載藥量目前仍主要通過(guò)NT 濃度調(diào)節(jié)。本次主要用于ICR 小鼠鎮(zhèn)痛，根據(jù)小鼠常用量（100 μg/kg）及體質(zhì)量（20±2）g 換算的小鼠肌注給藥量應(yīng)為（2.0±0.2）μg。微針給藥類似于皮下注射，給藥量應(yīng)略高于肌注，DMN-NT 最終載藥量為（2.2±0.2）μg，可以滿足小鼠鎮(zhèn)痛給藥劑量。HA 制備的微針初期釋放較慢，這可能是由于微針針體材料釋藥有一個(gè)溶脹-釋放過(guò)程[6，14]。隨后DMN 釋放較快，2 h 基本釋放完畢。DMN釋藥速率與制備材料有關(guān)，如硫酸軟骨素制備的微針在45 min 內(nèi)基本釋藥完全[15]，而PVP 制備的微針相對(duì)釋藥較為持久[7，16]，HA 制備的DMN 釋藥速度相對(duì)較快。

本研究的鎮(zhèn)痛試驗(yàn)從外周鎮(zhèn)痛（醋酸扭體法）和中樞鎮(zhèn)痛（熱板法與鼠尾測(cè)痛法）全面考察DMN-NT的鎮(zhèn)痛作用[17-18]。醋酸扭體研究結(jié)果表明，相比于NT組，小鼠4 h 后扭體次數(shù)明顯下降（P＜0.01），DMNNT 組作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但DMN-NT 組在1 h 時(shí)的藥效不如NT 組（P＜0.01），表明DMN 透皮給藥起效時(shí)間久于肌肉注射。熱板法中，30～90 min NT 組小鼠痛閾明顯高于DMN-NT 組（P＜0.01）；而在240～480min，DMN-NT 組痛閾明顯高于NT 組（P＜0.01），DMN 的緩釋作用使其鎮(zhèn)痛作用延長(zhǎng)。但NT 組的最高痛閾較DMN-NT 組高，表明肌肉注射在初期起效劑量更多，DMN-NT 釋放持續(xù)而緩慢。鼠尾測(cè)痛試驗(yàn)顯示，NT組與DMN-NT 組相較NS 組也均展現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)痛作用，但在具體時(shí)間上有所差異，總體趨勢(shì)結(jié)果與熱板法類似。

綜上所述，NT 經(jīng)DMN 負(fù)載后可以實(shí)現(xiàn)無(wú)痛透皮給藥；相比于肌肉注射，DMN-NT 可以提高患者依從，在不改變鎮(zhèn)痛效果的情況下，延長(zhǎng)鎮(zhèn)痛作用時(shí)間。